Metabolismo del glutammato in fettine di corteccia renale di coniglio

Metabolismo del glutamm ato in fettine di corteccia renale
di coniglio
MARIA ANTONIE'ITA
BUSELLU e
FRANCE SCO
POCCHIARI
Laboratori di Chimica biologica
Centro Internazionale di Chimica Microbiologica
È stato studiato il destino dell'acido l-glutammico uniformem ente marcato 14 C in fettine di cortecci a r enale di coniglio u sando una
t ecnica qu antitativa di radiocromatografìa su carta. L 'acido glutammico
viene trasformato in C0 2 , glutam mina, alanina, serina, glicina, acido asp artico e glucosio. La presenza d ello ione Ca ++ n el m ezzo di incubazione stimola
la formazione di glucosio d a glutammato. L'aggiunta eli glucosio non radioattivo com e cosub strato, m entre lascia inalterata la produzione di C02 e d egli
amminoacidi radioattivi, stimola enormem ente la formazione di glucosio
marcato, sia in assenza ch e in presen za d ello ione Ca++ .
Riassunto. -
Summary. (Glutamate metabolism in rabbit kidney cortex slices). The fate of 14 C gluta m ate in r abbit kidney cortex slices was followed quantitativ ely b y m ean s of the previousl y d escribed automatic scanning t echnique of paper r adiochromatogra m s (BELOFF-CHAIN et al. , 1955), in the presen ce and absence of non-radioactive glucose. The gluta mate disappearing from the m edium aft er 60 min of incubation was accounted for as C0 2 ,
glutamine, alanine, serine, glycine, aspar t at e and glucose. In a greement
with the findings of KREBS et al. (1963), the presence of calcium in the incub ation m edium incr eased the production of radioactive glu cose from glutamat e (Tabl e l) . The presencc of non-radioactive glucose as cosubstrate
considerably increased the conversion of glutamate into glu cose (Fig . l)
both in the ahsen ce an d in the presen ce of Ca ++ ions.
I ' TRODUZIONE
È noto ch e in fettine di corteccia r en ale l'acido glutammico v ien e osstd ato (KREBS, 1935) e trasformato in glucosio (RussELL & WILHELMI, 1941 ;
KREBS et al., 1963). La glucon eogen esi d ' altra parte è influenzata da v ari
fattori, quali la dieta (KREBS et al. , 1963), lo stato dell'animale (TENG, 1954 ;
FLINN, LEBOE UF & CAHILL, Jr., 1961) c la composizione ionica del m ezzo
di incubazione del t essuto (KREBS et al. , 1963) .
A nn. I st. Super. Sanità (1965) 1, 548·6b4.
È semh
cromatografì
Laboratorio
d ell'acido gh
cosio su tal(
Prodotti .
marcato uc
Bretagna).
Preparm
nutriti ad lib
l'esp erim ento
i r eni rapida
di Stadie Rif
di esp erienze
W arburg, cm
su ghiaccio .
mM ; NaCl 9f
& H ENDERSOJ
concentrazion
di 5,6 mM. f'
di carta da fi
vasch ette ven
a 370 C, e gass
di t essuto ven
HENSELEIT (l'
zione, le vasch •
Trattame1.
le misure della
nizzato con al
CHAIN et al. ,
Whatman l. J
m ente cromat•
guite n ei solvo
l) buta
2) fenol
In tali sol·
glucosio. La '
croma tografa n•
BUSELLU E POCCBlARI
teccia renale
549
È sembrato pertanto inter essante studiar e con la t ecnica della radiocromatografia quantitativa su carta precedentem ente sviluppata in questo
Laboratorio {BELOFF-CHAIN et al., 1955) il quadro m etabolico completo
dell'acido glutammico nella corteccia r enale di coniglio e l'influenza del glucosio su tale metabolismo.
PARTE SPERIMENTALE
Prodotti. - Acido l-glutammico (sale monoammonico) uniformem ente
marcato 14 C è stato ottenuto dal Radiochemical Centre, Amersham (Gran
Bretagna).
~lutammico
uni~lio usando una
do glut ammico
1.a, acido aspartbazione stimola
sio non radioat~ di co2 e degli
mc di glucosio
1rtex slices). followed quanscanning tech55), in t h e prelat e disappearted for as C0 2 ,
In agr eem ent
,um in t he incutcose from gluas cosubstrat e
;lucose (Fig. l)
n eo viene ossiILHELMI, 1941 ;
en zata da vari
e (TENG, 1954 ;
:1ica del m ezzo
(1965) 1, 54.8·51>4.
