02bisAdenovirus

Adenovirus
Adenovirus
• Virus che infettano svariate specie e
tessuti
• Isolati per la prima volta nel 1953 da
tessuto di adenoidi umane messe in
coltura
Classificazione
Famiglia Adenoviridae, genus Mastadenovirus
51 sierotipi isolati dall’uomo
Adenoviruses sono ulteriormente classificati in 6 sottogruppi
(A -F), in base alle proprietà emagglutinanti e alla omologia
di DNA
Patologie respiratorie: Sottogruppi B1,C,E
Patologie oculari: Sottogruppi B,D,E
Patologie intestinali (enteriti): Sottogruppo F (Sierotipi 40,
41)
Patologie renali e urinarie: Sottogruppo B2
ADENOVIRUS
Struttura
Virus senza envelope
Capside icosaedrico 70-90 nm
Genoma: DNA lineare a doppia elica
Capside
252 capsomeri: 240 esoni, 12 pentoni
La fibra (IV) media il contatto con il recettore cellulare,
protrudendo dal pentone (III)
Pentoni (III) ed esoni (II)
Proteine minori del capside (VI, VIII, IX)
Core
V, VII, Mu, IVa2, TP (terminal protein) associate al DNA virale
Proteasi importante per l’assemblaggio
STRUTTURA
capside costituito da 252 capsomeri di cui 240
esoni (trimero prot II + VI, VIII e IX) e 12
pentoni (pentamero prot III + 5 prot IIIa)
core contiene almeno 4 proteine (TP, V, VII,
Mu)
ESONI: Determinanti antigenici
PENTONI: Attività tossina-simile
FIBRE (trimeri proteina IV):
mediano il riconoscimento dei
recettori sulla superficie delle
cellule permissive (CAR, integrine);
sono responsabili
dell’emoagglutinazione
Adenovirus
recettori principali
• Sottogruppo A (12,18,31)— proteina CAR (membro della
superfamiglia delle Ig), funzione ignota, presente su
molti tipi cellulari
• Sottogruppo B
– B1 (3,7,16,21,50) –CD46 (proteina regolatoria nel
sistema del complemento), CD80, CD86
– B2 (11,14,34,35)
• Sottogruppo C—CAR
• Sottogruppo D—acido sialico
Altre molecole importanti
1) Le fibre si legano ai due al recettore
primario: ex a CAR (coxackie/adenoviral
receptor)
2) I motivi RGD presenti nel pentone si
legano alle integrine avb3 e avb5
Ciclo replicativo
FASI del CICLO VITALE DI ADENOVIRUS
- Avviene nel nucleo delle cellule permissive (cellule di origine epiteliale),
il ciclo ha una durata di circa 32-36 ore (ciclo litico)
- Un unico ciclo di replicazione è in grado di generare 10.000 virioni per
cellula infettata;
2° fase 1° fase
Fase di ingresso nella cellula
ADESIONE E ASSORBIMENTO
CAR è una proteina di adesione che è espressa ad alti livelli:
- fegato, rene, cuore, cervello, pancreas, colon, prostata, endotelio
CAR non è espressa in:
- linfociti periferici, milza, muscolo scheletrico e fibroblasti
• Adenovirus del gruppo B riconoscono un recettore diverso dal CAR (CD46)
• Adenovirus di tipo 5 riconosce come recettore anche il dominio α2 del MHC di tipo I
• Alcuni tumori in stadio avanzato perdono l’espressione del CAR (es. ovarico, colon...)
• Un dominio RGD esposto in un loop dei pentoni promuove l’interazione con le integrine
promuovendo l’endocitosi
• Il colesterolo gioca un ruolo nell’uptake virale e fuoriuscita dall’endosoma
Penetrazione nella
cellula
Ingresso mediato da endocitosi
dipendente/pH dipendente
clatrina-
Perdita delle fibre
Lisi della membrana degli endosomi
mediato dalla proteina della base dei
pentoni
A
livello dei pori nucleari la struttura
capsidica subisce un disassemblaggio
parziale :
- perdita dei pentoni III e della
proteina IIIa
- dissociazione della proteina VIII
- degradazione proteolitica
della
proteina
VI da parte della proteasi
presente nel virione
- perdita della proteina IX
pH
Genoma degli adenovirus
• Il genoma è costituito da una molecola di DNA lineare a doppia
elica di 30-40 kb, a seconda del gruppo preso in analisi.
• Alle estremità sono presenti le sequenze ITRs, inverted terminal
repeats, che fungono da origini di replicazione e da promotori per
alcuni geni.
• Vicino alla ITRs in 5’ vi è la sequenza segnale (sequenza Ψ) per
l’inserimento del genoma all’interno del virione.
• I geni vengono espressi con una precisa sequenza temporale
(immediate-early, early, late genes).
 I geni immediate-early sono E1A e E1B e servono ad
innescare la replicazione nella cellula ospite.
