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La regolazione dell’espressione genica
Quali sono i meccanismi che determinano
l’accensione o lo spegnimento dell’espressione
di un gene?
La regolazione dell’espressione genica
• Nei procarioti:
– un’espressione genica selettiva permette alle
cellule di risparmiare energia
– La regolazione avviene prevalentemente a
livello trascrizionale
• Negli eucarioti:
– l’espressione genica selettiva permette alle
cellule di svolgere ruoli specializzati
– La regolazione avviene a vari livelli
Regolazione genica nei procarioti
• Geni costitutivi: sono costantemente attivi
(es. geni che codificano per gli enzimi della
glicolisi)
• Geni regolati: la loro espressione è regolata
in modo tale che che la quantità del
corrispondente prodotto (proteina o RNA) è
controllata in relazione al fabbisogno
cellulare (es. sintesi adattativa di enzimi)
NON TUTTI I GENI VENGONO UTILIZZATI NELLO STESSO
MOMENTO E NON TUTTI CON LA STESSA “INTENSITÀ”
Regolazione genica = la modalità con cui viene REGOLATA la
tipologia e la quantità dei prodotti genici
Prodotto genico = RNA e/o proteina (in ultima analisi)
Regolazione Genica nei Procarioti
Finalità:
Rispondere rapidamente ai cambiamenti ambientali
Logica:
Risparmiare energia; niente mRNA o proteine che non
servano subito
Base fisiologica:
la maggior parte dei geni è espressa costitutivamente
pochi geni sono regolati, ognuno con il suo meccanismo
individuale, di induzione o di repressione
I geni strutturali dei batteri sono organizzati in
“cluster” : gruppi di geni codificanti per proteine
con funzioni correlate, (es. enzimi di una stessa
via metabolica, proteine deputate al trasporto
intracellulare ecc), che si trovano sotto il dominio
di un unico promotore.
OPERONE
Unità di trascrizione descritta nel 1961 da François Jacob e
Jacques Monod, che per questo furono insigniti del premio
Nobel.
L’unità completa include:
• Geni strutturali: codificano per le proteine di interesse
• Operatore: Sito sul DNA riconosciuto dalla proteina
repressore
• Promotore: Sito sul DNA cui si lega l’RNA polimerasi
per iniziare la trascrizione dei geni situati a valle
Sono proteine
RNA
polimerasi
Promotore
La capacità dell’RNA polimerasi di
iniziare la trascrizione dipende
dall’assenza di impedimenti a livello del
promotore; possono essere presenti dei
repressori che impediscono l’inizio della
trascrizione.
Si parla di regolazione negativa
Repressore
Operatore
Gene 1
Gene 2
Sono sequenze di DNA
Gene 3
Il repressore inattivo non si lega all’operatore. La RNA polimerasi
può eseguire la trascrizione.
Repressore
Promotore
Operatore
Gene 1
Gene 2
Gene 3
Proteina 1
Proteina 2
Proteina 3
N.B.: il sito operatore non viene trascritto e non codifica per nessuna proteina
Il repressore attivo si lega all’operatore. La RNA polimerasi
NON può eseguire la trascrizione.
Promotore
Operatore
Gene 1
Gene 2
Gene 3
Da dove viene il repressore ?
