T/A - Didattica

GENOMICA STRUTTURALE:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
GENOMICA FUNZIONALE:
Anatomia dei genomi
8. Funzionamento dei genomi
Il genoma dei procarioti
Modificazioni della cromatina e l’l’espressione del
Il genoma degli eucarioti
genoma
La mappatura dei genomi
Microarray e RNARNA-seq
Mappatura genetica
MetilMetil-seq
Mappatura fisica
ChipChip-seq
Il sequenziamento automatico del DNA
Il principio del sequenziamento secondo Sanger
Il sequenziamento su larga scala
La lettura dei tracciati di sequenziamento
Il sequenziamento del genoma
I nuovi metodi di sequenziamento
Il sequenziamento gerarchico
Il sequenziamento shogun
Piattaforme di sequenziamento di interi genomi
Assemblaggio e annotazione del genoma
Copertura del genoma
Phrap/Consed
Approccio Overlap-Layout-Consensus ed Euleriano
La verifica delle sequenze
Le caratteristiche funzionali delle sequenze genomiche
I Progetti Genoma
Il Progetto Genoma Umano
Il Progetto Genoma Animali
Il Progetto Genoma Piante
Il Progetto Genoma Microrganismi
Genotipizzazione
Gli SNP e la variazione
La genotipizzazione degli SNP
High-throughput genotyping
JOE SUTLIFF
“A prerequisite to understanding the complete biology of an
organism is the determination of its entire genome sequence”
Fleischmann et al. 1995
Che cosa significare genotipizzare?
• Analizzare le variazioni nella sequenza di DNA
• genotipo = la costituzione genetica di un individuo
Allele
• forma alternativa di un gene o sequenza di DNA,
in una determinata posizione cromosomica
(locus)
• in ciascun locus un individuo possiede 2 alleli,
uno ereditato dal padre, uno dalla madre
→ genotipo: è la somma dei due alleli in tutte le
posizioni
differenze genetiche :
• Possono causare o predisporre ad una malattia
• Determinano le risposte individuali a stimoli
chimici/ambientali
• Vengono usate come MARCATORI per identificare
geni
→ sono necessarie tecnologie di genotipizzazione su
larga scala high-throughput genotyping technologies
POLIMORFISMO GENETICO
Un sito viene definito polimorfico se di esso si
conoscono almeno due forme alleliche la più rara
delle quali ha una frequenza di almeno l’1%
SNP markers
Single Nucleotide Polymorphism
GTGGACGTGCTT[G/C]TCGATTTACG
... SNP markers
• È il polimorfismo più semplice
• Altamente abbondante; uno SNP ogni 1000 bp nel
genoma umano
• La maggior parte non alterano le funzioni cellulari
• Largamente usati come marcatori
A) Metodiche classiche per l’identificazione di Polimorfismi
Metodi enzimatici
• Sequenziamento del DNA (metodo Sanger)
• Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
• Flap endonucleasi (FEN)
• Primer extension (SBE)
• Oligonucleotide ligase assay (OLA)
Metodi basati sulle proprietà fisiche del DNA
• Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)
• Single Stranded Conformation Polymorphism (SSCP)
• Denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC)
Metodi basati sull’ibridazione
• 5’ nuclease assay (TaqMan assay)
• Allele-Specific Oligonucleotide Hybridization (ASO)
• Dynamic Allele-Specific Hybridization (DASH)
• Molecular beacons
B) High-throughput SNP genotyping
Metodi enzimatici
• Sequenziamento del DNA (metodo Sanger)
• Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
• Flap endonucleasi (FEN)
• Primer extension (SBE)
