La Trascrizione Trascrizione nei Batteri La Trascrizione Trascrizione

La Trascrizione nei Batteri
DIFFERENZE TRA PROCARIOTI ED EUCARIOTI
STRUTTURA DEL PROMOTORE BATTERICO
IL FATTORE SIGMA
SRUTTURA DELLA RNA POLIMERASI
INIZIO
ALLUNGAMENTO
TERMINAZIONE
La Trascrizione nei Batteri
La Trascrizione è il primo step dell’espressione genica, nel quale un particolare
segmento di DNA è copiato in RNA da un enzima chiamato RNA polimerasi.
Se il gene trascritto codifica per una proteina, il risultato della trascrizione è
l’RNA messaggero (mRNA), che sarà usato per creare quella proteina tramite il
processo chiamato traduzione.
Alternativamente, il gene trascritto può portare le informazioni per RNA non
codificanti (es. microRNA), RNA ribosomali (rRNA), transfer RNA (tRNA).
La Trascrizione nei Batteri
Il Dogma Centrale della Biologia
La parola gene è stata coniata nel 1909 (W. Johannsen).
Il dogma centrale della biologia risale agli anni ‘50.
La Trascrizione nei Batteri
Nei procarioti un solo tipo di RNA polimerasi trascrive i
geni codificanti per mRNA,
mRNA, rRNA e tRNA
tRNA..
La Trascrizione nei Batteri
Differenze:
Procarioti
I geni sono raggruppati in operoni
L‘ mRNA può contenere trascritti
di molti geni (poli-cistronico)
La trascrizione e la traduzione sono
accoppiate. Il trascritto è tradotto
durante la transcrizione.
La regolazione dell‘espressione
genica avviene tramite la
modificazione della velocità di
trascrizione
Eucarioti
I geni non sono raggruppati in operoni
Ogni mRNA contiene solo il trascritto di
un singolo gene (mono-cistronico)
La trascrizione e la traduzione non sono
accoppiate. La trascrizione avvine nel
nucleo mentre la traduzione nel citoplasma
La regolazione dell‘espressione genica
avviene tramite la modificazione della
velocità di trascrizione, stabilità dell‘RNA
etc.
Gli mRNA sono processati (splicing , CAP,
poly-A tail).
rRNA e tRNA sono processati sia negli eucarioti che nei procarioti
Gli mRNA non sono processati
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Il processo generale della trascrizione è simile nei
procarioti e negli eucarioti
La trascrizione si può dividere in tre fasi
- Inizio
- Allungamento
- Terminazione
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ALLUNGAMENTO
INIZIO
TERMINAZIONE
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LA TRASCRIZIONE E LA
TRADUZIONE SONO
ACCOPIATE NEI PROCARIOTI
Appena la catena crescente di
mRNA si separa dal DNA, i
ribosomi la attaccano ed inizia
la sintesi proteica
La Trascrizione nei Batteri
L’RNA ha la stessa sequenza nucleotidica (in
direzione 5’-3’) del filamento “senso”
Sense strand  nontemplate
strand = mRNA
Antisense strand  template
strand
3
1
2
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Come inizia la trascrizione
trascrizione?
?
L’RNA polimerasi si lega ad una regione del DNA chiamata PROMOTORE
Struttura del promotore batterico
I promotori batterici sono composti da sequenze consenso.
Sequenze conservate
conservate: quando le sequenze del DNA hanno
esattamente la stessa serie di nucleotidi in una determinata
regione.
Sequenze consenso : Ci sono alcune variazioni nella sequenza
ma alcuni nucleotidi sono presenti con una più alta frequenza.
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INIZIO
Struttura del promotore batterico
E’ convenzione indicare l’inizio della trascrizione con il numero +1 e di usare numeri positivi per
contare le basi del DNA nella direzione della trascrizione (downstream).
Se la trascrizione procede verso destra allora la direzione verso sinistra sarà chiamata
upstream con le basi indicate con numeri negativi.
Per la maggior parte dei geni di E. coli, la sequenza consenso del promotore consiste in due
sequenze esameriche.
Posizionata a −10 c’è la sequenza consenso TATAAT, che è anche conosciuta come TATA
box. (capital letters indicate bases found in those positions in more than 50% of promoters analyzed; small
letters = less than 50%).