• La trascrizione dei geni strutturali è spesso
controllata dall’attività di un altro gene, detto
REGOLATORE
• Il gene regolatore codifica per la proteina
repressore, che si lega in maniera specifica
all’operatore di un operone
• Il gene regolatore può trovarsi in qualsiasi punto
del DNA batterico, non necessariamente adiacente
all’operone
RNA
polimerasi
Regolatore
Promotore
Repressore
Operatore
Geni
Facciamo un esempio:
Escherichia Coli
Per trasformare l’ALLOLATTOSIO in glucosio da utilizzare
come fonte di energia sono necessari tre enzimi, codificati
da tre geni appartenenti allo stesso operone (lac)
Per sintetizzare il TRIPTOFANO servono cinque
enzimi, codificati da cinque geni appartenenti allo stesso
operone (trp)
I batteri utilizzano strategie diverse per
regolare la sintesi degli enzimi
• Vie cataboliche e induzione da substrato
• Vie anaboliche e repressione da prodotto finale
Gli enzimi che catalizzano queste vie sono spesso regolati
in modo coordinato: la sintesi di tutti gli enzimi coinvolti
in una particolare via viene attivata o repressa
simultaneamente
Operone lac:
Induttore
Repressore inattivo
Si tratta di una VIA
CATABOLICA,
normalmente inattiva (non
espressa), che viene
attivata (INDOTTA) dalla
presenza della molecola da
degradare (il lattosio)
OPERONE TRP:
Repressore inattivo
Corepressore + repressore
Si tratta di una VIA
ANABOLICA, normalmente
attiva (espressa), che viene
inattivata o REPRESSA dalla
presenza della molecola (il
triptofano) che si forma per
effetto delle attività
enzimatiche.
Operone lattosio (lac)
Operone triptofano (trp)
Geni inducibili
Geni reprimibili
DOMANDA CHIAVE
Cosa permette al repressore di
attaccarsi o meno al sito operatore ?
Effettore
E’ una molecola che si lega in
maniera specifica al repressore.
Questo legame può rendere
attivo o inattivo il repressore.
Si lega all’operatore
Trascrizione impedita
Trascrizione impedita
Si lega all’operatore
In base all’effetto che il complesso
EFFETTORE-REPRESSORE produce
sulla trascrizione si possono distinguere:
• geni inducibili
• geni reprimibili
Caratteristiche comuni ai due processi
1. Il controllo è effettuato a livello genomico
2. Il controllo viene indotto da piccole
molecole (effettori) che modificano la
conformazione di molecole che
controllano l’espressione genica
Per le vie cataboliche i substrati (lattosio)
Per le vie anaboliche i prodotti finali (triptofano)
I geni coinvolti nel catabolismo del lattosio sono
organizzati in un operone inducibile
La delezione del gene lac I origina cellule che producono sempre
le tre proteine indipendentemente dalla presenza dell’induttore
Lac I codifica per un repressore
Gli operoni lac e trp spiegano
il controllo negativo della trascrizione
• Per le vie cataboliche la forma attiva del
repressore (che si lega al DNA) è rappresentata
dalla proteina repressore libera dall’effettore
• Per le vie anaboliche la forma attiva è quella della
proteina repressore legata all’effettore che in
questo caso può definirsi corepressore
In entrambi i casi il risultato è lo stesso: il repressore
attivo previene la trascrizione dell’operone bloccando il
legame della RNA polimerasi al DNA
Il repressore lac si lega ai due
operatori come tetramero
• L’ansa si forma tra le repressore legato all'operatore principale e
quello a monte, ausiliario a 90 bp. Un'ansa del tutto simile si
può formare in alternativa con un operatore a valle, a 400 bp
Operone del triptofano
• l'operone
triptofano di E.coli
codifica per il
leader e per geni
strutturali che
codificano gli
enzimi trp
La attenuazione
• Anche con basso Trp molti tradotti terminano
prematuramente, prima del gene trpE. Solo la
sequenza leader viene tradotta. Essa è seguita
da un terminatore
• Ci sono 4 sequenze complementari nel
mRNA 1, 2, 3 e 4. Esse si possono appaiare
diversamente
• L’RNA ha una ORF di 14 amino acidi, con
una forte RBS e che codifica per 2 trp.
In condizioni di elevata concentrazione di triptofano la sequenza 3 si appaia con la
sequenza 4 costituendo la hairpin di terminazione della traduzione.
In condizioni di bassa concentrazione di triptofano il ribosoma si blocca sugli
adiacenti codoni per il triptofano permettendo alla sequenza 2 di appaiarsi con la 3 e
quindi impedendo la formazione della forcine di terminazione 3 e 4. Quindi la
traduzione può continuare
In assenza di sintesi proteica poiché il ribosoma non inizia la traduzione della AUG
del peptide leader si forma una forcina appaiando le sequenze 1 e 2 e quindi non si
forma quella data dalle sequenze 2 e 3 ne consegue che si forma una forcina con le
sequenza 3 4 e gli enzimi per trp non sono espressi
Differenze della regolazione
genica fra procarioti ed eucarioti
•
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•
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•
•
•
Dimensione e complessità del genoma
Compartimentazione del genoma
Organizzazione strutturale del genoma
Stabilità dell’mRNA
Modificazione post-traduzionale delle proteine
Turnover delle proteine
Le cellule eucariotiche sono prive di operoni!
