piaz___caratteri monofattoriali

Rilevanza clinica delle malattie genetiche
• circa il 25% di tutti i pazienti in età pediatrica
manifestano problemi associati a malattie genetiche
ereditarie
Caratteri monofattoriali
• alcune malattie genetiche molto tempo dopo la
nascita (vengono chiamate “ad esordio tardivo”, per
e s e m p i o i l m o r b o d i A l z h e i m e r, l a m a l a t t i a d i
Huntington )
Corso di Genetica per la Facoltà di
Medicina e Chirurgia
• alcune malattie genetiche sono molto più frequenti
Alberto Piazza
tra gli Europei, l’anemia falciforme nel Mediterraneo
in alcune popolazioni (per esempio: la fibrosi cistica
e d i n A f r i c a , i l T a y -S a c h s n e g l i E b r e i a s k e n a z i t i )
Terminologia
Terminologia
L o c u s: l a p o s i z i o n e d i u n g e n e s u u n c r o m o s o m a
Omozigote: porta 2 alleli identici ad un locus , βA βA o βS βS
es. s e x d e t e r m i n i n g g e n e , g e n e S R Y
Eterozigote: porta 2 alleli differenti ad un locus , βA βS
SRY si trova sul cromosoma Y nella posizione p11
Eterozigote composto: porta 2 alleli non normali (2 mutazioni diverse) ad un
locus , βSβC
Portatore (sano): eterozigote asintomatico
Alleli: forme alternative di un gene
Per es. nel gene della beta globina, il c o d o n e (tripletta di
nucleotidi) che codifica per il sesto
Allele normale
aminoacido:
A .……………...GAG..... (acido glutammico)
Probando (Propositus ): l’individuo affetto attraverso il quale la famiglia di cui
fa parte viene portata all’esame
Genotipo: costituzione genetica di un individuo, nella sua totalità o riferita ad
un gene specifico, per es. anemia falciforme, βS βS
Fenotipo: caratteristica osservabile di un individuo, o di una cellula
A l l e l e d e l l a c e l l u l a f a l c e m i c a S . … . G T G . . . . . ( v a l i n e) m u t a z i o n e
A l l e l e “ c r i s t a l l i n o ” C . … … … … … … A A G . . . . . ( l i s i n a) m u t a z i o n e
1
Malattie ereditarie dominanti
Trasmissione ereditaria dei caratteri mendeliani
Mutazioni che inducono un eccesso di funzione
Dominante: ogni tratto o carattere che si esprima nell’ eterozigote, cioè, nel caso
di malattia, in cui sia sufficiente una sola copia del gene difettoso per esprimere
il fenotipo affetto
La mutazione produce una proteina con funzione o espressione alterata,
nella maggior parte dei casi una sovra-espressione o una espressione
scorretta (nel tessuto o nello stadio di sviluppo sbagliati) della proteina. Per
es. nella malattia di Charcot -Marie- Tooth, una duplicazione errata del DNA
(3 copie) -> sovra-espressione
Recessivo: ogni tratto o carattere che si esprima solo nell’ omozigote, cioè, nel
caso di malattia, in cui entrambe le copie del gene difettoso devono essere
presenti per esprimere un fenotipo affetto
Codominante: nel caso in cui lo stato eterozigote esprima un fenotipo distinto da
quello dei due stati omozigoti, per es. gruppi sanguigni, enzimi eritrocitari, etc.
I fenotipi possono essere analizzati e misurati a differenti livelli. In molte malattie
metaboliche gli eterozigoti sono sani (trasmissione recessiva), ma l’enzima
responsabile della malattia può manifestarsi nel siero con livelli di
concentrazione intermedi rispetto a quelli dei due stati omozigoti.
