Enzimi di restrizione per l`impronta genica

Gianluca Bee – Luca Bonazzi
Chiara Maselli – Giacomo Taddei
Classe 1° G P.A.S.
Liceo Maffei – Verona
A.S. 2015/2016
Identificano specifiche
sequenze di 4/8 basi
(siti di riconoscimento)
e tagliano in quel punto
Possono essere inibiti da
gruppi metili (-CH3): in
questo modo, solo il DNA
estraneo è aggredito
Premio Nobel per
la Medicina 1978
Arber
Nathans
Smith
Ne conosciamo circa 3000
Agiscono su ogni organismo
con idrolisi dei legami idrogeno
Endonucleasi
taglia legami
interni al DNA
Esonucleasi
taglia segmenti
terminali di DNA
Plasmide o Gene
5’…AAGCTT…3’
3’…TTCGAA…5
Plasmide o Gene
Plasmide o Gene
5’…A|AGCTT…3’
3’…TTCGA|A…5’
Plasmide o Gene
Plasmide
5’…A|GCTT…3’
3’…TCGA|A…5’
Gene
• I siti di
riconoscimento
sono perlopiù
palindromi
Vettore
molecolare
Inserzione
del gene
• Molto spesso,
tagli sfasati,
con estremità
quindi «appiccicose»
Batterio
ospite
• Tagliati dallo
stesso enzima,
essi sono complementari
DNA
ligasi
(legame
idrogeno)
Copia del
plasmide
Gene in
molte copie
VNTR
STR
RFLP
> Variable Number Tandem Repeats
> Short Tandem Repeats
> Polimorfiscmo della lunghezza
dei frammenti di restrizione
• Soluzione acquosa
con cloroformio
e fenolo (pH 7,8)
• Centrifugazione:
precipitazione
della proteina
di membrana
• Il DNA entra in
fase acquosa
Estrazione
Digestione
• Endonucleasi
batterica di
restrizione
• Frammenti di
1000-20000
nucleotidi con
microsatelliti
unici (non
codificanti)
• Pellicola con
gel di agarosio
(20 ore, pH 7)
• Corrente elettrica
(carica negativa
per via del pH)
• Effetto setaccio
del gel sul DNA
verso l’anodo
Elettroforesi
> Confronto a un locus
> Confronto pluri-locus
Precisione inversamente
proporzionale a quantità
di materiale necessario
• Immersione in
sol. alcalina
• Riduzione a un
solo filamento
dei frammenti
Denaturazione
Incubazione
• Produzione di una
sonda radioattiva
(marcata con 32P)
o fluorescente
• Legame tra sonda
e frammento
• I legami sono
visualizzati dalle
tracce lasciate su
una pellicola a
raggi X, sviluppata
Visualizzazione
Progettare
trapianti
Test di
paternità
Identificare
criminali
(stupratori)
Programmi di
salvaguardia
specie a rischio
d’estinzione
Sperma
Capelli
Saliva
Sangue
Alec Jeffreys fu il primo ad
adoperare una DNA fingerprint (trad. lett, impronta
digitale del DNA) nel 1985
> Presenza in situ di DNA
batterico e fungino
> Decadenza dei siti di
restrizione nel DNA
> Coloranti e contaminanti
> Banche dati: rischi per la privacy
> Come evitare gli errori umani?
> Il risultato è davvero univoco?
> Discriminazione economica
> Presunzione d’innocenza
> Parzialità delle perizie