I GENI sono alla base delle Biotecnologie Trasformazione Metodi
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Corso di BIOTECNOLOGIE VEGETALI I n t r o d u z i o n e a l l e B i o t e c n o l o g i e 2 parte A cura di Pierdomenico Perata & Elena Loreti I GENI sono alla base delle Biotecnologie Trasformazione Metodi principali di cellule in coltura electroporation in planta Agrobacterium tumefaciens tecnica bio -balistica 1 Trasformazione di cellule in coltura PROTOPLASTI CELLULE IN COLTURA ELECTROPORATION CALLO RIGENERAZIONE Trasformazione in planta Trasformazione in planta Tumori causati da Agrobacterium tumefaciens 2 Trasformazione sintesi sintesi opine opine sintesi sintesi citochinine citochinine sintesi sintesi auxine auxine in planta RB RB coniugazione coniugazione T-DNA T-DNA Plasmide Ti catabolismo catabolismo opine opine LB LB Ori Ori regione regione vir vir Trasformazione Marker Marker di di selezione selezione vegetale vegetale Agrobacteriumtumefaciens Agrobacteriumtumefaciens in planta regione regione T-DNA T-DNA rimossa rimossa RB RB gene gene di di interesse interesse Vettore binario Plasmide Ti helper LB LB marker marker di di Regione selezione selezione Regione Ori Ori vir vir batterico batterico Ori Ori Ori Ori E.coli E.coli Agrobacterium Agrobacterium Agrobacterium Agrobacterium Trasformazione in planta 3 Trasformazione in planta Trasformazione in planta Trasformazione in planta 4 Trasformazione in planta Screening per l’individuazione delle plantule trasformate Trasformazione in planta Screening per l’individuazione delle plantule trasformate Trasformazione in planta gene gene di di resitenza resitenza all’antibiotico all’antibiotico RB RB gene gene di di interesse interesse Vettore binario LB LB marker marker di di selezione selezione Ori Ori batterico batterico Ori Ori E.coli E.coli Agrobacterium Agrobacterium 5 Trasformazione in planta METODI DI SELEZIONE: antibiotici Non trasformato: Antibiotico Tossicità Trasformato: Antibiotico Gene resistenza Trasformazione Resistenza in planta METODI DI SELEZIONE: antibiotici Gene di resistenza ad antibiotici piu’ usato: Neomycin phosphotransferase (NPTII) Problematiche connesse: Trasferimento resistenza a microrganismi intestinali Non esistono evidenze sperimentali a supporto L’eventuale microrganismo resistente non si diffonderebbe in assenza di continua pressione selettiva (antibiotico) Se avvenisse: scarso impatto, già esistono numerose popolazioni di microrganismi resistenti a questi antibiotici Promotore vegetale, non funzionerebbe in batteri Proteina NPT prodotta dalla pianta rapidamente degradata nell’intestino; Cofattori necessari al funzionamento di NPT assenti in giusta concentrazione Kanamicina e Neomicina sono scarsamente usati in medicina Trasformazione in planta METODI DI SELEZIONE: mannosio Non trasformato: ATP ADP Mannosio HXK M6P M6P M6P M6P M6P M6P M6P M6P Tossicità da carenza di P Trasformato: ATP ADP Mannosio M6P HXK F6P Glicolisi MPI 6 Trasformazione in planta METODI DI SELEZIONE: resistenza a erbicidi Preferiti agli antibiotici: maggior tossicità inserimento carattere agronomicamente utile Il gene Bar (da Streptomyces hygroscopicus) conferisce resistenza agli erbicidi a base di Phosphynothricin: Basta (registered in Europe) Bialaphos (registered in Japan) Ignite (registered in the USA). La proteina Bar inattiva la Phosphynothricin aggiungendole un gr uppo acetile preso dal Acetyl-CoA Problematiche: Piante resistenti a erbicidi possono indurre l’agricoltore ad un maggior uso di erbicidi (maggiori residui nei prodotti alimentari) Sviluppo di piante resistenti in seguito all’eccessivo uso di diserbanti Costrutto genico PROMOTORE REGIONE CODIFICANTE TERMINATORE TRASCRIZIONE 5’ mRNA AAAAAAA 3’ TRADUZIONE PROTEINA Costrutto genico PROMOTORE TERMINATORE REGIONE CODIFICANTE GENOMA TRASFORMAZIONE (INSERIMENTO TRANSGENE NEL GENOMA) L’INSERZIONE DEL TRANSGENE PUO’ INTERROMPERE LA SEQUENZA DI UN GENE DELLA PIANTA RICEVENTE 7 Costrutto genico TIPOLOGIE DI PROMOTORE COSTITUTIVO: GARANTISCE UNA ELEVATA ESPRESSIONE IN TUTTI I TESSUTI DELLA PIANTA A TUTTI I SUOI STADI DI SVILUPPO ESEMPIO: PROMOTORE 35S DEL VIRUS del MOSAICO DEL TABACCO (CaMV) TESSUTO SPECIFICO: GARANTISCE L’ ESPRESSIONE IN ALCUNI TESSUTI DELLA PIANTA ESEMPIO: PROMOTORE PEP-CARBOSSILASI, ESPRESSO IN FOGLIE DI PIANTE A FOTOSINTESI C4 TESSUTO -TEMPO SPECIFICO: GARANTISCE L’ ESPRESSIONE IN ALCUNI TESSUTI DELLA PIANTA AD UNO SPECIFICO STADIO DI SVILUPPO ESEMPIO: PROMOTORE LEA (Late Embyogenesis A bundant), ESPRESSO IN EMBRIONI ALLO STADIO TERMINALE DI SVILUPPO INDUCIBILI: GARANTISCE L’ ESPRESSIONE IN RISPOSTA AD UN TRATTAMENTO CHIMICO ESEMPIO: PROMOTORE INDUCIBILE DA ANTIBIOTICI Trasformazione in planta Controllo inserzione del transgene Trasformazione in planta Controllo inserzione del transgene 8 Annealing a 55° Denaturazione a 95° PCR PCR Trasformazione in planta Controllo inserzione del transgene genoma pianta CaMV35S gene di interesse T-nos genoma pianta 9 Trasformazione in planta Controllo inserzione del transgene CTRL 1 2 T1 -1 3 4 5 6 T1 -2 7 8 9 10 11 12 2072 1500 T1 -2 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 2072 1500 Trasformazione in planta Controllo espressione del transgene tramite Northern Blot wt wt tr Trasformazione tr metodo biolistico PROIETTILI DNA-COATED VUOTO GAS ... .... ....... ........... MATERIALE VEGETALE 10 Trasformazione metodo biolistico Trasformazione metodo biolistico Trasformazione metodo biolistico Trasformazione di genoma del cloroplasto 11 Trasformazione di genoma del cloroplasto VANTAGGI I GENI CLOROPLASTICI NON SONO TRASMESSI MEDIANTE IL POLLINE (MINOR RISCHIO DI FLUSSO GENICO) ELEVATI LIVELLI DI ESPRESSIONE DEL TRANSGENE DOVUTI ALLA PRESENZA DI MOLTI CLOROPLASTI NELLA CELLULA (CONTRO UN SOLO NUCLEO) IL DNA INSERITO NEL GENOMA DEL CLOROPLASTO E’ COPIATO 5.000-10.000 VOLTE (NEL NUCLEO SOLO 1-4 VOLTE) Trasformazione 12