Insufficienza del corredo aploide (aploinsufficienza)
La riduzione di una copia del gene (50% ) è dannosa. Per esempio la
ipercolesterolemia, dovuta ad una mutazione nel recettore della lipoproteina
a bassa densità (LDL) genera una diminuzione dei livelli di recettore da cui
circa il doppio di colesterolo in circolo -> rischio maggiore di patologie
cardiovascolari
Mutazioni dominanti negative
Mutazioni che generano un prodotto proteico che non solo non funziona, ma
anche inibisce o interferisce con la funzione delle proteine nor mali,
tipicamente proteine multimeriche. Un esempio è l’ osteogenesis imperfecta,
collageno di tipo I composto da 3 polipeptidi
Trasmissione ereditaria di un singolo gene
(eredità monofattoriale
monofattoriale))
Malattie ereditarie recessive
Mutazioni che inducono una perdita di funzione
• Mendeliana
Gli eterozigoti (portatori) sono normali, una riduzione del
prodotto proteico del 50% viene tollerato se il rimanente
50% è sufficiente per una funzione normale
– Autosomica Dominante (AD) (8544)
Esempio: tratto falcemico, βA βS
– Autosomica Recessiva (AR) (1730)
– X-linked Recessiva (X-linked R)
(785)
– X-linked Dominante (X-linked D)
– Y-linked (41)
Gli omozigoti sono affetti perché non viene prodotta
proteina o quella che è prodotta non funziona
normalmente
Esempio: anemia falciforme, βS βS
• Non-mendeliana
Caratteri che sono famigliari ma non seguono una segregazione famigliare
– malattie mitocondriali (60)
• madri affette trasmettono il carattere a tutti i figli
• padri affetti non trasmettono il carattere
GENI MAPPATI
8191 (al 2/11/2002, fonte OMIM)
2
Eredità autosomica dominante
• un individuo affetto ha comunemente almeno un
genitore affetto, ma vi sono eccezioni
• si manifesta in uguale misura nei due sessi
- la trasmissione non dipende dal sesso
• un figlio di una persona affetta e di una persona non
affetta ha il 50% di probabilità di essere affetto
• individui non affetti non trasmettono la malattia
Eredità autosomica recessiva
• gli individui affetti sono omozigoti
• nella maggior parte dei casi, entrambi i genitori sono portatori
sani
– in media, 1 su 4 figli è affetto
• la trasmissione non dipende dal sesso
• matrimoni tra individui affetti e non affetti genera solo figli
eterozigoti sani
– a meno che il partner non affetto sia eterozigote
• più è rara la malattia, più è probabile che l’individuo affetto sia
figlio di genitori consanguinei tra di loro (inglese inbreeding,
italiano poco usato inincrocio)
Eredità XX-Linked recessiva
• l’ individuo affetto è più frequentemente un maschio
Eredità XX-Linked dominante (rara)
• i maschi affetti sono comunemente nati da genitori sani
• generalmente le femmine sono affette il doppio delle volte
dei maschi
– la malattia viene ereditata dalla madre che è portatrice sana
(eterozigote) e può avere parenti maschi affetti
– certe malattie sono letali nel maschio emizigote
• le femmine portatrici sono fenotipicamente normali
(asintomatiche)
• le femmine sono spesso affette più lievemente e con più
variabilità dei maschi
– in media, 1 su 4 figli è affetto
– dovuto all’inattivazione del cromosoma X (o Lyonizzazione)
• in media il 50% dei maschi di una fratria è affetto
• NON vi è trasmissione da padre a figlio maschio
• padri affetti possono avere solo figlie femmine affette ma
non figli maschi affetti
– ma un matrimonio di un maschio affetto con una femmina
portatrice può simulare una trasmissione da maschio a maschio
• in media il 50% di tutti i figli di una madre affetta saranno
affetti
3
Variabilità di trasmissione ed espressione genica
• Penetranza: frequenza (probabilità) che un genotipo esprima il fenotipo (clinico)
Eredità YY-Linked (rara)
• solo gli individui maschi sono affetti
• trasmissione diretta da padre a figlio
– la penetranza incompleta di un carattere si manifesta in una proporzione di figli
affetti minore di quella attesa dalle proporzioni mendeliane (comunemente il 50% e
25% nei casi di caratteri autosomici rispettivamente dominanti e recessivi)
– molte malattie autosomiche dominanti sono a penetranza incompleta: vengono
all’osservazione come fenotipi che saltano una generazione
– si esprime come una percentuale o una frazione di uno
– cromosoma Y
• i figli maschi affetti avranno sempre un padre affetto
– a meno che sia insorta una nuova mutazione
• per esempio nei geni che inducono la differenziazione di
un embrione in un maschio, che esprimono fattori
spermatogenetici, gli antigeni minori dell’istocompatibilità
(HY)
Esempio: la sindrome dell’X Fragile ha una penetranza del 80% (8 su 10 con il
genotipo della malattia esprimono il fenotipo)
• Espressività: indicazione della natura e gravità del fenotipo a parità di genotipo
– individui differenti, pur avendo lo stesso genotipo, possono es sere affetti in
misura più o meno grave
Esempio: la sindrome di Marfan si manifesta con un ampio spettro di gravità clinica
Variabilità di trasmissione ed espressione genica
Variabilità di trasmissione ed espressione genica
• Pleiotropia: un gene si manifesta in una varietà di effetti fenotipici
• Eterogeneità allelica: lo stesso fenotipo causato da mutazioni
diverse nello stesso gene
– anomalie morfologiche, biochimiche, fisiologiche, o cliniche multiple
Esempio: la sindrome di Marfan, si manifesta con difetti a carico dello
scheletro, del cuore e degli occhi
• Eterogeneità genica: lo stesso fenotipo causato da mutazioni a geni diversi
– mutazioni in geni che codificano per diverse unità o subunità di una proteina,
o per proteine che interagiscono con altre proteine, o che agiscono a stadi
diversi di un processo metabolico
Esempio della Osteogenesis Imperfecta (OI), La tripla elica del collagene di
tipo I è formata da 2 catene α1 (codificate sul cromosoma 17) and 1 catena α2
(codificata sul cromosoma 7). Mutazioni nei geni che modificano la produzione
o la struttura di queste catene danno luogo a diversi tipi clinici di OI.