Preparazione del tessuto ed incubazione. - Sono stati u sati conigli adulti
nut riti ad libitum essenzialmente con crusca e aven a fino a 2 ore prima dell'esperimento. E ssi sono stati uccisi con un colpo alla nuca, dissanguati ed
i reni rapidamente tolti, decapsulati e m essi su ghiaccio. Con l'affettatore
di Stadie Riggs sono state eseguite fettine di corteccia r enale. In una serie
di esperien ze circa 200 m g di t essuto venivano m essi in una v asch etta di
Warburg, contenente 3 ml di un tampone di fosfato ' a pH 7,4 r affreddato
su ghiaccio. Il tampone aveva la segu ente composizione : Na 2 HPO, 17,5
mM; NaCl 98 mM; KCI 27 mM ; MgS0 4 1,2 mM; KH 2PO, 4 mM (ELLIOTT
& HENDERSON, 1948); l'acido glut ammico uniformem ente marcato 14C era alla
concentrazione di 6,7 mM. Il glucosio, quando presente, er a alla concentrazione
di 5,6 mM. Nel pozzetto centrale della vasch etta veruva posto un p ezzetto
di carta da filtro arrotolato ed imbevut o con 0,2 mi di NaOH al 30 %· Le
vasch ette venivano connesse ai manometri, post e in un b agno t ermost at ato
a 37° C, e gassate con 0 2 p er 5 min. In un'altra serie di esperienze circa 100 m g
di t essuto venivano incubati in 3 ml del tampone bicarbonato di KREBS &
HENSELEIT (1932) con 0 2 + C0 2 (95 : 5) com e fase gassosa. Dopo l h di incubazion e, le vasch ette, tolte dal bagno, venivano immediatamente pos te su ghiacc;o.
Trattamento del tessuto dopo incubazione, e preparazione dei campioni p er
le misure della radioattività. - Dopo l'incubazione il t essuto veniva om ogenizzato con alcool etilico al 60 % come precedentemente descritto (BELOFFCHAIN et al. , 1955) e l'estratto alcoolico ottenuto cromatogr afato su carta
Whatman l . Aliquote dei m eni eli incub<~ zione venivano anche esse direttam ente cromatografate su carta. L e cromat ografie bidimensionali erano eseguite nei solventi :
l) butanolo secondario : acido formico : acqua (75 : 15 : 15) ;
2) fenolo : acqua: ammoniaca concentrata d = 0,91 (80 : 20 : l)
In tali solventi non si separavano in m odo netto la glicina, la serina ed il
glucosio . La quantità di glucosio presente veniva pertanto determinat a
cromatogr afando i campioni in modo monodimensionale in butanolo t erA nn. I st. Super. Sanità (1965) 1, 548·554 .
550
ESPERIENZE E RICERCHE
+
ziario : acqua (80 : 20)
4 g di acido picrico; in questo solvente il glucosio
viene separato dagli ammino-acidi. Sottraendo la quantità di radioattività
del glucosio così determinata dalla macchia separata nella cromatografia
bidimensionale, contenente glucosio, glicina e serina, è stata ricavata la
quantità di glicina e serina. Per conoscere il rapporto in cui questi due metaboliti sono presenti, è stata eseguita una analisi cromatografica con l'analizzatore per amminoacidi Beckman Spinco secondo la tecnica di MooRE,
SPAKMAN & STEIN (1958). L e radiocromatografì.e su carta venivano esplorate con l'apparecchiatura descritta da FRANK et al (1959).
n r esiduo insolubile del tessuto dopo preparazione dell'estratto alcoolico era lavato due volte con lO ml di H 20 ogni volta, e trasferito su scodellino di alluminio. La radioattività veniva misurata con un contatore Geiger.
La C0 2 raccolta su NaOH durante il periodo di incubazione, v eniva precipitata come BaC0 3 e la sua radioattività determinata con un contatore
Geiger (BELOFF CHAIN et al., 1955).
RISULTATI
della glicim
dell'estratto
nella propo:
Tabella l s
l'estratto. l
HENSELEIT,
amminoacid
formazione
sia perchè ~
nel cromato
glucosio d et
sia perchè h
spondente a
Risultati ,
mg di tessuto,
Consumo di ossigeno e produzione di 14 C0 2 • -Nelle condizioni sperimentali usate, il consumo di ossigeno da parte di fettine di corteccia renale di
coniglio in presenza di glutammato è lineare p er 60 minuti di incubazione ed
ammonta a circa 110 fL moli/g di tessuto, peso umido/h . Il glucosio aggiunto
al mezzo di incubazione non ha alcun effetto su tale consumo.
La quantità di 14 C0 2 prodotta da glutammato 14C è di circa 90 fL moli/g
di tessuto, p eso umido per ora, due volte superiore a quella ottenuta incubando nelle stesse condizioni fettine di corteccia cerebrale di ratto (SELLINGER
et al. , 1962).
