Scaricato da www.sunhope.it ELEMENTI FONDAMENTALI PER LA REAZIONE DI PCR PCR=Polymerase Chain Reaction (Reazione a Catena della Polimerasi) Frammento di DNA contenente il segmento da amplificare La PCR è stata ideata da K.B. Mullis nel 1983 in California E’ un procedimento molto semplice che consente di ottenere un numero elevatissimo di copie di uno specifico segmento di DNA 5’ 3’ 3’ 5’ Coppia di inneschi (o primers) per la DNA Polimerasi: oligonucleotidi lunghi 18-25 basi, di sequenza complementare a quelle fiancheggianti il Primer 1 segmento di DNA da amplificare. Primer 2 TAQ DNA POLIMERASI 5’ dNTP (N= A, C, G, T) La PCR è una tecnica molto sensibile che consente di rivelare la presenza del DNA o dell’RNA di interesse WWW.SUNHOPE.IT partendo da quantità minime di materiale biologico 2. 3. DENATURAZIONE: il DNA viene denaturato a 94°C per separare fra loro i due filamenti che formano la doppia elica. ANNEALING: la temperatura scende a 30-65°C (valore scelto in funzione della composizione in basi e della lunghezza degli inneschi) per consentire l’appaiamento fra gli inneschi e le due eliche di DNA ad essi complementari ESTENSIONE: La temperatura sale a 72°C e la Taq Polimerasi sintetizza i nuovi filamenti di DNA partendo dai due inneschi in direzione 5’→ →3’utilizzando come WWW.SUNHOPE.IT stampo le due eliche di DNA. WWW.SUNHOPE.IT 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ Mg2+ Apparecchio per PCR (es. Thermocycler) WWW.SUNHOPE.IT CARATTERISTICHE DEI PRIMERS UN CICLO DI PCR 1. 5’ 3’ 5’ • Lunghezza compresa tra 14-40 basi 3’ 3’ 5’ • Contenuto di G+C pari al 40-75 % 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ • Estremità 3’ end deve contenere un codone conservato (Trp, Met) 5’ 3’ 5’ • Evitare la presenza della 3 base ballerina 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ • Valori di Tm simili. 5’ 3’5’ 5’3’ 3’ 5’ WWW.SUNHOPE.IT • Evitare sequenze interne complementari 1 Scaricato da www.sunhope.it FORMAZIONE DI DIMERI E DI LOOP 5’ ACTG CALCOLO DELLA Tm CAGT 3’ Tm = 81.5 + 16.6 (log 10 [ J+] + 0.41 (% G+C) - (600/l) 5’ [ J+]= concentrazione di cationi monovalenti ACTG 3’ TGAC 5’ ACTG Per esempio: PCR buffer = 60 mM (J+) Primers 20 mer 55% G+C CAGT 3’ 3’ TGAC GTCA 5’ Tm = 81.5 - 20.3 + 22.6 -30 = 53.8 Ta (annealing) = Tm (3 - 12 °C) WWW.SUNHOPE.IT POLYMERASE CHAIN REACTION WWW.SUNHOPE.IT WWW.SUNHOPE.IT WWW.SUNHOPE.IT PCR: AMPLIFICAZIONE ESPONENZIALE DEL DNA STAMPO WWW.SUNHOPE.IT 2 Scaricato da www.sunhope.it QUANTIZZAZIONE DEI PRODOTTI DI PCR ANALISI SU GEL DI AGAROSIO DI PRODOTTI DI PCR 1 2 3 4 5 6 MW β-actina 500 bp Questa è la rappresentazione schematica dell’aumento dei prodotti di amplificazione in funzione del numero di cicli di PCR. In questo caso, tra il 15 ed il 22mo ciclo ersiste una relazione lineare tra il numero di cicli ed il prodotto di amplificazione ottenuto. Nei cicli successivi viene raggiunto il “plateau”. WWW.SUNHOPE.IT PRINCIPALI APPLICAZIONI DELLA PCR Identificazione di agenti patogeni nell’uomo, negli animali o negli alimenti (batteri e virus) Identificazione di organismi geneticamente modificati (OGM) Analisi del DNA in medicina legale (es. Test di paternità) Diagnosi pre-natale