 I geni early servono per la replicazione del genoma virale
 I geni late sono geni strutturali
Il GENOMA degli ADENOVIRUS
(ds DNA: 30-36 Kb)
ITR
SEQUENZE ITR (100bp)
regione ORI (replicazione del genoma)
regioni di controllo trascrizionale
siti di legame per fattori trascrizionali e proteine enhancer
cellulari : NF-I e Oct-I
sequenza di impacchettamento
ITR
Rappresentazione schematica del genoma di adenovirus:
ds DNA lineare di 36 kb
• le regioni da E1 a E4 codificano i geni precoci (early)
• le regioni da L1 a L5 codificano i geni tardivi (late)
Trascrizione bidirezionale mediata da RNA pol-II, si ottengono diversi
mRNA grazie all’uso di diversi siti poli-A o per splicing alternativo
Rappresentazione schematica deli trascritti virali
Trascrizione bidirezionale mediata da RNA pol-II, si ottengono diversi
mRNA grazie all’uso di diversi siti poli-A o per splicing alternativo
ESPRESSIONE GENICA degli ADENOVIRUS
geni precoci
geni tardivi
E- geni precoci
L- geni tardivi
50 proteine
Regione E1:
orientamento
- Indurre la cellula ospite ad entrare nella fase S del ciclo cellulare
- Sintetizzare i prodotti dei geni virali necessari per la replicazione del DNA virale
- Down regola l’espressione dell’MHC I (effetto immuno regolatore)
L’espressione di E1A fa
sfuggire al normale controllo da
parte dell’interazione pRb-E2F
Co-immunoprecipitazione di numerose
proteine cellulari con la proteina E1A
Regione E2
orientamento
suddivisa in 2 regioni trascrizionali
separate: E2A ed E2B.
la regione E2A codifica una proteina che lega ssDNA (DBP), altamente
fosforilata nella regione N-terminale e richiesta per la replicazione del
DNA: probabilmente funziona come  fattore di regolazione della
trascrizione.
la regione E2B codifica un precursore della proteina TP (80kDa) che
viene convertita in una proteina di 55 kDa durante l’assemblaggio virale.
Questa regione codifica anche una DNA polimerasi di 240kDa.
Regione E3 (“cell death protein”)
 codifica prodotti genici antiapoptotici e inibisce l’espressione di MHC
 facilita il rilascio delle particelle virali dalle cellule infettate,
 riduce la produzione di linfociti T citotossici
E3
orientamento
Promuove il
rilascio del virus
Funzione
Funzione
sconosciuta
Sconosciuta
Inibisce l’apoptosi
Lega l’ MHC I
Inibisce la trascrizione
Inibisce l’apoptosi regolata
da TNFa
Agisce su NF-KB
Regione E4
(modula il metabolismo dell’ospite!)
orientamento
 stimola lo sviluppo di una risposta umorale :
aumentando IL6 e IL8 per la maturazione delle cellule B
 modula l’attività di trascrizione del virus
 inibisce la sintesi proteica dell’ospite.
Modula
l’attività di E2F
Funzione
sconosciuta
Interagisce con E1B
55K agevolando la
produzione degli
mRNA
Interagisce
con E1B 55K
Inibisce l’attivazione di
E2F mediata da E1A
Facilita la
trasformazione
Replicazione del genoma
La replicazione del DNA avviene grazie all’intervento di
pTP, polimerasi virale, DBP che interagiscono con altre
proteine cellulari
Entrambe le estremità del genoma fungono da origini
Protein priming and strand displacement model
ESPRESSIONE DEI GENI TARDIVI
ITR
E1A/B
VA
E2A/B
E3
L1 L2 L3 L4
E4
ITR
L5
unico trascritto viene processato per formare circa 18 mRNA con
estremità 5’ identiche, divisi nei 5 gruppi L
proteine strutturali
proteine scaffold
proteasi
MLTF
E1A
promotore MLP
52 kd
IVa
L1
L2
L3
L4
L5
GENI TARDIVI
Proteine tardive = componenti strutturali del virione
 I geni tardivi sono trascritti a partire da un major late promoter (MLP)
 A partire da un trascritto primario di 29.000 nucleotidi, circa 18 specie di mRNA
sono prodotte in seguito a splicing alternativi, tali mRNA sono stati raggruppati in 5
famiglie classificate da L1 a L5 che hanno porzioni 5’ variabili
 Altri RNA (VA) vengono generati dalla polimerasi III e si possono attribuire
diverse funzioni a questi RNA:
- regolazione degli splicing degli mRNA tardivi
- controllo degli stadi della migrazione dei peptidi tardivi
- inibizione degli effetti dell’INF mediante blocco del
legame dei dsRNA alle proteine chinasi cellulari
Rappresentazione di un modello delle strutture
secondarie (dsRNA) che si generano a livello
dell’Ad-tipo2
Assemblaggio degli adenovirus
proteine
singole
(no poliproteina)
ruolo critico della
proteina L1
(funzione scaffold ?)
citoplasma
- formazione dei trimeri
di proteina II (esoni).