Livelli multipli di
regolazione
dell’espressione genica
degli eucarioti
I meccanismi di controllo usati per regolare
l’espressione dei geni umani devono essere
molto più complessi da quelli utilizzati dagli
altri organismi.
•Regolazione trascrizionale
•Regolazione post-trascrizionale
•Meccanismi epigenetici e controllo
dell’espressione genica a lunga
distanza
Cellula umana contiene circa 30000 geni
RNA genes
Geni per proteine
Ogni cellula in un determinato momento esprime solo una piccola parte
di questo potenziale (˜ 5000 geni)
Geni housekeeping
metabolismo
biosintesi
membrana
istoni
ribosomali
Geni tessuto - specifici
DIFFERENZIAMENTO
CELLULARE
A QUESTA ESPRESSIONE SELETTIVA NON CORRISPONDE (IN GENERE)
UNA VARIAZIONE DEL CONTENUTO DI DNA
Esistono molteplici livelli di regolazione
dell’espressione genica negli eucarioti
Meccanismi epigenetici: controllo a lungo
DNA
NUCLEO
raggio mediante rimodellamento della struttura
della cromatina
controllo trascrizionale: legame di
fattori trascrizionali tessuto specifici,
legame diretto di ormoni, fattori di
crescita o elementi intermedi a elementi
risponsivi di geni inducibili
Trascritto primario
(precursore)
controllo post-trascrizionale: splicing
alternativo, polyA alternativo, RNA editing tessutospecifico
mRNA
controllo del trasporto
CITOPLASMA
mRNA
controllo
traduzionale
traduzione
controllo della stabilità
degradazione
PROTEINA
controllo post-traduzionale
PROTEINA attiva o inattiva
CROMATINA
•EUCROMATINA -> TRASCRIZIONE POTENZIALE
a) geni housekeeping
b) geni tessuto-specifici
•ETEROCROMATINA FACOLTATIVA -> inattiva quando condensata.
Fornisce un meccanismo di compensazione:
rapporto geni autosomici/geni X-linked
maschi = 2/1
donne = 1/1
•ETEROCROMATINA COSTITUTIVA ->
sempre inattiva; Localizzata nelle regioni
peri - e centromeriche
Meccanismi epigenetici
Fattori che vengono trasmessi alla progenie, ma che non
sono direttamente attribuibili alla sequenza del DNA.
•Metilazione del DNA;
Nelle cellule eucariotiche la metilazione è a carico della C.
Solo il 3% delle C sono metilate ed in genere è bersaglio
della metilazione la C della doppietta CpG.
•Modificazioni degli istoni;
Acetilazioni, fosforilazioni e metilazioni, responsabili di
cambiamenti conformazionali della cromatina.
Modificazioni epigenetiche:
• Modificazioni ereditabili che non alterano
la sequenza nucleotidica dei geni ma ne
alterano l’attivita’:
– Acetilazione degli istoni della cromatina
– Metilazione del DNA
Meccanismi epigenetici: Metilazione del DNA
La metilazione del DNA è un processo post-replicativo. L’estensione delle modificazioni
riguardanti la metilazione del DNA è fondamentalmente decisa durante lo sviluppo. La
metilazione del DNA è quindi uno dei meccanismi correlati con il differenziamento cellulare,
tramite l’inibizione dell’espressione genica a livello trascrizionale.