A differenza di quanto precedentemente osservato nel tessuto cerebrale,
n elle fettine di corteccia renale il glucosio non ha alcun effetto sulla produzione di 14 C0 2 da glutammato radioattivo.
sfato di ELLIC
(1932). Concen
tività totale :
presente : 0,1 '
Trasformazione dell'acido glutammico in amminoacidi. - I principali
amminoacidi formati dall'acido glutammico uniformemente marcato uc
sono in ordine di quantità d ecrescenti : glutammina, alanina, serina, glicina
ed acido aspartico (Tab. l). La glutammina, la serina, la glicina sono presenti quasi esclusivamente nel mezzo di incubazione, ed i valori riportati
nelle tabelle si riferiscono alle misure effettuate nei cromatogrammi su carta
dei mezzi di incubazione. La radioattività corrispondente a queste sostanze
presenti nei cromatogrammi degli estratti alcoolici non è stata considerata
perch è in quantità troppo piccola per una misura significativa ; mediante
cromatografia su r esina a scambio ionico si è potuto separare la glicina dalla
serina e stabilire che la quantità di serina formata è quattro volte quella
glutammin a
.dnn. I st. Super. Sanitd (1965) 1 , 548·554.
ID~ZZO
DJ
PRODOTTO
ZIO NE:
acido asparl
serina
+ gli·
aJanina
glucosio
acido glutan.
C02
•••
•
0 2 f.t moli/ 2!
umido/h .
• Dilferen:
UUSELLU E POCCH!Ant
ttc il glucosio
radioattiv ità
~romatografìa
ricavata la
sti due m etacon l'analizdi MooRE,
tivano esplot
;tratto alcooito su scodelatorc Geiger.
veniva preciun contatore
55 1
d ella glicina. L 'acido aspartico è stato det ermin ato solo n ei crom atogrammi
dell'estratto d el t ess uto ; l'alanina è p resente sia n el m ezzo ch e n ell'estratto
n ella proporzione di circa 2 : l. Il valore dell'acido glutammico dato nella
Ta bella l si riferisce ovviamente solo all'acido gl utammico presente nell'estratto. La presen za dello ione calcio nel m ezzo di inc uba zione (KR EBS &
H E SEL E I T, 1932) non sembra a vere alcun effetto sulla formazione d egli
amminoacidi da glutamm ato. Una probabile influenza potrebbe esserci sulla
formazione della serina c glicina, ma è difficile speculare sui valori ottenuti ,
sia pcr ch è sono st ati ricavati sottraendo dalla radioatti vità corrispondente
n el cro matogramma b idimen sionale alla serin a, glicina e glucosio, quella d el
glucosio d et erminato in un altro cromatogramma (vedi p arte sperim entale),
sia p erchè la zona radioattiva non era ben se parat a da quella adiacente corrisp ond ente all' acido glutammico.
T ABELLA
l.
Influenza de l glucosio sul m etabolismo de ll'acido gluta mmico
in fe ttine di corteccia r enale di coniglio
mi sperim en·cia r enale di
cub azione ed
osio aggiunto
t 90 f.L moli/g
ttenuta incu-
Risu ltati espressi in 11-g di acido g lutammico tras formato (o rimasto inalterato) p er 200
mg di tessuto, peso fresco, dopo incubazione per l h a 370 C in 0 2 in 3 ml di tampone fosfato eli E LLIOTT & H E DERSON (1948), O di quello bicarbonato di KREBS & H ENSELEIT
(1932). Concentrazione dell'acido glutammico uniformemente m arcato 14C : 0,1 %, radioattività totale : lO 11-C per vaschetta. Concentrazione del glncosio non radioattivo, quando
presente: 0,1 %. Valori medi d i IO esperienze ± err ore standard.
Tnmpoue fosrnto
~mzz o
D l INCU JJAZIONE
SC OZI\ g l UCOSiO
J (SELLINGER
tto cerebrale,
sulla produ -
PRODOTTO DI T R ASFORMA ZIO N E:
acido aspart ico
I pr incipali
marcato 14C
erina , glicina
1a sono pretori ri portati
nmi su carta
est e sos tanze
consider a t a
a ; mediante
glicina d alla
volte quella
!65) 1. 54 8·554.
(11-g ac. glut ammico)
l
COli glUCOS i O
T am pono bicarbonato
~~Senza
g l UCOSiO
(11-g ac. glu- JI (11-g ac. glutammico) l t ammico)
l
COn glUCOS i O
(11-g ac. glutammico)
l
11 ± 2
9± l
18 ± 2
14 ::!:: l
187 ± 29
175 ± 18
194 ± 24
182 ± 26
81 ± 13
58 ±. 3
4.3 ± 11
59 ± 10
alani nn
112 .:l: l
88 ± 11
113 ± 20
96 ± 9
glucosio
tracce
83 :t: 17
143"'± 22
290 ± 32
244 ± 41
glutammin a
serina
+ glicina .