Funzione
essenziale
della proteina L4.
nucleo
- formazione dei pentameri
di proteina III (pentoni)
- formazione dei trimeri di
proteina IV (fibre)
formazione di capsidi vuoti
RILASCIO DEL
VIRUS
disaggregazione del citoscheletro della cellula ospite (L3 proteasi)
E3 - death protein (meccanismo sconosciuto)
REPLICAZIONE E PATOGENESI
Infezione delle cellule mucoepiteliali a livello del sito di
ingresso ovvero della congiuntiva, del tratto respiratorio,
gastrointestinale e genitourinario.
Replicazione del DNA genomico intranucleare
Fasi di replicazione precoci e tardive a cui segue
l’assemblaggio e il rilascio dei virioni
Danno diretto cellule mucoepiteliali ( tratto respiratorio,
gastrointestinale, congiuntiva)
ADENOVIRUS
INFEZIONE
Tre tipi di infezione:
• Litica – cellule mucoepiteliali, porta alla
morte cellulare
– Produzione di 10.000-1X106 virioni/cellula
– 1-5% dei virioni sono infettivi
• Latente / persistente – il virus permane in
tonsille, adenoidi, placche di Peyers
– Scarsa produzione virale
ADENOVIRUS
INFEZIONE
• Trasformazione oncogenica – crescita
cellulare e replicazione senza morte
cellulare.
Integrazione del DNA
Espressione costitutiva di geni E1AE1B (importanti per immortalizzazione
cellulare; inattivazione p53, Rb)
Patogenesi
• Molto diffusi
• Virus citolitici per effetto di accumulo dei
virioni nel nucleo e per l’effetto citotossico di
E3 (death protein)
• Infezioni acute del tratto respiratorio e in
misura minore gastro-intestinale, possono
dare cistiti emorragiche, miocarditi e
cheratocongiuntiviti
• Molte infezioni sono subcliniche
ONCOGENESI
Soltanto alcuni sottogruppi di adenovirus possono indurre direttamente la
formazione di masse tumorali nel topo:
Adenovirus del gruppo A (Ad12, Ad18,..) sono altamente oncogenici, e
producono il tumore nella quasi totalità dei topi nell’arco di 4 mesi;
Adenovirus del gruppo B (Ad3, Ad7,..) sono debolmente oncogenici,
inducono il tumore in 4-18 mesi.
Adenovirus del gruppo C e E non sono stati mai visti implicati nella
induzione di tumori nell’animale.
MECCANISMO DI
TRASFORMAZIONE
CAR
integrine
E1A
pRB
geni proliferativi
E1A
E1B
IB
NF-B
19kd
risposta
innata
E1B
55kd
p53
geni pro-apoptotici
ADENOVIRUS
TRASMISSIONE
•
•
•
•
•
•
•
Aerosol
Contatto diretto
Oro-fecale
Eliminazione intermittente
Aree affollate
Diffusione mondiale
Diffusione interumana
ADENOVIRUS
INFEZIONE
• Adenovirus replica nei tessuti linfoideassociati, la viremia puo’ causare
infezione secondaria in organi viscerali.
• La replicazione del virus causa un
eccesso di componenti antigeniche
liberate nel sovranatante come antigeni
solubili. Colorazione basofila intranucleare corpi inclusi nelle cellule.
Adenovirus
Immunita’
• Infezioni controllate dalla risposta
immunitaria
• Risposta anticorpale e T cellulare
Manifestazioni cliniche
Infezioni subcliniche nella maggior parte dei casi
Infezione primaria avviene nell’infanzia
Tipi 1,2,5,6 tipicamente isolati dal tessuto
adenoide o tonsille dei bambini
Isolato dalle feci
5% malattie neonato, 3 % tra i 2-4 anni di vita
Frequente nelle caserme
Manifestazioni cliniche
•Patologie respiratorie:
Riniti, faringiti (con o senza febbre), tonsilliti,
bronchiti, pertosse-simile, polmoniti
•Patologia oculare:
cherato-congiuntiviti
•Patologie renali e urinarie:
cistite emorragica, orchite, nefrite
Manifestazioni cliniche
•Patologia intestinale (gastroenteriti):
diarrea per periodo più lungo che con altre
infezioni virali, adeniti mesenteriche, epatiti,
appendiciti (sierotipi 40,41,42)
•Patologie più rare nell’individuo
immunocompetente: Meningiti, encefaliti,
artriti, rash cutaneo, mioocarditi, pericarditi:
Infezioni molto grave (o riattivazione infezione
latente) in pazienti immunocompromessi
RIASSUMENDO……….
Adenovirus
Diagnosi
Ricerca del virus:
• Metodi immunologici
• Metodi molecolari
• Isolamento colturale
In campioni di sangue, secrezioni, tamponi
nasali, tamponi oculari, feci, urine,
liquor….