Metilazione del DNA
Human Molecular Genetics 2
Le principali funzioni della
metilazione sono collegate alla
repressione della trascrizione:
• Difesa contro i trasposoni: la metilazione e’
fondamentale per mantenere silenti i genomi dei
trasposoni e dei retrotrasposoni
• Regolazione genica: la metilazione contribuisce a
stabilire e mantenere uno stato trascrizionalmente
inattivo (eterocromatina)
Metilazione e regolazione genica:
• Dnmt metilano il DNA
• Il DNA metilato è legato da proteine che legano il
metile
(MeCP2, MBD1-4)
• Queste a loro volta sono in grado di reclutare
diversi HDAC -> repressione della trascrizione
Modificazioni degli istoni H3 e H4
La lisina 9 di H3 può essere sia acetilata che metilata.
L’acetilazione è associata alla cromatina trascrizionalmente
attiva, ma se la regione cromatinica viene metilata a livello
del DNA (CpG), le proteine che si legano al DNA metilato
richiamano le deacetilasi istoniche, che rimuovono i gruppi
acetile e le metil transferasi istoniche, legate alle CpG
binding protein, metilano gli istoni. Il risultato è la
condensazione della cromatina.
CARATTERISTICHE DELLA
CROMATINA
Caratteristica
Cromatina
attiva
Cromatina
inattiva
Conformazione Estesa, aperta
della cromatina
Condensata
Metilazione del Poco metilata
DNA
specialmente
nelle regioni
del promotore
Acetilazione
Istoni acetilati
degli istoni
Metilata
Istoni non
acetilati
Repressori e attivatori possono dirigere la
deacetilazione/acetilazione degli istoni a
livello di specifici geni
Importanza della struttura modulare
e delle interazioni proteina-proteina
• Una serie di fattori trascrizionali deve legarsi al
promotore prima che possa farlo la RNA
polimerasi. Quindi se la RNA polimerasi potrà
iniziare la trascrizione dipenderà anche dal legame
di proteine regolatorie, attivatori e repressori.
Elementi distali
Elementi
prossimali
Promotore
basale
Il controllo dell’espressione genica è intrinsecamente rumoroso
Coda di poliA negli oociti
Micro RNA (miRNA)
• Piccole molecole di RNA (20-22 nt)
• Prodotte da precursori di 90-100 nt trascritti
autonomamente (anche policistronici) o maturati
da introni
• Si legano a mRNA che hanno sequenze
complementari
• Presenti in tutti gli eucarioti
74
miRNA
• miRNA lin4 e let7 sono stati scoperti
inizialmente nei nematodi
• sono conservati dai vermi fino all’uomo
• la loro funzione è il controllo della
TRADUZIONE di specifici mRNA
• funzionano come MODULATORI
Conservazione dei miRNA
Biogenesi dei microRNA
I microRNA sono
molecole, dalla
lunghezza di 21-25
nucleotidi, che regolano
l’espressione dei geni a
livello posttrascrizionale
Biogenesi dei miRNA nelle piante e
negli animali
Funzione dei miRNA
•
•
•
•
Controllo della proliferazione cellulare
Controllo della apoptosi
Differenziamento ematopoietico
Controllo dello sviluppo in piante ed
animali
• Controllo della identità cellulare delle
cellule staminali
I geni per i microRNA sono molto
abbondanti
• più di 100 in Arabidopsis
• tra 700 e 1000 nell’uomo
Meccanismi del funzionamento di
miRNA in piante
• MicroRNA portano al taglio e degradazione
di mRNA
• La gran parte dei bersagli dei miRNA nelle
piante codifica per proteine regolatrici
suggerendo che i miRNA hanno una funzione
gerarchicamente molto elevata
• miRNA coinvolti nello sviluppo e nell’identità
delle cellule staminali
FUNZIONI FISIOLOGICHE DEI miRNA
Mantenimento dell’identità cellulare (es. pluripotenza)
L’identità cellulare viene mantenuta silenziando mRNAs che
non appartengono allo specifico repertorio della cellula
Network di miRNA che controllano specifici pathway (miR21 regola miRNA che controllano apoptosi: disregolazione di
miR-21 cancro. miRNA che controllano la via di segnale
dell’insulina, diverse tipologie cellulari hanno maggiore o
minore necessità di glucosio quindi il funzionamento di
questo network di miRNA è regolato a seconda della
tipologia cellulare)
miRNA e cancro
Tumori: pattern specifico di espressione dei miRNA che permettono di