• Oligonucleotide ligase assay (OLA)
Metodi basati sulle proprietà fisiche del DNA
• Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)
• Single Stranded Conformation Polymorphism (SSCP)
• Denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC)
Metodi basati sull’ibridazione
• 5’ nuclease assay (TaqMan assay)
• Allele-Specific Oligonucleotide Hybridization (ASO)
• Dynamic Allele-Specific Hybridization (DASH)
• Molecular beacons
Detection of Bi-allelic Variation
A
A
Homozygous for A
T
T
Homozygous for T
A
T
Heterozygous
Matched
Probe and Target
Primer
Extension
+ddCTP
target
Single Base
Extension
dC
G
C incorporated
A
C fails to incorporate
C
ASO sonda marcata
DASH syber green
C
target
C
G
hybridize
TaqMan
C
target
C
G
degrade
Oligonucleotide
Ligation
T allele
+ddATP
+ddTTP
+ddGTP
C allele
Mis-matched
C
target
C
G
A
fails to hybridize
C
A
fails to degrade
C
ligate
A
fails to ligate
C
G
hybridize
A
fails to hybridize
C
C
Molecular
Beacons
target
Syber
green
Sistema Reporter-Quencher
5’ REPORTER (R): fluorocromo ad alta energia che emette
fluorescenza
3’ QUENCHER (Q): fluorocromo a bassa energia che spegne
la fluorescenza del reporter
5’
3’
Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto di R perchè i
fotoni di R vengono assorbiti da Q
Multiplexing
Test multipli che permettono la caratterizzazione simultanea di
centinaia / migliaia di SNPs in un’unica reazione
SBE/DASH basata sugli array
SNP microarray
A
G
A
C
T C
T G C G
T T
A C CG T AG T A A G C
T A T A
C G C A
G
A
A
A
Allele-Specific
Hybridization
C
C
target
C
G
Hybridize
A
Fails to hybridize
Affymetrix
Oligonucleotide
Ligation
C
target
C
A
Fails to ligate
C
G
Ligate
Illumina
Illumina Genotyping
Infinium (7,600-1 Million SNPs)
GoldenGate (96-1,536 SNPs)
BeadArray Reader
• Confocal laser scanning system
• Resolution, 0.8 micron
• Two lasers 532, 635 nm
– Supports Cy3 & Cy5 imaging
• Sentrix Arrays (96 bundle) and
Slides for 100k fixed formats
Illumina Genotyping
Infinium (Single Base Extension or Primer Extension)
• 6000 - 1 Million SNPs
• for standard SNP projects
association study
GoldenGate (Allele Specifc Primer Extension)
• 96 - 1536 SNPs
• for custom and standard SNP projects
standard panel: mouse, linkage, MHC panels
custom panel: cancer SNP panel
Single base extension
Single base extension
Infinium II
Infinium I
GoldenGate
Allele Specifc Primer Extension
Illumina Assay - 3 Primers per SNP
Universal forward
Sequences (1, 2)
5’
Universal reverse
sequence
3’
3’
G
(1-20 nt gap)
A
Allele specific
Sequence
5’
Locus specific
Sequence
Illumicode ™
Sequence tag
C
T
SNP
Genomic DNA template
Allele-Specific Extension and
Ligation
Polymerase
Genomic DNA
Allele Specific
Extension &
Ligation
Ligase
[T/A]
[T/C]
Universal
PCR Sequence 1
Universal
PCR Sequence 2
A
G
illumiCode’ Address
Universal
PCR Sequence 3’
PCR with universal labeled primers
Hybridization to Universal IllumiCodeTM
A/A
illumiCode
#1024
/\/\/\/
/\/\/\/
illumiCode
#217
T/T
/\/\/\/
illumiCode
#561
C/T
Allele-Specific
Hybridization
C
C
target
C
G
Hybridize
A
Fails to hybridize
Affymetrix
Oligonucleotide
Ligation
C
target
C
A
Fails to ligate
C
G
Ligate
Illumina
Affymetrix Genotyping
SNP-Genotyping Arrays
Affymetrix
(10K, 100K, 500K, 5.0, 1M)
affymetrix.com
Illumina
(100K,320K, 230S, 550K,650K, 1M)
illumina.com
Genome-wide association study