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Struttura del promotore batterico
Un’altra regione con sequenze simili in molti promotori è posizionata a −35.
La sequenza consenso a −35 è TTGACA.
Lo spazio tra la sequenza −10, la −35 e il punto di inizio sono importanti per la
trascrizione. Infatti delezioni o inserzioni che cambiano questi spazi sono
deleteri per la trascrizione.
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Struttura del promotore batterico
Pribnow box
(TATA box)
Startpoint  in molti geni di E. coli è una A (la
distanza dello startpoint dalla TATA box può
variare da 5 a 9 nucleotidi).
-10 sequence  separazione del DNA a
doppio filamento.
-35 sequence  legame iniziale dell’RNA
polimerasi.
-spacer region (16-19 bp)  è importante per
mantenere le posizioni appropiate degli
elementi -10 e -35.
D. Pribnow (1975) P.N.A.S.
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Struttura del promotore batterico
La sequenza del Promotore ha una forte influenza
sul livello di espressione. Sopra sono mostrati
alcuni esempi di promotore s70 (in rosso sono
indicate le posizioni conservate). Il promotore
lacZ ha circa l’1% di efficienza nell’inizio
comparato con un promotore ideale. Il promotore
di lacI è ancora meno efficiente (Il repressore
LacI è presente solo in poche copie per cellula).
TTGACA
82 84 78 65 54 45
T AT AAT
80 95 45 60 50 96
Promoter consensus sequences
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Struttura del promotore batterico
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Struttura dell’RNA polimerasi batterica
L’RNA polimerasi batterica è costituita da un core enzyme più un fattore della
trascrizione chiamato sigma factor ().
Insieme formano il complesso enzimatico funzionale chiamato holoenzyme.
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Struttura dell’RNA polimerasi batterica
La velocità di reazione è di ~40 nucleotidi/secondo a 37°C; questa velocità è
approssimativamente la stessa della traduzione (15 amino acids/sec). Circa 7000
molecole di RNA polimerasi sono presenti nella cellula di E. coli. Molte di
queste molecole sono impegnate contemporaneamente nella trascrizione
(probabilmente 2000–5000).
Il core enzyme è il componente del holoenzyme che catalizza la polimerizazione.
Ha un peso di circa 400 kD ed è composto da 5 subunità: due copie
della subunità α (αI, αII), e una copia delle subunità β, β′, e ω.
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Struttura dell’RNA polimerasi batterica
La subunità a (36.5 kDa, rpoA gene) è organizzata in 2 domini, con l’ N-terminale
(1-235) che prende contatto con la subunità b o b '. Un linker flessibile connette
il dominio N con il dominio C-terminale (249-329, a -CTD) che si trova fuori dal
core della polimerasi ed è il responsabile dell’interazione con i fattori di
attivazione (es. Catabolite Activator Protein (CAP)) e gli elementi UP.
Linker
La subunità b (150 kDa, rpoB gene) e la subunità b ' (155 kDa, rpoC gene)
FORMANO IL SITO CATALITICO
Il rudder (timone) è un loop della subunità b‘ il quale si pensa che funzioni da
separatore tra la molecola di RNA neosintetizzata ed il DNA stampo.
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Struttura dell’RNA polimerasi batterica
La struttura realizzata tramite la cristallografia ai
raggi X ha rivelato una struttura a forma di chela
di granchio. Le subunità αI, αII, e ω formano la base
della chela, mentre le subunità β e β′ formano le
pinze. Queste pinze formano un canale interno (largo
circa 2.7 nm). Il sito attivo dell’enzima è localizzato in
questo canale dove è legato un essenziale ione di Mg2+.
Il core enzyme ha una alta affinità per il DNA in generale. In assenza del
fattore σ, il core enzyme può iniziare la sintesi in ogni punto del DNA stampo (in
vitro).
Il fattore σ è responsabile della diminuzione dell’affinità non specifica dell’RNA
polimerasi per il DNA.
La sequenza, la struttura e la funzione sono conservate dai batteri agli umani.