218*± ]]
acido glutammico
295 :!-_ 33
24·6 ± 17
C0 2
537 ± 24
549 ± 8
22 , 4 ± 1 ,0
22, 7± 0, 5
•
'
l
-
-
-
-
0 2 11- rnoli/ 200 mg tessuto-peso
umido/ h
l
• D ifl'ercnzn significativa : P < O,Ol.
A nn. / st. Super. Sw lità (1065) 1. 548-55<1.
552
ESPERIENZE E RICERCHE
Il glucosio, in accordo con quanto precedentemente trovato da KREBS,
non ha alcun effetto sulla formazione di glutammina (KREBS, 1935), nè sulla
quantità di acido glutammico intracellulare, al contrario di quanto osservato
n elle fettine di corteccia cerebrale (STERN et al. , 1949; SELLINGER et al., 1962).
Gluconeogenesi. -La quantità di glucosio formato da acido glutammico
in un m ezzo di incubazione di fosfato esente da ioni Ca++ , è molto scarsa,
dell'ordine di circa 10-20 p.g/ 200 mg di tessuto, peso fresco/h. In un m ezzo
contenente ioni Ca++ invece, in accordo con quanto precedentemente trovato
da KREBS et al. (1963) n elle fettine di corteccia r enale di ratto incubate con
lattato o fumarato, si ha un notevole aumento della quantità di glutammico
trasformato in glucosio ch e raggiunge 83 p.g per 200 mg di t essuto p eso fresco.
In presenza di glucosio non radioattivo, in assenza o in presenza dello ione
Ca ++, la gluconeogenesi da glutammato aumenta enormemente raggiungendo
il valore di circa 220 p.g/200 mg di tessuto/h. Il glucosio radioattivo che si
forma è presente quasi esclusivamente nel m ezzo di incubazione. La quantità
di glucosio formato da glutammato dipende dalla quantità di glucosio non
radioattivo presente nel mezzo di incubazione : è direttamente proporzionale
alla quantità di glucosio aggiunta fino alla concentrazione dello 0,05 % e
poi cresce più lentamente con l'aumento della concentrazione del glucosio
nel mezzo (Fig. l).
Residuo insolubile. - Nel r esiduo insolubile sono state trovate soltanto
tracce di radioattività, il che indica che nelle condizioni sperimentali usate
il glutammato non è incorporato in gran quantità nè nelle proteine nè nel
glicogeno.
La qua1
mezzo di ii
KREB S et al.
concentrazio
gluconeogen<
Il gluco
sulla formazi
cellulare in a
Esso inoltre
che non av
guardo è into
trovato che l
effetto sulla
Il glucosi
tammato sia
riguardo nota
T ENG, 1954;
renale di ratt
quella osserva
rità del diab e
In ques te
coneogenesi d
della concentr
DISCUSSIONE
É
Il glutammato è un attivo metabolita della corteccia r enale. Dopo una
ora di incubazione esso viene utilizzato per circa il 40 % e m etabolizzato
in C0 2 , glutammina, alanina, serina, glicina, acido aspartico e glucosio. La
notevole formazione di glutammina è in accordo con quanto precedentemente
trovato da KnEBS (1935) ; la produzione di alanina da glutammato marcato,
indica che nella corteccia r enale l'acido piruvico che si forma viene transaminato piuttos to ch e esser e ridotto ad acido lattico. La presenza del glucosio
non stimola la formazione dell'acido lattico. La piccola quantità di acido
aspartico radioattivo indica una rapida utilizzazione dell'acido ossalacetico,
sia attraverso il ciclo degli acidi tricarbossilici (e questo determina un'alta
formazione di 14C02), sia attraverso la formazione di acido fosfopiruvico
quando nel m ezzo di incubazione è presente o lo ione Ca++ o il glucosio. La
serina può formarsi dall'ossipiruvico ad opera dell'ossipiruvico-transaminasi
presente n el t essuto renale (SALLACK , 1955). Dalla serina può derivare poi la
glicina in accordo con quanto precedentem ente dimostrato da SHEMIN (1946)
con l'uso di glicina m arcata 14 C nel carbossile e 15N n el gruppo amminico.
Ann. Jst. Super. Sanità (1965) 1 , 548 ·554 .
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e del glucosio
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mentali u sate
~o t eine nè n el
La quantità di glucosio radioattivo formato da glutammato è dovuto al
mezzo di incubazione usato : infatti, come a mpliament e dimostrato da
KREBS et al. (1963), l'assenza dello ione Ca++ e la presenza del fosfato ad una
con centrazione superiore allo 0,01 molare inibiscono considerevolmente l a
gluconeogen esi.