– comune perché molte malattie sono causate da mutazioni che
inducono una perdita di funzione (ogni mutazione che impedisce
la produzione o la funzione del prodotto genico)
Esempi: ipercolesterolemia famigliare, varie mutazioni a livello del
gene del recettore LDL provocano la perdita di recettori funzionali
con conseguente accumulo di colesterolo
β- talassemia, a produrre questo fenotipo sono molte mutazioni
diverse nel gene della β-globina
4
Variabilità di trasmissione ed espressione genica •
Anticipazione: il fenomeno per cui l’età di insorgenza di una
malattia diminuisce e/o la gravità del fenotipo aumenta da una
generazione all’altra
Esempi: malattia di Huntington’s, distrofia muscolare miotonica,
sindrome da X fragile
(nella maggior parte dei casi è il risultato della espansione da
ripetizione di triplette nucleotidiche)
• Imprinting: espressione del carattere genetico che è diversa a
seconda se sia stato trasmesso l’allele materno o paterno
– determinato soprattutto da una diversa metilazione del DNA
nella linea germinale
Variabilità di trasmissione ed espressione genica •
Patologie da geni contigui: microdelezioni che coinvolgono molti
geni contigui, combinando cos+ i segni di due o più malattie
ereditarie monofattoriali
Esempi: WAGR (Wilms’ tumor, Aniridia, anomalie del tratto
Genitorurinario, Ritardo mentale, microdelezione in 11p)
CATCH22 (Cardiac defect, Abnormal facies, Thymic hypoplasia,
Cleft palate, Hypocalcemia, una delezione in 22q11, incidenza
1/5000, ~5% di tutti i difetti cardiaci congeniti)
• Fenocopie: fenotipi simili a malattie genetiche ma causati da
fattori non genetici
Esempio: sordità causata da infezione di rosolia in utero
Esempi: le sindromi di Prader- Willi e Angelman
Variabilità di trasmissione ed espressione genica
Analisi di alberi genealogici (1)
• Mutazioni nuove o “de novo”: generalmente identificate nelle malattie
dominanti o recessive X- linked, molto raramente producono malattie
autosomiche recessive (entrambe le copie del gene devono essere
mutate)
Trasmissione verticale o orizzontale: criterio indicativo, ma non è una regola
assoluta
– il rischio di ricorrenza è basso, ma leggermente superiore all’incidenza della
malattia nella popolazione a causa del mosaicismo della linea germinale
1. Trasmissione verticale , cioè generazioni successive con individui affetti,
trasmissione ereditaria potenzialmente DOMINANTE
2. Trasmissione orizzontale , cioè presenza di molti individui affetti all’ interno
di una generazione, ma pochi nella generazione precedente o successiva
(salto di una generazione), trasmissione ereditaria potenzialmente
RECESSIVA
5
Analisi di alberi genealogici (2)
• Rapporto maschi affetti su femmine affette
Analisi di alberi genealogici:
eredità autosomica dominante
– più maschi affetti nelle malattie recessive X- linked
– solo maschi affetti nelle malattie Y-linked
– se un genitore è affetto, in media il 50% dei figli sarà affetto
• Dall’individuo affetto si esamini l’albero verso le generazioni
precedenti e seguenti
– se la penetranza del carattere è completa (100%), i figli di genitori non
affetti non sono a rischio di essere affetti
– femmine non affette che trasmettono la malattia al 50% dei maschi,
sono probabili portatori: la trasmissione è verosimilmente X-linked
recessiva
– maschi affetti che trasmettono la malattia a tutte le figlie fe mmine: la
trasmissione è verosimilmente X- linked dominante
– se un individuo affetto non ha genitori affetti e la penetranza del
carattere è completa, l’individuo ha una nuova mutazione, i suoi figli
avranno un rischio del 50% di essere affetti se la mutazione è n ella
linea germinale, ma i figli successivi avranno un basso rischio di
ricorrenza
– maschi che trasmettono la malattia a tutti i figli maschi e non alle
figlie femmine: la trasmissione è verosimilmente Y-linked
– gli individui affetti sono generalmente eterozigoti, in quanto gli
omozigoti affetti sono molto più rari
Eredità autosomica dominante
Se un genitore è normale (bb)
e l’altro è affetto (Bb) da una
malattia autosomica
dominante,
il 50% dei figli sarà eterozigote
affetto (Bb), ed il 50% sarà
omozigote normale (bb).