La Trascrizione nei Batteri
INIZIO
Struttura dell’RNA polimerasi batterica
batterica:: il fattore σ
Nei batteri ci sono molti fattori σ differenti. In E. coli il più
abbondante fattore  è il 70. Ha la più alta affinità per l’RNA
polimerasi rispetto a tutti gli altri fattori σ.
La maggior parte dei fattori σ hanno in comune 4 regioni aminoacidiche
omologhe che svolgono un ruolo nel riconoscimento del promotore
Queste quattro regioni sono ulteriormente suddivise in subdomini
con funzioni specifiche
La Trascrizione nei Batteri
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Struttura dell’RNA polimerasi batterica
batterica:: il fattore σ
• Il fattore σ70 può essere suddiviso in quattro regioni denominate regioni σ
che vanno da 1 a 4
• Il fattore σ70 è necessario per il binding specifico dell’RNA polimerasi al
promotore della maggior parte dei geni di E. coli.
• Le sequenze −35 e−10 sono necessarie per il riconoscimento di σ70.
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INIZIO
Struttura dell’RNA polimerasi batterica
batterica:: il fattore σ
Il fattore sigma σ70 (MW = 72000)
I frammenti 2.1 e 2.2 di σ 70 legano la subunità b'.
I frammenti 2.3 e 2.4 sono coinvolti nel
riconoscimento della regione -10 del promotore. Il
frammento 2.3 è necessario per l’apertura del DNA.
Inoltre, regioni vicine al dominio N-terminale (1.1 e
1.2) di σ 70 hanno attività inibitoria nel legame al
DNA.
L’aggiunta di σ all’ RNA polimerasi core da la
possibilità all’RNA polimerasi holoenzyme di
riconoscere il sito -10 e di formare il complesso
chiuso. Nell’holoenzyme, un altro dominio di legame al
DNA di , la regione 4.2, viene esposto, e questo
riconosce il sito -35, approsimativamente distante 2
giri di elica. Se la -35 è riconosciuta, l’holoenzyme
apre la regione del DNA che va da -11 a +3,
formando il complesso aperto, e la bolla è stabilizzata
dal ssDNA binding domain di  nella regione 2.3.
La regione 2.5 interagisce con il dsDNA da -11 a –
17 (spacer region).
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INIZIO
Struttura dell’RNA polimerasi batterica
batterica:: il fattore σ
Alternative sigma factors respond to general environmental changes
E. Coli sigma factors recognize promoters with different consensus sequences
Sigma70 (rpoD)
(-35)TTGACA
(-10)TATAAT
Primary sigma factor, or housekeeping sigma factor.
Sigma54 (rpoN)
(-35)CTGGCAC
(-10)TTGCA
Alternative sigma factor involved in transcribing nitrogen-regulated genes (among
others).
Sigma32 (rpoH)
(-35)TNNCNCCCTTGAA
(-10)CCCATNT
Heat shock factor involved in activation of genes after heat shock.
SigmaS (rpoS)
intrinsic curvature
(-10)TGNCCATA(C/A)T
Alternative sigma factor transcribing genes of stationary phase of growth.
Note the extended -10 element.
The use of different sigma factors gives E. coli flexibility in responding to different
conditions.
Il processo della trascrizione è
suddiviso in tre fasi
fasi::
INIZIO
ALLUNGAMENTO
TERMINAZIONE
INIZIO
La Trascrizione nei Batteri
INIZIO
L’ RNA polimerasi oloenzima lega inizialmente le regioni −35
e −10 del promotore e forma un complesso chiuso con il
promotore.
Il termine chiuso indica che il DNA rimane a doppio filamento.
Il complesso è reversibile.
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INIZIO
Cambiamenti strutturali che avvengono nella RNA polimerasi durante l’ isomerizzazione
(transizione complesso chiuso-complesso aperto)
- Le pinze (pincers) bloccano il DNA nel complesso aperto.
- Cambiamento di posizione della regione 1.1 del fattore sigma. Quando l’oloenzima
non è legato ad un promotore la regione  1.1 impegna il sito attivo bloccando
l’accesso al DNA. Quando si forma il complesso aperto la regione  1.1 è spostata 50
A° fuori dall’enzima permettendo l’ingresso del DNA nel sito attivo. La regione  1.1
mima il DNA in quanto è carica negativamente. Il sito attivo sull’enzima che
interagisce alternativamente con il DNA o con  1.1, è carico positivamente.
