1. citochimica enzimatica

LOCALIZZAZIONE in situ DI PROTEINE
IN CELLULE E TESSUTI
1. CITOCHIMICA ENZIMATICA
CITOCHIMICA ENZIMATICA
CITOCHIMICA ENZIMATICA
Queste reazioni prevedono l’incubazione di cellule o tessuti in una soluzione contenente:
1. il substrato specifico per il sistema enzimatico oggetto di studio;
2. un tampone in grado di mantenere il pH ottimale per il sistema enzimatico;
3. qualsiasi cofattore necessario all’enzima;
4. una molecola in grado di rendere il complesso enzima-substrato insolubile e colorato
(“catturante o cromogeno”) in modo che sia visibile, al microscopio, nella sede specifica in cui
si trova in natura.
PR
X
S
X
I
E
E
E
CELLULA
+ CROMOGENO
X
CONTROLLI
E
1. omissione
2. inibitore
E
PRODOTTO DI
REAZIONE
- COLORATO
(=visibile)
- INSOLUBILE
- “in situ”
Istochimica enzimatica per localizzare
l’ enzima Fosfatasi alcalina (FA)
Sono fosfomonoesterasi che catalizzano l’idrolisi di esteri
dell’acido ortofosforico con attività ottimale a pH basico
FA
O
R-O-P-O-H
OH
+ HOH
O
R.OH
+
HO-P-O-H
OH
Si trovano in membrane cellulari implicate in processi attivi di trasporto
Nell’intestino tenue la Fosfatasi alcalina è nella membrana
apicale delle cellule epiteliali, a livello dei microvilli
REAGENTI reazione istochimica per FOSFATASI ALCALINA
Campioni = sezioni in paraffina
SOLUZIONE TAMPONE = Tris-HCl 0,1 M pH 9,2-9,4
MEZZO DI INCUBAZIONE
A
Naftil fosfato di sodio = substrato
Fast Blue B = catturante
B
Naftolo AS MX fosfato = substrato
Fast Red = catturante
N-N dimetilformamide = solvente del naftolo
MEZZO DI MONTAGGIO = PBS/Glicerolo 1:3
PREPARATO NON PERMANENTE
Protocollo reazione istochimica per FOSFATASI ALCALINA
1 Delimitare sezioni con matita vetrografica
2 Sparaffinare le sezioni e portarle all’acqua distillata con la
scala discendente degli alcoli
3 Lavaggio in tampone Tris-HCl 0,1 M pH 9,2-9,4 per 5 minuti
4
5
Incubazione nel mezzo di incubazione A o B,
preparato immediatamente prima dell’uso, per
3-15 minuti al buio e a temperatura ambiente,
in camera umida
Lavaggio in acqua distillata e
montaggio delle sezioni in PBS/glicerolo 1:3
MEZZO DI INCUBAZIONE A
(-> PRODOTTO DI REAZIONE NERO)
• Naftil fosfato di sodio: 1mg/ml in Tris-HCl 0,1 M, pH 9,2-9,4
• Fast Blue B : 1 mg/ml in Tris-HCl 0,1 M, pH 9,2-9,4
MEZZO DI INCUBAZIONE B
(-> PRODOTTO DI REAZIONE ROSSO e fluorescente)
• Naftolo AS MX fosfato: 0,5 mg/ml in Tris-HCl 0,1 M, pH 9,2-9,4
• Fast Red : 1 mg/ml in Tris-HCl 0,1 M, pH 9,2-9,4
• N-N dimetilformamide 0,05 ml
CONTROLLI
Sono possibili due tipi di controlli:
1. omettere il substrato nel mezzo di incubazione
(es. incubazione in solo Fast Blue B)
2. inibire preventivamente l’attività enzimatica mediante
preincubazione della sezione di controllo in un INIBITORE
SPECIFICO (L-fenilalanina 0,05M in tampone Tris-HCl 0,1
M, pH 9,2-9,4 per 10 minuti)
RISULTATI ATTESI
Cromogeno = FAST BLU
RISULTATI ATTESI
Cromogeno = FAST RED
APPLICAZIONI DELLA
CITOCHIMICA
ENZIMATICA
BIOPSIA MUSCOLARE
Muscolo
ago
GHIANDOLA MAMMARIA
PROSTATA
ENDOMETRIO
COLON
TONSILLA
LINFONODO