Eredità autosomica dominante
Se entrambi i genitori sono affetti
(Bb) da una malattia autosomica
dominante, allora il 75% dei figli
sarà affetto (BB or Bb), e il 25%
sarà omozigote normale (bb).
Nelle malattie autosomiche dominanti, la lettera maiuscola indica il gene che dà la
malattia: un solo gene dannoso dà origine la fenotipo affetto
Qual è la probabilità di essere affetto un figlio di entrambi i genitori affetti da una
malattia autosomica dominante ed entrambi eterozigoti?
Nota: è raro che un individuo affetto da una malattia autosomica dominante sia
omozigote per il gene che dà la malattia.
6
Analisi di alberi genealogici:
malattia autosomica recessiva
– genitori e figli degli individui affetti sono portatori OBBLIGATI
– il rischio di essere un portatore si divide per 2 ad ogni generazione
(seguente e precedente quella del portatore accertato)
– la maggior parte degli omozigoti affetti sono figli di matrimoni tra due
individui portatori (eterozigoti) che generano figli:
1/4 affetti, 2/4 portatori, 1/4 omozigoti normali
– i fratelli non affetti hanno una probabilità di 2/3 di essere portatori
(1 omozigote normale + 2 portatori =3 non affetti)
– le nuove mutazioni sono rare
– se la malattia è rara, si può assumere che le persone al di fuori della
famiglia siano omozigoti normali, o si può usare la frequenza dei portatori
nella popolazione
Eredità autosomica recessiva
Se un genitore è normale (AA) e
l’altro è portatore (Aa), allora il
50% in media dei figli sarà
omozigote normale (AA), e l’altro
50% sarà portatore eterozigote
non affetto (Aa).
Non vi sono figli affetti.
Nel caso di malattie autosomiche recessive, le lettere minuscole stanno
ad indicare i geni che in omozigosi danno la malattia, perché entrambi i
geni devono essere mutati perché si osservi il fenotipo patologico.
Qual è la probabilità di avere un figlio affetto se entrambi i genitori sono
portatori?
Probabilità di essere portatori di una
malattia autosomica recessiva
Eredità autosomica recessiva
Se entrambi i genitori sono
portatori sani (Aa), il 25% in
media dei figli sarà omozigote
normale (AA), il 50% sarà
eterozigote non affetto (Aa), e il
25% sarà omozigote affetto (aa).
Se un genitore è un portatore
sano (Aa) e l’altro è affetto (aa),
allora il 50% in media dei figli
sarà eterozigote non affetto
(Aa), e l’altro 50% sarà
omozigote affetto affected (aa).
La probabilità di essere portatore (eterozigote) di una malattia
autosomica recessiva si deriva conoscendo che il probando nella
generazione IV è affetto dalla malattia. I genitori nella generazione
III ed i figli nella generazione V sono portatori “obbligati” della
malattia.
7
Analisi di alberi genealogici:
malattia autosomica recessiva
Analisi di alberi genealogici:
malattia autosomica recessiva
Qual è la probabilità di essere affetto per un figlio di genitore affetto:
Qual è la probabilità di un figlio affetto se entrambi i genitori sono normali:
probabilità padre portatore x probabilità madre portatrice x 1/4 (probabilità che il figlio
sia affetto)
=_____
Se la frequenza dei portatori sani nella popolazione è il 2% (2/ 100 or 1/50)
Probabilità che un genitore non affetto sia portatore x 1/2 =
Qual è la probabilità di essere affetto per un figlio di entramb i i genitori
affetti : 100%
Eccetto che nei casi di eterogeneità genetica, in cui il figlio può essere
un doppio eterozigote non affetto
La sorella affetta indica che i genitori sono portatori obbligati, sicchè il
fratello ha una probabilità di 2/3 di essere un portatore e la sua partner
ha la probabilità di essere portatrice pari a quella dei portatori sani nella
popolazione, il 2%. Il rischio di malattia per il figlio ? È allora:
Per esempio la sordità profonda è una
malattia autosomica ressiva. Un genitore è
sordo a causa del gene mutato a (genotipo
aa, BB), l’altro genitore è sordo a causa del
gene mutato b (genotipo AA, bb). Qual è il
genotipo del figlio e qual è la sua probabilità
di esser sordo?