discriminare i diversi tipi di cancro e di identificare il tessuto di origine
delle metastasi
Network trascrittoma-microRNA nel cancro
miRNA e cancro
miRNA oncogeni: miRNA overespressi nei tumori (es. miR-155 è
upregolato in tumori maligni del sistema ematopoietico, della mammella,
del polmone e del pancreas, miR-380-5p reprime p53 nel
neuroblastoma, antagonizzandolo con un oligonucleotide antagonista
migliora la prognosi)
blocco dei miRNA con oligonucleotidi antisenso
miRNA oncosoppressori: miRNA ridotti o mancanti nei tumori. La loro
overespressione limita la proliferazione o induce apoptosi (es. miR-15a16-1, downregolato in cellule B di pazienti con leucemia linfocitica
cronica, adenomi della prostata e dell’ipofisi)
miRNA mimics o
vettori virali
Strategie per terapie anti-cancro basate su miRNA:
1. Bloccare miRNA oncogeni usando oligonucleotidi
antisenso
2. Costrutti Locked nucleic acid (LNA)
3. miRNA sponges
4. miR-mask
5. Small molecule inhibitors
6. Ripristinare l’espressione di miRNA oncosoppressori
7. Riprogrammare le cellule cancerogene
Benefits of the LNA technology
Some of the benefits of using LNA include:
Ideal for the detection of short RNA and DNA
targets
Increases the thermal stability of duplexes
Capable of single nucleotide discrimination
Resistant to exo- and endonucleases resulting
in high stability in vivo and in vitro
applications
Increased target specificity
Facilitates Tm normalization
Strand invasion properties enables detection of
“hard to access” samples
Compatible with standard enzymatic processes
Limiti e vantaggi della terapia con miRNA
FUNZIONI DELL'RNA NELLA CELLULA MODERNA
→ traduzione
rRNA, mRNA, tRNA
→ maturazione rRNA
snoRNA,
→ splicing
snRNA, introni gruppi I e II
→ maturazione tRNA
RNasi P
→ sintesi DNA
primers, telomerasi
→ traslocaz. proteine
srpRNA
RNA Interference: il processo attraverso il quale
un RNA a doppio filamento interferisce con
l’espressione genica:
sia inducendo la degradazione di RNA
complementare che bloccandone la traduzione
http://www.nature.com/focus/rnai/animations/index.html
Silenziamento Post-trascrizionale (1990)
Jorgensen 1990:
Introduzione di transgeni responsabili della pigmentazione
della petunia per ottenere petunie più scure
pigmentazione ridotta del 40% nelle petunie transgeniche
ridotta espressione sia del gene endogeno che del
transgene (cosoppressione)
A variegated petunia. Upon injection
of the gene responsible for purple
colouring in petunias, the flowers
became variegated or white rather
than deeper purple as was expected.
1993: Viene identificato il primo miRNA nel C. elegans
1998: Fire e Mello descrivono la presenza di RNA
interference nel C. elegans
1999: il silenziamento genico nelle piante è accompagnato
dall’accumulo di piccoli frammenti di RNA (20-25 Nt)
complementari al gene silenziato. dsRNAs vengono ridotti
a piccoli frammenti di 21-23 Nt
2001: Tuschl et al. dimostrano nella Drosophila che una
piccola sequenza di RNA può interferire in modo specifico
con la trascrizione
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006
"for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA"
Andrew Z. Fire Craig C. Mello
Stanford University University
of Massachusetts
b. 1959
b. 1960
Small RNAs
miRNA
Prodotti in modo endogeno
Funzione: regolazione
dell’espressione genica
sopprimendo la traduzione o
la trascrizione di geni target
siRNA
Exo-siRNA:Introdotti in
modo esogeno (virus a dsRNA,
transposoni, transgeni)
Endo-siRNA: derivati da loci
genomici endogeni
Funzione principale:
rispondere alle minacce
esterne sopprimendo la
trascrizione genica
dell’”invasore”
Interferenza basata su RNA (RNA
interference)
Attori:
Micro RNA (miRNA) precursori a forcina
Small interfering RNA (Si) (2 nt 3’ protrundenti)
Ribonucleasi DICER
RISC (RNA driven interference silencing complex) che
comprende: Argonaute, la proteina che srotola il doppio
filamento e la ribonucleasi che taglia la sequenza senso a 10-11
nt dal terminale 5’.
