Individuare il virus

Individuare il virus
Le tecniche di rilevazione del virus forniscono un indicatore utile della malattia, sebbene alcune (essendo
laboriose, costose e lente) siano utilizzate essenzialmente come strumenti di ricerca. Un esempio è
rappresentato dall’isolamento virale, che utilizza linee cellulari specifiche per amplificare i virus ottenuti da
campioni di tessuto, attraverso un processo di infezione e replicazione. Un altro esempio è costituito dalla
microscopia elettronica, che può svolgere un ruolo importante nella caratterizzazione di nuovi ceppi non
riconosciuti mediante approcci molecolari o anticorpali specifici. Sono ora di uso comune nuove tecniche, rapide
e meno costose (descritte in seguito), che risultano più pratiche per la diagnosi tempestiva di routine.
Reazione a catena della polimerasi con trascrittasi inversa
La reazione a catena della polimerasi con trascrittasi inversa (RT-PCR) è un metodo rapido, altamente sensibile
e specifico utilizzato per rilevare il PRRSv in svariati tessuti (fra cui siero, seme, fluidi orali, polmone, feti,
linfonodi, milza e tonsille), nonché in campioni ambientali. Il processo prevede l’estrazione dell’RNA virale dal
campione biologico, la conversione in DNA mediante trascrittasi inversa, l’amplificazione mediante PCR e la
rilevazione del DNA amplificato.
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Uno svantaggio della RT-PCR è costituito dal fatto che la finestra per la rilevazione del virus dopo l’infezione
risulta diversa sia da un tessuto campionato all’altro che da un animale all’altro. Negli animali giovani e negli
animali mai venuti a contatto con il PRRSv, l’infezione determina cariche virali rilevabili più elevate e più durature
rispetto agli animali maturi. Inoltre, l’elevata sensibilità della RT-PCR può determinare risultati falsi positivi dovuti
alla contaminazione, mentre la specificità dei primer può determinare risultati falsi negativi per alcuni virus che
presentano diversità genetica. Poiché questi dati possono influire in maniera significativa sulle decisioni
riguardanti la gestione dell’allevamento, è opportuno, effettuare test secondari dei campioni con l’ausilio di
strategie alternative. La RT-PCR non è inoltre in grado di distinguere fra virus di campo (wild type) e virus
attenuato.
Immunoistochimica
L’immunoistochimica (IHC) viene utilizzata unitamente alla microscopia per rilevare il PRRSv nei tessuti
provenienti da diverse sedi, fra cui polmone, linfonodi, timo, tonsille, milza e rene. Generalmente, i tessuti
vengono dapprima fissati in formalina (sebbene si possano utilizzare anche tessuti freschi) e quindi marcati con
anticorpi monoclonali che hanno come bersaglio il nucleocapside virale. Questi vengono visualizzati utilizzando
un anticorpo secondario tracciato. L’IHC, pur avendo un’elevata specificità (100%), mostra una sensibilità
soltanto modesta (67%), che può però essere migliorata lavorando i tessuti entro 48 ore dalla fissazione. La
sensibilità è massima nei primi stadi dell’infezione, ma diminuisce progressivamente durante gli stadi successivi,
come per esempio oltre 28 giorni post-infezione (DPI), quindi l’immunoistochimica non è raccomandata dopo 90
giorni DPI. Pur essendo efficace nell’individuare il virus trasmesso verticalmente nei suinetti, l’IHC può non
essere efficace per alcuni isolati che presentano diversità genetica.
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Colorazione a immunofluorescenza
La colorazione a immunofluorescenza (FA), usata generalmente per la valutazione di BAL o di tessuto
polmonare fresco/congelato, è oggi utilizzata di rado. Con questa tecnica, i campioni vengono marcati
direttamente con anticorpi fluorescenti per visualizzare i nucleocapsidi. Questo processo risulta più veloce e più
economico rispetto all’IHC per misurare il PRRSv, ma, come per l’IHC, può non rilevare isolati che presentano
diversità genetica e non è raccomandato negli ultimi stadi dell’infezione. Inoltre, i falsi positivi possono
rappresentare un problema, a causa della scarsa specificità dell’anticorpo primario o dell’elevata colorazione di
fondo. In entrambi i casi, l’ideale è confermare i test positivi con l’ausilio della RT-PCR (o dell’isolamento virale).
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Test su striscia di campo
I test su striscia di campo sono uno sviluppo relativamente nuovo nella diagnostica del PRRSv e, sebbene non
siano ancora di uso comune, possono potenzialmente offrire una rilevazione rapida e comoda del PRRSv senza
la necessità di competenze o apparecchiature specialistiche. I test su striscia di campo rilevano il virus nel siero
o in omogenati tissutali mediante immunocromatografia. I campioni vengono mescolati ad anticorpi monoclonali
marcati con oro che hanno come bersaglio specifiche proteine del PRRSv, formando complessi proteinaanticorpo che vengono catturati sulle strisce. I complessi catturati vengono poi rilevati con l’ausilio di un
anticorpo secondario marcato. In alcuni studi condotti in Cina, i test su striscia hanno dimostrato una sensibilità
superiore al 93% e una specificità superiore al 96%, sebbene siano disponibili dati aggiornati soltanto per una
gamma limitata di virus.
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