2/3 x 1/50 x 1/4 = 1/300
Analisi di alberi genealogici:
eredità X-linked recessiva
Eredità X-linked recessiva
Il gene che dà la malattia è trasmesso dal cromosoma X: dalle ma dri passa ai
figli maschi e alle figlie, e dai padri alle figlie ma non ai figli maschi
– i maschi non affetti non hanno il gene che dà la malattia (non possono
essere portatori)
normale (X HY) x portatrice sana (XHXh )
– la madre di un figlio maschio affetto è portatore obbligato, a meno che il
figlio abbia una nuova mutazione
50% femmine, portatrici
– mutazioni nuove sono comune per molte malattie recessive X- linked
50% maschi, affetti
50% femmine, normali
50% maschi, normali
– tutte le figlie di un padre affetto ed il 50% delle figlie di na madre portatrice,
sono portatrici
– discendendo di generazione in generazione nell’albero genealogico sulla
linea femminile, il rischio di essere portatrice si dimezza ad ogni generazione
Qual è la probabilità di generare un figlio maschio affetto se il
padre è affetto?
8
Eredità XX-linked dominante
affetti (XBY) x normali (Xb Xb )
Eredità YY-linked dominante
100% femmine, affette
100% maschi, normali
affetti (X Y) x normali (X X)
100% femmine, normali
100% maschi, affetti
normali (Xb Y) x affette (Xb XB)
50% femmine, normali
50% femmine, affette
50% maschi, normali
50% maschi, affetti
9
Problemi sui caratteri
monofattoriali
1. Un individuo maschio normale sposa una signora che è portatrice di una malattia recessiva X -linked.
Dei figli che possono generare, è probabile che
A) Tutti i figli maschi siano affetti e tutte le figlie siano af fette
B) Tutti i figli maschi siano affetti e tutte le figlie siano portatrici
C) Nessun figlio maschio sia affetto e tutte le figlie affette
D) 1/2 dei figli maschi sia affetto, e tutte le figlie portatric i
E) 1/2 dei figli sia affetto, e 1/2 delle figlie siano portatric i
2. Qual è la probabilità di avere un figlio affetto se un genitore è affetto da una malattia recessiva e
l’altro genitore è portatore?
A) Vicino al 100% perché nuove mutazioni sono frequenti
B) 1/4
C) 1/2
D) 2/3
E) Praticamente zero
3. Se entrambi i genitori sono affetti da una malattia dominante con quale probabilità possono avere
un figlio normale?
A) Se entrambi i genitori sono eterozigoti per lo stesso gene, 1/4
B) Se entrambi i genitori sono omozigoti affetti, 1/2
C) Se entrambi i genitori sono eterozigoti per lo stesso gene,1/2
D) Se entrambi i genitori sono omozigoti affetti, 1/4
E) Se entrambi i genitori sono omozigoti affetti, 3/4
4. Se da un individuo maschio affetto e da una femmina normale non portatrice
nascono un figlio maschio affetto ed una figlia affetta, la malattia trasmessa è
probabilmente:
A) X -linkedrecessiva
B) X-linked dominante
C) Y -linked
D) autosomica dominante
E) autosomica recessiva
5. Una signora normale sposa un signore con fibrosa cistica. Il fratello della signora ha
anche lei la fibrosi cistica. Qual è la probabilità che i loro f igli abbiano la fibrosi
cistica?
A) 100%
B) 3/4
C) 2/3
D) 1/3
E) praticamente 0
6. Quando entrambi i fenotipi sono parzialmente espressi nello stato eterozigote, gli
alleli vengono definiti:
A) codominanti
B) dominanti
C) recessivi
D) normali
E) fenocopie
7. Un individuo maschio normale sposa una signora che è omozigote per una malattia X -linked
recessiva. Dei figli che potrebbero avere, è probabile che:
A) Tutti i figli maschi siano affetti e tutte le figlie siano af fette
B) Tutti i figli maschi siano affetti e tutte le figlie siano portatrici
C) Nessun figlio maschio sia affetto e tutte le figlie siano aff ette
D) Nessun figlio maschio sia affetto e tutte le figlie siano portatrici
E) Tutti i figli maschi siano affetti e metà delle figlie siano portatrici
8. Qual è la probabilità di avere un figlio affetto da un genitore non affetto ed un altro affetto da una
malattia autosomica recessiva?