Il complesso RISC attivato riconosce
sequenze complementari di RNA, le lega e
degrada: questo puo’ avvenire diverse volte
in quanto l’RNA antisenso, protetto dal
complesso proteico è stabile e in cellule
che si dividono lentamente puo’ agire per
3-7 giorni.
Risc unwinds dsRNA,
the ribonuclease in the
Ribonuclease complex hydrolizes
new targets
RNA lungo a doppio
filamento
siRNA sintetico
a doppio filamento
shRNA
plasmidico
miRNA endogeno
20-25 NT
Formazione del complesso RISC (RNA
induced silencing complex)
Amplificazione
RNA-dip RNA polimerasi
funzione
miRNA
Blocco traduzione
Complesso RISC attivato
funzione
siRNA
Formazione doppia elica con RNA complementare
e attacco di endonucleasi
si RNA – caratteristiche
RNA a doppia elica di 21-23 nt
Presenza di terminale 3’ più lungo di 2nt
Presenza di gruppi OH in 3’
Presenza 5’ fosfato
Alta stabilità nella porzione 5’ senso(ricco in GC)
Bassa stabilità nella porzione 5’ antisenso(ricco UA)
Bassa stabilità nella zona centrale dove deve avvenire l’attacco della
endonucleasi
2’ desossitimidina per proteggere siRNA da attività esonucleasiche
Non deve essere complementare a zone introniche
Complementare a una porzione di RNA a non più di 75 basi da codone di
inizio trad.
si RNA – caratteristiche
CELLULE HeLa
si RNA non specifico
In rosso: siRNA marcato
In blu: nuclei
In verde la proteina GAPDH
si RNA contro GAPDH
Trattamento: 48h
siRNA come agenti
terapeutici
LA
SOMMINISTRAZIONE
siRNA come agenti terapeutici
LA SOMMINISTRAZIONE
1. Applicazione topica: instillazione di gocce, aerosol,
iniezione intratumorale
2. Somministrazione sistemica:
a. iv (molecole di circa 5nm riescono a passare le
membrane, fino a 200 nm passano solo capillari
fenestrati : uso di nanocarrier)
b. RNA di sintesi modificati per migliorarne la
farmacocinetica
c. Utilizzo di vettori virali e non per esprimere l’RNA
della cellula bersaglio
siRNA come agenti terapeutici
LA SOMMINISTRAZIONE
Modificazione delle molecole di siRNA per
una distribuzione più efficiente
modificazioni per evitare le difese
immunitarie (modificazione con 2’-o-metile
nel filamento antisenso)
Metodi di somministrazione:
FISICI
Iniezione idrodinamica: efficace in epatociti ma invasiva
Elettroporazione: campo elettrico che facilita la
transfezione di acidi nucleici, utilizzata in vivo nel
muscolo, retina, giunture artritiche e tumori
DI CONIUGAZIONE
siRNA IN STUDI CLINICI
Potenziali effetti collaterali della terapia con
siRNA:
1. Attivazione del sistema immunitario
2. Effetti off-target
3. Saturazione di vie di silenziamento endogene
(miRNA)
Similarità e differenze con oligonucleotidi antisenso
Similarità:
- lunghezza
- metodologia di delivery comune
- induzione di silenziamento genico a livello
post-trascrizionale
- digestione di RNAm bersaglio da parte di
endonucleasi
- possibilità di stabilizzazione con basi
modificate
- similarità nella biodistribuzione
Differenze:
- doppio filamento verso singolo filamento
- maggiore stabilità della molecola naturale
- maggiore efficacia in cellule in coltura
- meccanismo di azione mediato da RISC