Cenni di ingegneria genetica

”
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B
l
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e Ca
g
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“
e
CORSO DIPiGENETICA
o
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o rb
t
r
U
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i
b
d
o
INGEGNERIA
GENETICA
R tà
i
s
r
e
v
i
n
U
Tecniche di DNA ricombinante:
”
o
gli enzimi di restrizione
i
B
il
t rlo
n
Le tecniche di base del DNA ricombinante
fanno
prevalentemente
e
a
g “C
uso degli enzimi di restrizione.
r
ie nche
o riconoscono sequenze
Gli enzimi di restrizione sono P
proteine
i e lo tagliano in loro
specifiche (palindromiche) osul DNA
b
t
r
r
corrispondenza su entrambi i filamenti.
U
e
i
b
Si sono evoluti nei batteri
come
difesa contro DNA estraneo (per
d
o
R tà
esempio, quello virale).
i
Dopo il taglio, la molecola
di DNA può avere estremità nette (blunt
s
ro al 5’ (overhangs).
ends) o sfalsate al 3’
e
v libere possono essere riunite grazie alle varie
i
Queste estremità
n
DNA ligasi. U
Tecniche di DNA ricombinante:
”
o
i plasmidi ili
B
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“
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P ino
o rb
t
r
U
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b
d
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R tà
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s
r
e
v
i
n
U
I frammenti ottenuti dopo la digestione con enzimi di restrizione
possono essere ligati all’interno di vettori plasmidici.
I plasmidi sono anelli di DNA, sono presenti soprattutto nei batteri,
NON fanno parte del genoma batterico, ma spesso conferiscono al
batterio che li ospita un vantaggio (resistenza ad antibiotici, a virus,
possibilità di metabolizzare substrati difficili, difesa da agenti
tossici come i metalli pesanti, ecc.).
Fase 1: digestione
”
o
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B
l
i
del DNA
t rlo
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a
g
C
r
“
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i
o
Il numero e la lunghezza deiP
n
i
o rb
frammenti
dipende
dalla
t
r
frequenza della sequenza
sul U
e
i
b sono
DNA (sequenze più o
corte
d
R frequenti),
à
statisticamente più
t
i
secondo la regola 4 .
s
r
e
v
i
Si trattano separatamente
(ma
n
con lo stesso U
enzima) il DNA di
n
interesse e il vettore ricevente.
Fase 2:
ligazione del
DNA
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B
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g
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“
e
i
P ino
o rb
t
EcoRI è uno degli enzimi r
U
e
i
più usati. Deriva da E. coli
b
d
o
(da cui il nome) e riconosce
R tà
l’esamero GAATTC. Dopo ili
s
r
di
taglio lascia un overhang
e
v
5 pb.
i
n
U
”
o
Fase 3:
il clonaggio
in vitro
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B
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“
e
i
Si fa una miscela di
P ino
o rb
DNA da inserire e
t
plasmide ricevente. Tra er
U
i
b
i
vari
prodotti
d
o
Rdel tà
(richiusura
plasmide, ligazione delsi
r
DNA donatore, polimeri
e
v il
i
ibridi) ci sarà anche
n
U
plasmide ricombinante
di interesse.
”
o
Fase 4:
selezione del
plasmide di
interesse
i
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P
n
i
Si usano plasmidi contenenti o
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una o più resistenze aglir
U
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antibiotici; trasfettandob le
d
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cellule batteriche R
con la à
miscela
di
ligazione iet
s
r
piastrandole
su
terreno
e
v
selettivo, solo quelle
i con la
n
resistenza
U potranno
crescere; si seleziona poi il
plasmide ricombinante.
”
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Il polylinker
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Vettori
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genetica: sità
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Gli YACs
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s
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ve
TEL: sequenze itelomeriche;
URA3 : marcatore per selezione; CEN:
n
sequenze centromeriche;
ARS: sequenza di replicazione autonoma;
U
Polycloning site Ÿ qui inserisco il mio gene.
Utilizzo: clonare geni eucariotici (per esempio con introni).