A) ¼
B) 1/4 x 1/4 x 1/4
C) La probabilità del genitore non affetto di essere portatore x ½
D) Vicino al 100% a causa della frequenza di nuove mutazioni
E) 50% se il genitore non affetto è normale
9. I genitori di un figlio con una malattia autosomica recessiva:
A) Sono molto probabilmente omozigoti normali e la malattia fu c ausata da una nuova mutazione
B) Probabilmente hanno mutazioni in geni diversi, eterogeneità genica
C) Hanno più figli maschi affetti che figlie
D) Non sono a rischio di avere un altro figlio affetto
E) Eterozigoti obbligati
1
Simboli negli alberi genealogici
1. Qual è il tipo di trasmissione probabile di questo albero genealogico?
A) autosomico dominante
B) autosomico recessivo
C) X -linked dominante
D) X -linkedrecessivo
E) Y-linked
2. Qual è la probabilità che III-3 sia portatrice?
A) 100%
B) 75%
C) 50%
D) 25%
E) praticamente 0
3. Qual è il tipo di trasmissione genetica suggerito da questo albero genealogico?
A) autosomico dominante
B) autosomico recessivo
C) X -linked dominante
D) X -linkedrecessivo
E) Y-linked
4. Qual è la probabilità che un figlio di IV- 6 e di un individuo non consanguineo sia affetto dalla
malattia?
A) 100%
B) 75%
C) 50%
D) 25%
E) praticamente 0
4bis. Ha importanza conoscere il sesso di IV-9?
5. Qual è il tipo di trasmissione genetica suggerito da questo albero genealogico?
A) autosomico dominante
B) autosomico recessivo
C) X-linked dominante
D) X-linked recessivo
E) Y-linked
6. Qual è la probabilità che II-5 sia portatore?
A) 100%
B) 2/3
C) 50%
D) 1/3
E) praticamente 0
7. Qual è la probabilità che III-2 sia portatore?
A) 100%
B) 2/3
C) 50%
D) 1/3
E) praticamente 0
2
8. Qual è il tipo di trasmissione genetica suggerito da questo albero genealogico?
A) autosomico dominante
B) autosomico recessivo
10. Qual è il tipo di trasmissione genetica suggerito da questo albero genealogico?
A) autosomico dominante
C) X-linked dominante
B) autosomico recessivo
D) X-linked recessivo
E) Y-linked
C) X-linked dominante
D) X-linked recessivo
E) Y-linked
9. Qual è la probabilità che IV-3 abbia una figlia affetta?
A) 100%
11. Qual è la probabilità che III -13 sia affetto?
B) 75%
C) 50%
A) 100%
B) 75%
D) 25%
C) 50%
D) 25%
E) praticamente 0
E) praticamente 0
12. Qual è il tipo di trasmissione genetica suggerito da questo albero genealogico?
A) autosomico dominante
B) autosomico recessivo
C) X-linked dominante
D) X-linked recessivo
15. Qual è il tipo di trasmissione genetica suggerito da questo albero
genealogico?
A) autosomico dominante
B) autosomico recessivo
C) X-linked dominante
D) X-linked recessivo
E) Y-linked
E) Y-linked
16. Qual è la probabilità che IV-5 abbia un figlio maschio affetto?
13. Qual è la probabilità che IV-4 sia affetto?
A) 100%
A) 100%
B) 75%
B) 75%
C) 50%
D) 25%
C) 50%
D) 25%
E) praticamente 0
E) praticamente 0
17. Ha importanza conoscere il sesso di IV-6?
14. Ha importanza conoscere il sesso di IV-4?
3
18. Qual è il tipo di trasmissione genetica suggerito da questo albero genealogico?
A) autosomico dominante
B) autosomico recessivo
C) X-linked dominante
D) X-linked recessivo
E) Y-linked
21. Qual è il tipo di trasmissione genetica suggerito da questo albero genealogico se II-2 ha un
figlio maschio affetto e due figlie femmine normali?