Il glucosio aggiunto al m ezzo di inc ub azione non ha al cun effetto nè
sulla formazione di glutammina, nè sulla quantità di acido glutammico intracellulare in accordo con quanto p r ecedent emente trovato da KREBS (1935).
Esso inoltre non ha effetto sulla produ zione di C0 2 , il ch e potrebbe indicare
che non avviene n essuna diluizione al livello dell'acido piruvico. A tale riguardo è inter essante ricordar e che LEE, VERNON & CAHILL (1962) hanno
trovato che il glucosio aggiunto al mezzo di incubazione non aveva alcun
effetto sulla ossidazione del piruvato.
Il glucosio invece stimola in modo considerevole la gluconeogen esi da glutammato sia in assenza ch e in presenza di ioni Ca++ ; è interessante a questo
rigu ardo notare ch e da vari autori (FLINN, LEBOEUF & CARILL, Jr., 1961 ;
TE NG, 1954 ; LANDAU, 1960) er a stat o trova to ch e in fettine di corteccia
r en al e di r atto dia b etico la sintesi di glucosio da piruvato era maggiore di
quella osservata in fettine di corteccia renale di ratto normale, e ch e l a severità d el diabete era un fattore important e nello stimolare l a glucon eogen esi.
In queste esp eri en ze si è dimostra to che l 'effetto del glucosio sulle gluconeogen esi da glutammato non è catalitico ed aumenta con l'aumentare
d ella concentrazione del glucosio nel m ezzo di incub azione (Fig. l).
E
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me tabolizzato
glucosio. La
c eden temente
1at o marcato,
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l glucosio. L a
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Conc. del glucosio nel mezzo
F ig. l. - Influenza delle concentrazioni del
glucosio nel mezzo di incubazione sulle gluconeogenesi da glutammato in fettine di corteccia renale di coniglio. - La quantità di
glucosio radioattivo fo rma to da glut ammato
uniformemente marcato 14C è espressa in
colpi per minuti (c.p.m.) per 200 mg di tessuto (peso fre sco). Ogni punto rappresenta il
valor e medio di due esperienze.
%
Rimane ancora da studiare su quale stadio d ella glucon eogenesi ha effetto il glucosio e se il suo effetto è correlato o m eno con quello d ello ione Ca ++.
È interessan te infine ricordare ch e il glucosio nelle fet tin e di corteccia cer ebrale à i ratto, t essut o essenzialmente glicolitico, stimola considerevolm ente
la produzione di acido la ttico da piruvico (BELOFF-CHAIN et al., 1962).
A nn. I st. Supe·r. Sanitd (1965) 1, 548·554.
554
ESPER IENZE E RICERCHE
Ringraziamenti . - Gli autori desiderano esprimere il loro ringraziam ento al Prof. E. B. Chain, per gli autorevoli consigli avuti n el corso del
lavoro ; ai Proff. L. Tentori e G. Vivaldi per le analisi cromatografiche degli
amminoacidi effettuate con l'analizzatore Beckman Spinco; ai Sigg. G. Cer velli e G. Ri cciarello per l' apprezzata assistenza t ecnica.
Sulla N-be1
20 novembre 1964.
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Ann. I st. S1.per. Sanità (1 965) 1, 5 48 -554.
Riassun
l'acido 2,3-cl
ottiene per 1
2,3-crunossaliJ
l'anidride del
con il dicloru
di PCl5 sull'a
Summa1
dicarboxy lic a
carboxylic aci
The first
and b enzylarr
of benzylamÌJ
duct through
The seco
through a r e.
•ro ringrazia nel corso del
grafiche degli
igg. G. Cer-
Sulla N-benzil-immide dell'acido 2,3-chinossalin-dicarbossilico
ADRIANA CESARI
Laboratori di Chimica
t
F. PoccHIARl,
lism in r at cere-
C. Rossi, 1955.
phragm musclr.
md suspensions
beled substrat es
/. Ph.rsiol., 200,
tomatic scanner
'elected Sci. P auni ne from glua nima1 tissu es.
Riassunto. - Si descrivono due sintesi della N -benzilimmide dell' acido 2,3-chinossalin-dicarbossilico. Nella prima la N-benzilimmide si
ottiene per riscaldamento con SOCI2 della monobenzilammide dell' acido
2,3-chinossalin-clicarbossilico, ottenuta per azione della benzilammina sull'anidride dello st esso acido. Nella seconda si fa r eagire la b enzilammina
con il dicloruro dell'acido 2,3-chinossalin-dicarb ossilico preparato per azione
di PC1 5 sull' acido.
