Biol. Mar. Mediterr. (2008), 15 (1): 109-111 S. Franzellitti, F. Donnini, E. Fabbri Centro interdipartimentale di ricerca per le scienze ambientali (CIRSA), Università di Bologna, Via S. Alberto, 163 - 48100 Ravenna, Italia. [email protected] PROFILI DI ESPRESSIONE DI GENI SENSIBILI ALLE ALTERAZIONI AMBIENTALI COME INDICATORI DELL’ESPOSIZIONE A FATTORI DI STRESS IN AMBIENTI MARINI COSTIERI GENE EXPRESSION PROFILES AS INDICATORS OF STRESS EXPOSURE IN COASTAL MARINE ENVIRONMENTS Abstract – Mussels were transplanted for 30 days in a contaminated channel within the coastal lagoon Pialassa Baiona (RA). Samples were collected after 2, 5, 7, 14 and 28 days and analysed for the classical biomarkers and for the expression of metallothionein (MT10 and MT20) and heat shock proteins (HSP70 and HSC70) genes. Gene expression increased with time consistently with the stress syndrome development. Key-words: Mytilus galloprovincialis, metallothionein, Hsp70, mercury, gene expression. Introduzione – Gli ambienti marini costieri sono soggetti all’impatto di numerose attività antropiche, quali un’intensa urbanizzazione, l’agricoltura, e le attività industriali. Gli organismi che vivono in tali ambienti sono pertanto esposti a molteplici fattori di stress, che inducono evidenti alterazioni di specifici parametri biochimico/ fisiologici o genetici. Molti di questi sono misurabili in modo relativamente semplice e ripetibile, e definiti biomarker. Al fine di valutare la relazione tra biomarker consolidati e l’espressione genica, abbiamo analizzato le risposte di alcuni biomarker e i profili di espressione di geni sensibili alle alterazioni ambientali nel mitilo Mytilus galloprovincialis, largamente utilizzato come sentinella ambientale nei programmi di biomonitoraggio di ambienti marini costieri (Viarengo et al., 2007) Materiali e metodi – In esperimenti in condizioni controllate abbiamo esposto i mitili a noti fattori di stress in acquario (stress termico: 35 °C, 1 ora; metalli pesanti: Hg2+ o CH3Hg+ 0.75 µM, da 8 ore a 6 giorni). A ogni gruppo di esperimenti è stato associato un gruppo di organismi di controllo, mantenuto nelle stesse condizioni di alimentazione, temperatura (eccetto per gli esperimenti di stress termico, in cui il gruppo di organismi di controllo è stato mantenuto a 16 °C nel corso dell’esperimento), e ossigenazione degli organismi sottoposti al trattamento. Gruppi di 60 mitili sono stati trapiantati per diversi periodi (da 2 fino a 30 giorni) nel Canale Magni della Pialassa Baiona, una zona lagunare situata a nord-est di Ravenna, noto per gli alti livelli di inquinamento ambientale, in particolare da mercurio. In questo caso, il controllo sperimentale è rappresentato da un gruppo di 60 mitili sacrificati e dissezionati nello stesso giorno in cui è avvenuto il posizionamento in Pialassa (tempo zero). Sia per i mitili campionati al tempo zero che per quelli trapiantati in Pialassa, i tessuti sono stati opportunamente prelevati, congelati immediatamente in azoto liquidi e conservati a -80 °C fino al momento del loro utilizzo. Sono state valutate le risposte di due biomarkers, la stabilità delle membrane lisosomiali e i livelli di metallotioneine (MT). Inoltre, dopo estrazione dell’RNA totale dai tessuti di mitilo, è stata valutata l’espressione dei geni per le proteine HSP70. Per il sequenziamento dei tratti genici ed i primers utilizzati si fa riferimento a Franzellitti e Fabbri (2005) per MgHSP70 e MgHSC70; Dondero et al. (2005) per MT10 e MT20, e Franzellitti e Fabbri (2006) per il trasportatore Pgp. S. Franzellitti, F. Donnini, E. Fabbri 110 Risultati – Gli esperimenti condotti in laboratorio hanno dimostrato che l’espressione dei prodotti genici HSP70 è diversamente regolata dall’esposizione allo stress termico e ai metalli pesanti analizzati (Tab. 1). L’andamento temporale della risposta ad Hg2+ e a CH3Hg+ indica che mentre MgHSP70 è indotto in modo transiente come risposta immediata, MgHSC70 rappresenta la risposta citoprotettiva a lungo termine. I prodotti genici MT10 e MT20 di mitilo, codificanti per due isoforme proteiche di MT, sono entrambi sovra-espressi nei mitili esposti ad Hg2+. Il prodotto genico codificante per il trasportatore Pgp è anch’esso differentemente regolato da Hg2+ e CH3Hg+, indicando una funzione della forma chimica del metallo nell’indurre la risposta citoprotettiva. Tab. 1 - Variazione dei profili di espressione genica in mitili esposti a stimoli stressori in condizioni di laboratorio. I dati rappresentano la media ± errore standard della percentuale di variazione dei livelli di espressione nei campioni trattati rispetto ai mitili di controllo. *p<0.05 vs controllo, 1-way ANOVA seguito da Mann-Whitney post hoc test. Gene expression profiles of mussels exposed to model stress stimuli under laboratory conditions. Data represent the mean ± SEM of the percentage of variation in treated samples with respect to control values. *p<0.05 vs control, 1-way ANOVA followed by the Mann-Whitney