A) autosomico dominante
B) autosomico recessivo
C) X-linked dominante
D) X-linked recessivo
19. Qual è la probabilità che II-5 sia portatore?
A) 100%
B) 2/3
C) 50%
D) 1/3
E) praticamente 0
E) Y-linked
22. Qual è la probabilità che II-4 e II-5 abbiano un altro figlio con la malattia?
A) 100%
B) 75%
20. Qual è la probabilità che III -4 sia portatrice?
A) 100%
B) 2/3
C) 50%
D) 1/3
E) praticamente 0
C) 50%
D) 25%
E) praticamente 0
SOLUZIONI DEGLI ESERCIZI
1
E
9
E
7
D
15
D
2
C
1
D
8
E
16
E
3
A
2
C
9
E
17
Si
4
D
3
C
10
A
18
B
5
D
4
C
11
C
19
A
6
A
4bis
si
12
B
20
B
7
B
5
B
13
D
21
A
8
D
5
A
14
no
22
C
4
Endonucleasi di restrizione
Enzimi che tagliano il DNA a doppia elica in siti specifici
Manipolazione del DNA
in genetica umana e medica
Corso di Genetica per la Facoltà di
Medicina e Chirurgia dell’Università
di Torino
Alberto Piazza
Blunt Ends=
Ends= estremità prive di estensione
Endonucleasi di restrizione
Sonde (probes
(probes)) molecolari
Reagenti usati per identificare una sequenza specifica di DNA o
RNA in un miscuglio complesso in cui è avvenuta una ibridazione
(accoppiamento di basi complementari tra il filamento singolo
della sonda ed il filamento singolo bersaglio di DNA o RNA). Le
sonde sono comunemente marcate da materiale radioattivo o
fluorescente.
Sonde cDNA- sequenze di DNA complementare a RNA
(originariamente prodotte mediante trascrizione inversa di RNA),
in grado di identificare sequenze di esoni (espressi)
Sonde oligonucleotidiche- sequenze di DNA prodotte
sinteticamente lunghe 14- 25 nucletidi
EcoRI non taglierà questa sequenza
Sonde RNA- RNA marcato in grado di identificare sequenze di di
DNA o RNA complementari
1
Southern Blotting (DNA)
Diagnosi della sindrome di
insensibilità …per mezzo
dell’analisi del Southern blot
Il DNA dal gel di agarosio è stato
trasferito su nitrocellulosa ed
ibridizzato alla sonda cDNA di un
recettore dell’androgeno. Si osservano
3 frammenti genomici nel DNA di
entrambi i genitori ma non in quello
del figlio.
Conclusione: Il recettore
dell’androgeno (AR) è X- linked . La
madre ha solo un gene AR intatto
(l’intensità delle bande è simile a
quella della padre). Il figlio ha ereditato
dalla madre il cromosoma X che ha
una delezione nel gene AR.
Mutazioni puntiformi
Polimorfismi del DNA
polimorfismi del DNA = differenze nella sequenza di DNA
–per definizione due o più alleli ad un locus la cui
frequenza nella popolazione è >1%
Due mutazioni puntiformi che cambiano la sequenza nucleotidica
EcoRI non è in grado di tagliare le due sequenze mutate
Il termine polimorfismo viene esteso ai casi di cambiamento
nella sequenza del DNA: negli RFLP per indicare differenze
nelle lunghezze dei frammenti di restrizione causate da perdita o
guadagno di siti di restrizione nel DNA, nelle delezioni o
inserzioni di DNA, nelle ripetizioni di gruppi nucleotidici nei
microsatelliti e minisatelliti, nelle ripetizioni di trinucleotidi, nelle
mutazioni puntiformi (SNP), etc.
2
Polimorfismi RFLP e Southern Blot
Diagnosi molecolare
dell’anemia falciforme
Si possono identificare solamente i frammenti di DNA che ibridizzano con
la sonda molecolare (probe
probe)
la sonda non ibridizza con il frammento MstII di 0.2 Kb
Analisi di un albero famigliare
mediante RFLP e Southern Blot
Polimorfismi VNTR e STR
I minisatelliti (VNTR, Variable Number of Tandem Repeats) sono lunghi
più di 12 basi
I microsatelliti (STR, Short Tandem Repeats) sono lunghi da 2 a 4 basi
Gli alleli A and B al
locus X differiscono per
il numero di ripetizioni
di minisequenze
(tandem repeats)
La sonda (probe) 1 – una sonda single-locus - identifica un
tratto di DNA esclusivo di un locus
in questa famiglia l’allele 2 è concatenato alla malattia
La sonda (probe) 2 –una sonda multiple-locus – identifica
tratti di DNA che si ripetono in più loci
3
Una famiglia tipizzata per un
polimorfismo VNTR
“DNA Fingerprinting”
per il test di paternità
Chi tra F1 e F2 è il padre biologico di C?
Sonde a molti loci con
molti alleli
Dal 5 al 10% dei figli hanno un padre
biologico diverso dal padre presunto
Analisi cariotipica spettrale
Ibridazione In Situ
Fluorescente (FISH)
24 sonde DNA
cromosomaspecifiche, ciascuna
marcata con una
combinazione
differente di 5
fluorocromi
Il “Northern blot” è una tecnica usata per determinare in quale
tessuto o tipo cellulare è espresso un gene, ed anche la
lunghezza e la quantità di mRNA. I livelli di mRNA sono spesso
correlati ai livelli di proteina presente nel tessuto.