Summary. (On the synthesis of N -benzylimide of quinoxaline-2,3dicarboxy lic acid). - Two syntheses of N -ben zylimide of quinoxaline 2,3-dicarboxylic acid (l) are described.
1963. Renal
t -kid ney c ortex
lA ,
ildu ng im Tier;id ney i11 vitro.
lelcd substra tes
o acid s on sullrena lect omized
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•olism of gluta '• 148-162.
'·· 162, 297-307.
ion of gluta mic
Arch. Biochem.
l65) 1 . 548-554 .
The first one is based on the r ea ction b etween quinoxaline anhy drid e
and b enzylamine followed by treatment (hot) with H Cl of the obtained salt
of benzylamine. Thc obtained monob enzylamidc (II) givcs the r equired product through a r eaction with SOCI2 and CHCl3 •
/""' / N '\_/ CONH-R
l
Il
J
~/~""COOH
(Il)
The second synthesis, which is impaired by its low yield, is r ea ched
through a r eaction of benzylamjne with quinoxaline-2,3 dicarboxylic acid
A nn. I st. Supe>·. Sauitti (196.1) 1 . 555·559.
556
ES PE RIE NZE E RlCERCIIE
dichloride. The latter was prepared by action of PC15 on the corresponding acid.
R ecentem ente è stato dimostrato che alcune ftalimmidi N-sostituite
possono provocare effetti sfavorevoli sulla gravidanza del ratto simili a
quelli osservati con la Talidomide (BIGNAMI et al., 1962) Consegu entem ente,
è parso interessante verificare se tale azione sta particolare delle ftalimmidi sostituite o possa esser e causata anche da immidi cicliche di acidi
bicarbossilici eterociclici.
A questo scopo fu scelta la N-benzil-immide dell'acido 2,3-chinossalindicarbossilico (I, R = CH 2 -C 8H 5 ) la cui sintesi fa oggetto della presente
nota.
Come prodotto di partenza per t ale sintesi fu preparata la monobenzilammide dell' acido 2,3-chinossalin-dicarbossilico (II, R = CH 2 -C 8 H 5 ) , non
ancora nota e da noi facilmente ottenuta per azione della ben zilammina
sull' anidride dello st esso acido.
Dopo diversi tent ativi si è vis to che la N -benzil-immide può esser e
ottenuta con resa pressochè t eorica p er riscaldam ento della m onoammide (II, R = CH2-C6H 5 ) con d ocuro di tionile oppure con ossicloruro di
fosforo.
In precedenza si era cercato di preparare l'immide (I, R = C~-C 6 H5 )
facendo r eagire la benzilammina con il dicloruro dell'acido 2,3-chinossalin-dicarbossilico ; quest ' ultimo, non ancora noto in letteratura , fu facilm ente preparato p er azione del p entacloruro di fosforo sull'acido corrispondente . Con ques ta via di sintesi, tuttavia , la b enzil-immide d esiderata fu
ottenuta con r ese scarsissime, il prodotto principale della r eazione essendo
la dib enzil-ammide dell'acido 2,3-chinossalin-di carbossilico.
Un altro t entativo di effettuare la chiusura dell'anello immidico p er riscaldamento n el vuoto della monobenzil-ammide dell'acido 2,3-chinossalindicarbossilico non diede l'attesa immide, b en sì la N-b enzil-ammide dell'acido
chinossalin-2-carbossilico (III, R = CH2-C6H 5) .
La · facile decarbossilazione dell'a cido (II, R = CH 2-C 8 H 5 ) non era di
per sé imprevedibile, tuttavia essa apparve in contrasto con quanto descritto
da CHATTAWAY e H uMPHREY (1929) per la pr eparazione dell'immide dell'acido
2,3-chinossalin-dicarbossilico (I, R = H) da essi ottenuta per riscaldam ento
a secco ad alta t emperatura d ella monoammide dello stesso acido (II, R = H).
In realtà, si riscontrò che il riscald11m ento n el vuoto di t ale monoammide
da esclusiv amente la 2-carbossiammido-chinossalina (III, R = H), la
decarbossilazione essendo anch e in questo caso la r eazion e preferita. La decar A nn. I st. Super. Sanità (1 965) 1 , 555 ·559.
bossilazione di
bossilico (PIUTé
Monoben
Grammi 9.
alcool assoluto,
Dopo aver scal
la soluzione al<
subito un b el 1
di b en zilammin
dibenzil-ammid·
prodotto gr ezz<
benzilammina I
Analisi:
per
c2
La struttm
il medesimo a
!oncino munito
nella r eazione.
un prodotto sol
ammide pura, <
Il sale di l
sciolto a caldo i
dibenzil-ammid<
acquosa calda "
557
CESARI
the corr espon-
bossilazione di monoammidi e monoesteri dell'acido 2,3-chinossalin-dicarb ossilico (PIUTTI & MARINI, 1936) sembra d'altra parte assai generale.
