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MANIPOLAZIONE GENETICA
DEGLI ANIMALI
Perché creare animali transgenici
• Per studiare la funzione e la regolazione di geni coinvolti in
processi biologici complessi come lo sviluppo di un organismo
e l’insorgenza di malattie
• Per la produzione di bioreattori, animali in grado di produrre
proteine ricombinanti su vasta scala: anticorpi, ormoni,
fattori di crescita, citochine e farmaci
Animali transgenici più comuni: topo, Drosophila melanogaster, Xenopus
laevis. Negli ultimi anni si sta cercando di ottenere anche animali
transgenici di allevamento, come polli, maiali, bovini e pecore
Stadi iniziali dello sviluppo
embrionale di topo
Per ottenere animali transgenici è
necessario che tutte le cellule
dell’organismo, incluse le cellule
germinali, contengano il transgene
Metodi per la generazione di topi
transgenici
9 Microiniezione nel pronucleo
9 Trasfezione delle cellule ES
9 Trasferimento nucleare
Microiniezione nel
pronucleo
Il DNA viene iniettato nel pronucleo maschile
subito dopo la fecondazione. Gli embrioni
iniettati vengono coltivati in vitro fino allo stadio di
morula e poi impiantati nell’utero di topine
pseudogravide, precedentemente incrociate con
maschi vasectomizzati.
Vantaggi:
Il
DNA
esogeno
non
deve
essere
necessariamente clonato in un vettore. Frammenti
di DNA si integrano nel genoma in maniera
casuale e in copie multiple.
Svantaggi:
La casualità dell’evento di integrazione può avere
conseguenze
notevoli
sull’espressione del
transgene per l’effetto di posizione.
Produzione solo di transgeni e non di KO
L’efficienza del metodo è molto variabile (5-40%).
Cellule staminali
embrionali
Il DNA viene introdotto per trasfezione o
trasduzione nelle cellule ES. Dopo
selezione, le cellule ES ricombinanti
vengono introdotte nel blastocele di un
embrione ricevente allo stadio di
blastocisti. La progenie risultante sarà
chimerica
Vantaggi
Selezione delle cellule che hanno acquisito
il DNA esogeno
Utili per il gene targeting, ossia per
l’integrazione mirata del DNA esogeno nel
genoma, poiché sono efficienti nei
meccanismi di ricombinazione omologa
Produzione di animali KO
Vantaggi della clonazione:
1) Conservazione di specie
animali in via d’estinzione
2) Scopi terapeutici
(xenotrapianti)
Svantaggi della metodica:
1) Il processo è molto
inefficiente. Nel caso di Dolly
soltanto 1 su 277 fusioni
cellulari ha dato origine ad una
prole
2) Gli animali prodotti con il
trasferimento
nucleare
mostrano anomalie e tendenza
a invecchiamento e morte
precoce
Clonazione per
trasferimento nucleare
Mutazione genomica o
Gene targeting
Sostituzione di un segmento di genoma endogeno con
un segmento omologo di DNA esogeno. Utile per
™ Sostituire geni endogeni con copie non funzionali
™ Introdurre piccoli cambiamenti sito-specifici
™ Sostituire copie di geni non funzionali con copie wt
(terapia genica)
Gene targeting per
ricombinazione omologa
Doppia selezione, positiva-negativa
Il ganciclovir è un analogo sintetico
della
2’deossiguanosina
che,
fosforilato
dalla
timidina-chinasi,
inibisce l’attività della DNA polimerasi
uccidendo le cellule
La ricombinazione sito-specifica
La sequenza interposta tra i due
siti loxP orientati come ripetizioni
dirette viene deleta
La sequenza interposta tra i due
siti loxP orientati come ripetizioni
invertite viene invertita
Sito loxP riconosciuto dalla ricombinasi Cre del batteriofago P1. I siti loxP
sono sequenze di 34 bp che comprendono due ripetizioni invertite di 13 bp
che fiancheggiano un elemento centrale di 8 bp
Knock-out condizionali mediante la
ricombinazione sito-specifica
La
tecnica
del
knock-out
condizionale permette di studiare
negli individui adulti l’effetto di
mutazioni caratterizzate da un
fenotipo embrionale letale
Attivazione genica mediante
ricombinazione sito-specifica
Rimozione del marcatore mediante
ricombinazione sito-specifica
Le applicazioni della
ricombinazione sito-specifica
Delezioni sito-specifiche di sequenze del transgene
• Eliminare il marcatore di selezione
• Creare animali con KO di tipo condizionale
Attivazione sito-specifica dei transgeni
Ingegneria cromosomica
• delezioni cromosomiche
• traslocazioni
• inversioni