post hoc test. temperatura (35°C, 1 ora) Espressione gene MgHSP70 250 ± 20* Espressione gene MgHSC70 108 ± 8 Espressione gene MT10 Espressione gene MT20 Espressione gene MgPgp [Hg2+] = 0.75 µM 8 ore 3 giorni 150 200 ± 0.8* ± 2* 95 102 ± 1* ±3 2000 ± 20* 2500 ± 30* 180 16.4 ± 5* ± 0.7* [CH3Hg+] = 0.75 µM 6 giorni 102.4 ± 0.6 280 ± 5* 1800 ± 16* 4000 ± 20* 15.6 ± 0.9* 8 ore 40 ± 3* 220 ± 4* 6 giorni 20.0 ± 3.5* 235 ± 7* 550 ± 10* 530 ± 15* Tab. 2 - Variazione dello stato di salute e dei profili di espressione genica in mitili trapiantati per diversi periodi in Canale Magni (Pialassa Baiona, Ravenna, Italia). I dati rappresentano la media ± errore standard della percentuale di variazione ai vari tempi di campionamento rispetto ai livelli rilevati nei mitili al tempo zero (controllo). *p<0.05 vs controllo, 1-way ANOVA seguito da Mann-Whitney post hoc test. Gene expression profiles and health status of mussels transplanted for different exposure periods within the Magni Channel (Pialassa Baiona, Ravenna, Italy). Data represent the mean ± SEM of the percentage of variation in transplanted mussels at the different time points with respect to control values. *p<0.05 vs control, 1-way ANOVA followed by the Mann-Whitney post hoc test. Stabilità delle membrane lisosomiali Espressione metallotioneine Espressione gene MT10 Espressione gene MT20 Espressione gene MgHSP70 Espressione gene MgHSC70 Espressione gene MgPgp Tempo zero (controllo) 100 100 100 100 100 100 100 2 giorni 7 giorni 30 giorni 99.0 ± 1.5 101 ± 5 260 ± 10* 60 ± 15* 600 ± 30* 506 ± 7* 380 ±15* 95 ± 2 150 ± 5* 418 ± 13* 100 ± 8 445 ± 10* 495 ± 12* 439 ± 8* 60 ± 2* 217 ± 8* 200 ± 15* 40 ± 12* 320 ± 12* 450 ± 20* 400 ± 18* Profili di espressione di geni sensibili alle alterazioni ambientali 111 I biomarker valutati nei mitili posizionati nel Canale Magni sono alterati rispetto a quelli di organismi di controllo (tempo zero), e indicano il progressivo sviluppo di una grave sindrome da stress (Tab. 2). I livelli di espressione genica e proteica delle MT sono univoci nel confermare la contaminazione da metalli pesanti nel sito in esame. Infatti, mentre il gene MT10 è significativamente sovra-espresso già dopo 2 giorni, l’aumento della relativa espressione proteica è significativo solo dopo una settimana e continua ad aumentare, indicando che l’analisi dell’espressione genica è un metodo di rilevazione più precoce. La rapida sovra-espressione del gene inducibile MgHSP70 è un fenomeno atteso nei mitili esposti a diversi fattori di stress ambientale. Nei mitili in Canale Magni la sua sovra-espressione è mantenuta per tutta la durata dell’esperimento indicando una perdurante situazione di stress (Tab. 2). Sebbene lo stress prototipo per la induzione delle HSP inducibili sia quello termico, che è presente nell’ambiente in esame come già segnalato in passato (Donnini, 2004), la risposta è indotta anche da altri fattori, quali i metalli pesanti. Gli esperimenti di laboratorio dimostrano che il gene MgHSC70 non è influenzato dallo shock termico, mentre è attivato dalla prolungata esposizione a metalli pesanti. La significativa sovra-espressione di MgHSC70 nei mitili trapiantati nel Canale Magni indica quindi una esposizione a stress prolungati e intensi, quali lo stress termico e composti xenobiotici di varia natura. Questo dato è confermato anche dalla sovra-espressione di Pgp, un trasportatore di membrana attivato in presenza di xenobiotici. Conclusioni – Sia i fattori di stress analizzati in laboratorio che l’esposizione dei mitili ad un ambiente contaminato hanno indotto evidenti alterazioni dei profili di espressione genica riconducibili a una sindrome da stress contratta dai mitili. I prodotti genici analizzati sono indici estremamente precoci dei fenomeni di tossicità in atto, in accordo con i dati reperibili in bibliografia sull’utilizzo di marcatori molecolari per lo studio della risposta allo stress ambientale (Viarengo et al., 2007). Bibliografia DONDERO F., PIACENTINI L., BANNI M., REBELO M., BURLANDO B., VIARENGO A. (2005) – Quantitative PCR analysis of two molluscan metallothionein genes unveils differential expression and regulation. Gene, 345: 259-270. DONNINI F. (2004) - Utilizzo di Biomarker e indagini geochimiche integrate per la valutazione della qualità ambientale di una laguna costiera, la Piallassa Baiona. Tesi di Laurea Università di Bologna. FRANZELLITTI S., FABBRI E. (2005) - Differential HSP70 gene expression in the Mediterranean mussel exposed to various stressors. Biochem. Biophys. Res. Comm., 336: 1157-1163. FRANZELLITTI S., FABBRI E. (2006) - Cytoprotective responses in the mediterranean mussel exposed to Hg2+ and CH3Hg+. Biochem. Biophys. Res. Comm., 351: 719-725. VIARENGO A., LOWE D., BOLOGNESI C., FABBRI E., KOEHLER A. (2007) - The use of biomarkers in biomonitoring: a 2-tier approach assessing the level of pollutant-induced stress syndrome in sentinel organisms. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol., 146: 281-300.