di N -sostituite
ratto simili a
>egu entemente,
: delle ftalim~lichc di acidi
(l)
(II)
~.3-chinossalin­
della presente
(III)
la monobenzilH 2-C 6H5), non
b enzilammina
PARTE SPERIMENTALE
Monobenzil-ammide dell'acido 2,3-chinossalin-dicarbossilico. (II)
de può esser e
ella monoamossicloruro di
t
=
CH2 -C6 H5)
:lo 2,3-chinosttui·a, fu facil~ido corrispondesiderata fu
:tzione essendo
Grammi 9,5 di anidride chinossalinica vengono sosp esi in 300 ml di
alcool assoluto, si scalda a ricader e e si aggiungono g 16 di benzilammina.
Dopo aver scaldato a ri cadere p er un'ora, si concentra a pressione ridotta
la soluzione alcoolica ; il residuo viene ripreso con acqua e et ere. Si separa
subito un bel prodotto cristallino (g 12) costituito essenzialment e dal sale
di b enzilammina dell'acido 2,3-chinossalin-carbossiammidico (II) e da poca
dibenzil-ammide dell'acido 2,3-chinossalin-dicarbossilico. Un campione del
prodotto grezzo così ottenuto per cristallizzazione da acetone dà il sale di
b enzilammina puro, con p. f. 182-184o.
Analisi:
midico per ri.,3-chinossalinnide dell'acido
non era dì
tanto descritto
nide dell'acido
riscaldamento
o (II, R = H).
monoammide
R = H), la
rita. La decar-
· 5)
1965) 1, 555·559.
per C24H 22N 40 3
trov .%
cale.
c
69,71;
69,55;
H
5,27;
5,35;
N 13,72 ;
13,52 .
La struttura del sale di b en zilammina è stata confermata sciogliendo
il m edesimo a caldo in xilolo c scaldando la soluzione xilenica in un palloncino munito di una colonnina in modo da allontanare l' acqua che si forma
nella r eazione. Terminato il riscaldamento, per raffreddamento si separa
un prodotto solido che, dopo cristallizzazione da alcool, fornisce la dibenzilammide pura, con p. f. 190-192°.
Il sale di benzilammina ottenuto come prodotto della reazione viene
sciolto a caldo in acqua, filtrato da poco prodotto insolubile (risultato essere
dib enzil-ammide dell'acido 2,3-chinossalin-dicarbossilico) e la soluzione
acquosa calda viene acidificata con HCL Si ottengono così g 10,5 di monoAnn. 1st. Super. Sanità ( 1965) 1, 555·559.
558
E SPERIENZE E RICER CHE
benzil-ammide dell'acido 2,3-chinossalin-dicarbossilico, che ricristallizzata
da alcool, fonde a 1720 con decomposizione.
Analisi:
trov.%
p er Ct,Ht aN aOa
C 66,60;
cale.
H
66,44;
4,39;
N 13,68;
4,26;
13,68.
N-benzil- immide dell'acido 2,3 -chinossalin-dicarbossilico. (I)
Grammi 6,5 di monobenzilammide dell'acido 2,3-chinossalin-dicarbossilico vengono trattati con SO cm 3 di SOC1 2 • Dopo 30' si aggiungono 300 ml
di CHC1 3 e si scalda a ricadere sino a completa dissoluzione. Si concentra
poi la soluzione a pressione atmosferica sino ad incipiente cristallizzazione.
Dopo raffreddamento in ghiaccio, i cristalli vengono filtrati alla pompa,
lavati due volte con poco CHC1 3 ghiacciato. Resa g 4,8 di prodotto praticament e puro, p. f. 270-272o.
Un campione ricristallizzato da benzolo mostra p. f. 270-272°.
Analisi:
trov.%
per C1 ,H 11N a02
C 70,23;
cale.
H
70,58;
3,72;
N 14,57;
3,83;
14,53.
Dalle acque cloroformiche per concentrazione si recupera cu ca l g di
prodotto lievemente impuro.
Pirolisi della monobenzil-ammide dell'acido 2,3-chinossalin-dicarbossilico.
Riscaldando p er l ora in xilolo la monobenzil-ammide ed evaporando
poi il solvente nel vuoto, si ottiene un solido cristallino insolubile negli alcali
caustici. Dopo due cristallizzazioni da alcool m etilico si ottengono cristalli
di b enzilammide dell' acido 2-chinossalin-carbossilico, con p. f. 150-152°.
Analisi:
per
cl GH ! aN 30
trov.%
cale.
C
72,90;
H
72,98;
5,16;
N 15,84;
4,98 ;
15,96.