4
Tecniche di laboratorio per la
diagnosi genetica molecolare
Analisi a bassa risoluzione
PCR: Reazione a catena della polimerasi
Metodo di amplificazione del DNA usando una polimerasi
termostabile quale la Taq DNA polimerasi, uno stampo di DNA, un
eccesso di primers e dideossinucleotidi (dNTP) in un buffer.
– Analisi cromosomica (del cariotipo)
– RFLP (restriction fragment length polymorphisms )
– Southern blotting - DNA
– Northern blotting - RNA
– Western blotting - proteine
– PCR (polymerase chain reaction) – amplificazione del DNA
Analisi ad alta risoluzione
– RFLP
– DNA Sequencing - determinazione dei nucleotidi
– PCR – amplificazione del DNA
PCR: Reazione a catena della polimerasi
PCR: Reazione a catena della polimerasi
5
PCR: amplificazione
n.ro cicli
n.ro sequenze bersaglio
1
0
3
2
10
256
15
8192
20
262.144
25
8.388.608
30
268.435.456
PCR/RFLP per l’analisi dell’anemia falciforme
La sequenza bersaglio è la
sequenza di DNA sintetizzata
tra i due primers
Occorre ~1µ
µ g di DNA per l’analisi di una sequenza o una digestione con enzimi di restrizione tali da poter
essere visibili in elettroforesi. Se vi sono ~5 pg di DNA/cellula umana (5x10 -12g) allora ~1 µµg of DNA
potrebbe essere isolato da 200.000 cellule ma avremmo un miscuglio di tutti i geni.
In 1 µµ g di DNA genomico, una copia singola di un gene (300 bp) equivarrebbe a ~0.1 pg di DNA.
Questo 0.1 pg di DNA potrebbe essere amplificato mediante PCR producendo 0.8 µµ g in 25 cicli e 27 µµ g in
30 cicli.
PCR/VNTR/STR in genetica forense
Sequenziamento del DNA (1):
strutture dei nucleotidi
Quale delle persone sospette può avere
commesso il crimine?
La tecnica PCR è utile, spesso
necessaria, per amplificare il DNA
estratto dai reperti trovati sulla scena del
delitto. Si usano sonde multi-locus con
molti alleli.
6
Sequenziamento del DNA (2):
il metodo di Sanger
Sequenziamento del DNA (3):
il metodo di Sanger
pozzetti
autoradiogramma
Il contenuto di ciascuna provetta viene caricato in 4 pozzetti separati di un gel di poliacrilammide
*
Indica il primer (lungo 15 nucleotidi)
** I dNTP sono ad una concentrazione 100 volte superiore di quella dei ddNTP in ciascuna provetta
Il Progetto Genoma Umano
Obiettivi
1. Costruire una mappa di marcatori genetici (polimorfismi)
polimorfismo – due o più alleli che si manifestano in una
popolazione con una frequenza maggiore dell’1%
- fino ad oggi sono stati identificati circa 2.165.000 SNP (Single
Nucleotide Polymorphisms) e 133.000 STS (Sequence Tagged
Sites, coppie di primers PCR), polimorfismi distribuiti nel genoma
umano
Si legga la sequenza man mano sintetizzata dal basso verso l’ alto. Il nucleotide G è il più
vicino al primer (* indica il primer (lungo 15 nucleotidi)) e l’estremità 5’ mentre il nucleotide
T è all’estremità 3’. 5’GCTCCACGTAACGT3’ Questa sequenza è complementare al filamento
stampo.
Esempio di mappa fisica
e genetica nel Genoma
Umano
STS
Notl STS
cM
Lungo tutto il genoma sono stati
identificati (2002) circa
2.165.000 SNP e 133.000 STS
Single Nucleotide
Polymorphisms (SNP
SNP)
- tali marcatori dovrebbero idealmente essere sufficientemente
vicini così che di ogni malattia ereditaria possa essere identificato
il gene o i geni responsabili
Sequence Tagged Sites (STS
STS)
(coppie di primers PCR)
2. Stabilire una mappa “fisica” della localizzazione dei geni in
relazione ad altri geni sui cromosomi
1 centiMorgan (cM
cM) = 2*106bp
Restriction Enzyme Sites (NotI
NotI)
3. Sequenziare l’intero genoma umano aploide di 3 x 109 bp
7
Il gene umano medio
Uno degli scopi del progetto Genoma Umano è di sequenziare le 3 x109 basi
nucleotidichedel genoma il cui numero di geni è stimato intorno a 40.000.
Il gene umano medio
Lunghezza
17.000 coppie di basi (17 kb)
Numero di esoni
7
Lunghezza dell’esone
100-200 nucleotidi
Lunghezza dell’introne
200- 2.000 nucleotidi
8