+
Librerie di espressione
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P ino
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Screening di
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una library di
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cDNA
C
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P ino
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b
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Cercando il DNA per ibridazione
in
r
r
U
e è stato
cui
situ in batteri in b
i
d
o
inserito
per
clonazione
il
R
à
t
corrispondente plasmide,
si può
i
s quando il
risalire a come e
r
e
corrispondente iv mRNA
era
espresso; per n
questo si chiamano
U
anche librerie di espressione.
L’elettrofo”
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tresi
l
su
gel
n
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di
agarosio
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b
Esiste una
relazione
logaritmica tra
altezza della
banda e sua
lunghezza
(ovvero peso
molecolare).
La mappa di
restrizione
i
B
l
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n
e Ca
g
Tagliando lo stesso frammento r
“
e
i
di DNA con più enzimi di
P ino
restrizione, singolarmente oe a
b
t
r
coppie, e analizzando rpoi le U
e
i
b
bande ottenute su un gel di
d
o
agarosio, si puòR risalire
alla
à
it nel
disposizione
dei ssiti
r
frammento integroeoriginale.
La
v sia di DNA
i
mappa può essere
n
circolare che
Ulineare.
”
o
La Polymerase
Chain
Reaction
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P ino
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La TAQ polimerasi n
è estratta dal U
Termophilus
aquaticus.
”
o
Genomica e Proteomica
”
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B
l
i
La genomica studia il genoma, cioè
o
t
l
n
il DNA di un organismo, la sua
r
e
a
g “C
composizione e organizzazione.
r
e o
i
P in
La proteomica studia il proteoma,
o
b
t
r
cioè la composizione in proteine
di
r
U
e
una cellula, tessuto, organismo,
e
i
b
d
le loro interazioni. Ro
à
t
i
s è uno (alleli a parte), mentre i proteomi
Per ogni specie, il genoma
r
e
possono essere molti
e variare nello spazio (tessuti diversi) e nel
v
i
tempo (sviluppo n
embrionale), così come in seguito alle interazioni con
U
l’ambiente (risposte ormonali, immunitarie, ecc.).
Lo yeast two hybrid system
”
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P ino
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Se le due proteine di
i
s
fusione interagiscono, allora
r
e
si ricostituisce il fattore di
v
i
n
trascrizione e parte la
U
sintesi del gene reporter.
in condizioni normali
I microarrays a
DNA - 1
i
B
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P ino
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r
Se sul chip sono
r
U
e
presenti tutti i
i
b
d
o
trascritti di un
R tà
organismo
i
s
(trascrittoma) si
r
e
può vedere quali
v
geni sono attivi n
ini
un certo momento.
U
”
o
I microarrays a DNA - 2
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i
s
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v
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U
In base
all’intensità
dell’ibridazione
è anche
possibile fare
una stima
quantitativa
dell’espressione
di un certo gene
in tessuti o
momenti diversi
rispetto ad un
controllo.
”
o
I microarray
a proteine
”
Analytical
versus
functional
protein
microarrays. a, Analytical protein microarray.
Different types of ligands, including antibodies,
antigens, DNA or RNA aptamers, carbohydrates
or small molecules, with high affinity and
specificity, are spotted down onto a derivatized
surface. These chips can be used for monitoring
protein expression level, protein profiling and
clinical diagnostics. Similar to the procedure in
DNA microarray experiments, protein samples
from two biological states to be compared are
separately labelled with red or green
fluorescent dyes, mixed, and incubated with the
chips. Spots in red or green colour identify an
excess of proteins from one state over the
other. b, Functional protein microarray. Native
proteins or peptides are individually purified or
synthesized using high-throughput approaches
and arrayed onto a suitable surface to form the functional protein microarrays. These
chips are used to analyse protein activities, binding properties and post-translational
modifications. With the proper detection method, functional protein microarrays can be
used to identify the substrates of enzymes of interest. Consequently, this class of chips
is particularly useful in drug and drug-target identification and in building biological
networks. [Nature 422, 208 - 215 (13 March 2003)]
o
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