di malattie genetiche (es. Anemia falciforme, Distrofia di Duchenne, talassemia) Diagnosi di malattie tumorali (es. Linfoma) Clonaggio e sequenziamento di frammenti di DNA WWW.SUNHOPE.IT WWW.SUNHOPE.IT AT1 306 bp WWW.SUNHOPE.IT PRINCIPALI TIPI DI PCR a) RT-PCR: serve a valutare l’espressione di un gene tramite l’amplificazione dell’mRNA da esso trascritto PCR ASIMMETRICA: serve ad ottenere DNA a singolo filamento e si effettua utilizzando uno dei due inneschi in quantità molto ridotta rispetto all’altro PCR COMPETITIVA: serve a valutare la concentrazione iniziale di DNA o RNA attraverso l’amplificazione in contemporanea con un DNA standard, aggiunto in quantità nota alla miscela di reazione. Il campione standard si amplifica con la stessa coppia di inneschi del DNA di interesse. WWW.SUNHOPE.IT 3 Scaricato da www.sunhope.it PRINCIPALI TIPI DI PCR b) NESTED PCR: serve ad ottenere una maggiore specificità del prodotto di amplificazione utilizzando in successione due coppie di inneschi, di cui una più esterna e poi una più interna rispetto al segmento di DNA di interesse MULTIPLEX PCR: consente di amplificare contemporaneamente diversi segmenti dello stesso campione di DNA utilizzando coppie di inneschi diversi (es. Distrofia duchenne) PCR REAL TIME: consente di seguire in tempo reale l’andamento della PCR utilizzando inneschi fluorescenti e misurare le quantità assolute di molecole di partenzaWWW.SUNHOPE.IT MISURA DEL LIVELLO DI TRASCRIZIONE DI UN GENE Per misurare il livello di mRNA trascritto da un determinato gene e quindi avere indicazioni sul suo livello di espressione (es. tessuto, organo, batteri, cellule in coltura, etc.) è necessario: Estrarre l’RNA totale dal campione biologico che si vuole esaminare Trasformare il pool di RNA (che conterrà anche l’mRNA trascritto dal gene di interesse) in cDNA tramite la reazione di trascrizione inversa Evidenziare il cDNA di interesse tramite la reazione di PCR WWW.SUNHOPE.IT TRASCRIZIONE INVERSA RT-PCR=REVERSE TRANSCRIPTASE PCR La RT-PCR amplifica un RNA convertendolo prima in cDNA (o DNA complementare all’RNA) tramite l’enzima trascrittasi inversa, e poi amplificandolo tramite PCR con inneschi specifici per la sequenza di interesse. 5’ AAAAA 3’ TTTTT 5’ RT 3’ TTTTT 5’ TAQ Pol La reazione di TRASCRIZIONE INVERSA consente di produrre una molecola di cDNA (DNA complementare) a partire da mRNA (RNA messaggero). L’enzima che catalizza questa reazione è la trascrittasi inversa, una DNA polimerasi RNAdipendente. Questo enzima è stato inizialmente identificato nei retrovirus (ad esempio il virus HIV). Le due trascrittasi inverse più utilizzate in laboratorio sono la AMV (isolata dall’Avian Myeloblastosis Virus) e la MoMLV (isolata dal Moloney Murine Leukemia Virus). Il pool di cDNA ottenuto dalla reazione di trascrizione inversa è utilizzato per misurare il WWW.SUNHOPE.IT livello di espressione di un gene mediante la tecnicaPCR WWW.SUNHOPE.IT La RT-PCR viene utilizzata, ad esempio, per valutare il livello di espressione di un gene misurando la quantità di mRNA da esso trascritto. 5’ 3’ 3’ 5’ La trascrittasi inversa viene utilizzata dai retrovirus (o virus WWW.SUNHOPE.IT ad RNA, es HIV). 4