Grammi 3,9
si m escolano inti
mente a l850, t e
rapidamente a l ~
dopo di ch é la rr
a pressione ridot1
Si ottengono cos:
Analisi:
per C 10I
Dibenz
Ad una solu:
silico in 15 ml d
lieve ebollizione ~
provoca immedia
terminata l'aggiu
filtra, lavando pc
drato di b enzilan
con p. f. l870. P
pura, con p. f. l
Analisi:
per C24 I
n filtrato be
mide, dopo conceJ
lavati con et er e €
di b enzil-immide
Analisi:
Pirolisi della mono-ammide dell'acido 2,3-chinossalin-dicarbossilico.
Grammi 2 di monoammide dell'acido 2,3-chinossalin-dicarbossilico
(CHATTAWAY & H uMPHREY, 1929) vengono riscaldati nel vuoto a 185°
p er 20 minuti e poi a 205° per altri lO minuti: si ottiene così una massa
vetrosa colorata in bruno che per dissoluzione in acido acetico e trattamento con carbone animale, dà per cristallizzazione con buone r ese l'ammide dell' acido chinossalin-2-carbossilico, con p. f. 198°.
Analisi:
per C9 H,N 3 0
trov.%
cale.
C 62,56;
62,43 ;
H
4,25;
4,07;
N 24,44;
24,27.
Ann. I st. Snper . San·ità (1965) 1. 555·559 .
per C1 ,I
30
novembr
G., D. Bo•
F. D. 8
P. & G. B. l
BIGN AMI,
CRATTAWAY,
PIUTTI,
559
CESARI
Cloruro dell'acido 2,3-chinossalin-dicarbossilico.
ricristallizzata
1;
N 13,68;
13,68.
:o. (I)
salin-dicarhosngono 300 ml
. Si concentra
istallizzazione.
i alla pompa,
rodotto prati'0-272°.
N 14,57;
14,53.
1
cuca l g di
;carbossilico.
d evaporando
ile n egli alcali
1gono cristalli
150-1520.
15,84;
15,96.
·bossilico.
·dicarhossilico
ruoto a l8So
sì una massa
etico e trat>ne rese l'am-
Grammi 3,9 di :midri de chinossalinica (CHA'l'TAWAY & HUMPHREY, 1929)
si mescolano intimamente con g 4 ,2 di PCI 5 e la miscela si scalda gradualmente a 185°, t emperatura alla quale ha inizio la reazione; si raffredda
rapidamente a 150° e si mantiene la r eazione a questa temperatura per 3 ore,
dopo di ché la massa di reazione appare tutta liquida . Si elimina il POC1 3
a pressione ridotta e si cristallizza da ligroina la massa cris tallina r esidu a .
Si ottengono così g 3 di dicloruro, con p. f. 85-87o.
Analisi:
per C10H.Cl 2N 2 02
trov. %
C
cal e.
47,31;
H
47,07;
1,80;
N
1,56;
ll,Ol;
10,98.
Dibenzil-ammide dell'an do 2,3 -chinossalin-dicarbossilico.
Ad una soluzione di g 2,5 di cloruro dell'acido 2,3-chinossalin-dicarhossilico in 15 mi di benzolo anidro si aggiungono lentamente e scaldando a
lieve ebollizione g 3 di b enzilammina sciolti in 50 m! di benzolo. L'aggiunta
provoca immediata formazione di un precipitato che aumenta col tempo;
terminata l' aggiunta, si scalda su h. m . per mezz'ora, indi si raffredda e si
filtra, lavando poi il precipitato sul filtro con acqua per eliminare il cloridrato di h enzilammina. Si ottengono così g 2,6 di dihem:il~mmide grezza,
con p. f. 187°. Per cristallizzazione da alcool si ottiene la dihenzil ammide
pura, con p. f. l90-l92o.
Analisi:
per C24 H 20N 402
trov. %
C
cale.
72,79;
H
72,71;
5,19;
N 14,31;
5,09;
14,14 .
n filtrato benzenico da cui si era inizialm ente separata la dihenzilammide, dopo con centrazione a pressione ridotta, lascia dei crist alli che vengono
lavati con etere e poi cristallizzati da poco benzolo. Si ottengono così g 0,2
di henzil-immide dell'acido 2,3-chinossalindicarhossilico, con p . f. 276°.
Analisi:
per C1 7H 11N 3 02
trov. %
cal e.
C
70,85;
70,58;
H
4,01;
N
3,83;
14,42;
14,53.
30 novembre 1964.
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CHATTAWAY,
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24,44;
24,27.
l 965) 1. 555·5 59 .
PIUTTI ,
Ann. 1st. Super. Sanità (1965) 1. 5 55 ·559.