confidential confidential confidential rapporto sulla risposta in

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RAPPORTO SULLA RISPOSTA IN-VITRO DI
CELLULE INFIAMMATORIE A
IMPIANTI DENTALI TITANMED SABBIATI
RIF.: D.d.t. TITANMED S.r.l.
Ns. rif.: 1501100538
Scritto da:
Dr. Marco MORRA
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Dr.a Clara CASSINELLI
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Dr. Daniele BOLLATI
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copie #: 1
Il testo di questo rapporto è conservato su disco presso NBR
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Scopo del lavoro
Lo scopo del lavoro era la valutazione, mediante analisi RT-PCR, della risposta di cellule
infiammatorie a impianti dentali Titanmed. In
particolare,
lo
scopo
era
di
misurare
l’espressione, da parte di macrofagi in coltura, di alcuni geni-chiave coinvolti nel processo di
infiammazione, utilizzando un protocollo in vitro sviluppato recentemente per analizzare la
presenza di endotossine adese alla superficie.
Materiali e Metodi
I campioni valutati in questo lavoro erano i seguenti, come riportati nella corrispondente bolla di
accompagnamento:
Impianti d. 4.5 mm x 12 mm, nr. 6 campioni, lotto n. 389.
Tutti i campioni erano perfettamente confezionati e sterili, tutte le confezioni erano sigillate. I
campioni sono stati aperti appena prima del test, sotto ad una cappa a flusso laminare, nel nostro
laboratorio di coltura delle cellule.
Dai sei campioni disponibili sono stati creati i seguenti gruppi:
2 campioni sono stati sottoposti ad un ciclo di pulizia brevettato in camera bianca e usati come
controllo. Questi campioni verranno codificati come “controllo” nella presente relazione.
4 campioni sono stati testati nelle condizioni in cui sono stati ricevuti. Questi campioni saranno
codificati come "test" nel corso di questa relazione.
Per valutare la quantità di endotossine adese è stata eseguita una misura di espressione genica
mediante RT-PCR. Le prove sono state eseguite tramite la valutazione dell’espressione da parte di
macrofagi J774A-1 di alcuni geni-chiave della risposta infiammatoria ad endotossine: Interleuchina
1 (IL-1), interleuchina (IL-6), Tumor Necrosis Factor Alfa (TNFα), MCP-1, COX-2 e MCSF.
Il metodo analitico è stato il seguente: abbiamo recentemente dimostrato che l’espressione dei
geni citati da parte della linea cellulare menzionata è, a breve tempo (4h), controllata
sostanzialmente dal livello di endotossine adese ed è indipendente dalla topografia superficiale.
Sulla base di questa osservazione, la quantità di endotossine adese alle superfici implantari può
essere misurata controllando la risposta trascrizionale di macrofagi J774A-1 a tempi brevi sulle
superfici da analizzare. Le misure sono state eseguite come segue: una sospensione di 1.05±0.13
x 105 cellule J774A1, coltivate in DMEM contenente L-glutamina (Gibco, INVITROGEN S.r.l.) e
20% FOetal Bovine Serum (FBS Gibco, INVITROGEN S.r.l.), penicillina e streptomicina è stata
introdotta in micropiastre a 12 pozzetti sterili in polistirene (12-well multiwell plates, Cell Star,
Greiner OneTM) contenenti i campioni. L’analisi di espressione genica è stata condotta utilizzando
real time reverse transcription PCR (qRT-PCR). L’RNA totale è stato estratto dopo 4 h, utilizzando
il MagMax Total RNA Isolation Kit (Applied Biosystems). La qualità dell’RNA è stata valutata
controllando che il rapporto A260/A280 fosse tra 1.6 e 2.0. L’RNA estratto è stato in seguito retro-
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trascritto per ottenere cDNA utilizzando l’Applied Biosystems High Capacity cDNA Reverse
Transcription kit.
La quantificazione relativa dei geni è stata ottenuta utilizzando sonde Taq Man specifiche per ogni
gene valutato e GAPDH come gene di riferimento. Le reazioni di amplificazione sono state
eseguite in duplicato utilizzando un termociclatore StepOne (Applied Biosystems) secondo le
istruzioni del produttore. I grafici di espressione genica sono stati ottenuti normalizzando i dati
utilizzando il software StepOne, secondo il metodo standard ∆Ct.
Risultati
I risultati delle misure di espressione genica sono riportati nel grafico nella pagina seguente. Per
ogni gene, la prima e l’ultima barra mostrano i risultati ottenuti sui campioni di controllo, le quattro
barre rimanenti mostrano i risultati ottenuti sui campioni test. In particolare i dati mostrano quante
volte è aumentata l’espressione di un dato gene rispetto a quella del primo campione di controllo,
preso come 1. Mentre i grafici riportano la barra di errore ottenuta in questo esperimento, il nostro
protocollo di validazione evidenzia che differenze di espressione di ± 0.5 possono avvenire
all’interno di un medesimo esperimento. Perciò, per accettare una differenza come “significativa”,
le variazioni osservate devono essere superiori a ± 0.5.
I campioni sono chiaramente divisi in due famiglie, i campioni test mostrano un significativo
aumento dell’espressione dei geni analizzati se comparati con i campioni di controllo. In
particolare, i tipici geni coinvolti nella risposta alle endotossine adese, come IL-1 e IL-6 sono
espressi tra 2.5 e 3.5 volte di più sui campioni “test”. Questi dati indicano che gli impianti
confezionati presentano una quantità di endotossine adese significativamente più alta rispetto ai
controlli. In sintesi, i presenti risultati suggeriscono che la pratica di pulizia e confezionamento è
effettivamente, in generale, soddisfacente, almeno per quanto riguarda il lotto di impianti testati.
Conclusioni
In conclusione, il presente lavoro indica che sia gli impianti testati sono, in generale, soddisfacenti
e non suscitano una maggiore sovra-espressione di geni pro-infiammatori da parte di macrofagi
J774A-1, suggerendo la presenza di una bassissima quantità di endotossine adese.
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