La Trascrizione nei Batteri
INIZIO
Dopo questi cambiamenti strutturali, il complesso passa alla forma
“aperta” nella quale approssimativamente 18 bp intorno al sito d’inizio
della trascrizione sono aperti esponendo così il filamento di DNA stampo.
La formazione del complesso aperto è generalmente irreversible e la
trascrizione viene avviata in presenza di NTPs.
No primer is required for initiation by RNA polymerase.
La Trascrizione nei Batteri
INIZIO
Durante l’inizio della trascrizione, l’RNA polimerasi produce e rilascia corti
trascritti di RNA generalmente mano di 10 ribonucleotidi (abortive synthesis)
prima di lasciare il promotore (promotor clearance).
Non è chiaro il motivo per cui l’ RNA polimerasi va incontro a questo periodi di
trascrizione abortiva prima di riuscire a lasciare il promotore, ma sicuramente una
regione del fattore σ è coinvolta in questo processo.
Infatti, durante questo passaggio avviene uno spostamento di alcuni domini di σ che
altrimenti fungerebbero da barriera nel canale di uscita del neosintetizzato RNA.
La Trascrizione nei Batteri
INIZIO
La transizione verso il complesso di
allungamento porta alla parziale dissociazione
del holoenzyme. Il fattore sigma viene
rilasciato, e il “core” dell’ RNA polimerasi
procede downstream. I cambiamenti
conformazionali nelle subunità β intorno al
DNA, così che la polimerasi non lascia mai
completamente lo stampo.
Questo meccanismo è critico per la processività
della trascrizione, infatti l’ RNA polimerasi non
è in grado di riprendere la sintesi di un gene
trascritto in maniera incompleta.
ALLUNGAMENTO
Elongation
After about 9-12 nt of RNA have been synthesized, the initiation complex
enters the elongation stage.
As RNA polymerase moves during elongation, it holds the DNA strands apart,
forming a transcription “bubble.”
The moving polymerase protects a “footprint” of ~30 bp along the DNA against
nuclease digestion.
Within the transcription bubble, one strand of DNA acts as the template for
RNA synthesis by complementary base pairing.
Transcription always proceeds in the 5′→3′ direction.
Elongation
1) The antisense strand of DNA is used as
template.
2) Transcription proceeds in 5’--3’ direction.
3) The double stranded RNA-DNA hybrid is
very transient. At any given time during
transcription, the number of nucleotides of
RNA that remain paired with the DNA
template may vary between 8 and 10.
Several proteins can affect the rate of
elongation. NusA slows elongation when RNA
polymerase encounters certain sequences
keeping the rate of transcription similar to the
rate of translation so that the ribosomes are
able to follow on RNA molecule right behind
the RNA polymerase.
Proofreading
E. coli RNA polymerase synthesizes RNA with remarkable fidelity in vivo. Its low
error rate may be achieved by two proofreading mechanisms. ). One mistake
occurs every 10000 nucleotides added.
Pyrophosphorolytic editing
The RNA polymerase use its active site in a simple back-reaction, to catalyze the
removal of an incorrectly inserted ribonucleotide by reincorporation of Ppi.
Hydrolytic editing
The polymerase backtracks by one or more nucleotides and cleaves the RNA
product, removing the error-containing sequence.
Hydrolytic editing is stimulated by Gre factors, which both enhance hydrolytic
function and serve as elongation stimulating factor.
Gre factors ensure that polymerase elongates efficiently and help overcome
arrest in presence of a mismatch.
TERMINAZIONE
Termination of transcription
The RNA polymerase core enzyme moves down the DNA until a
stop signal or terminator sequence is reached by the RNA
polymerase.
There are two types of terminators recognized,
• Rho-dependent
• Rho-independent terminators
E. coli uses both kinds of transcript terminators.
Termination of transcription
RhoRho
-independent termination
Also called “intrinsic terminators” because they cause termination of transcription in the
absence of any external factors.
Terminator is characterized by a consensus sequence that is an inverted repeat.
Stem-loop structures can form within the mRNA just before the last base
transcribed, by the pairing of complementary bases within the inverted repeat.
The inverted repeat sequence in the mRNA is followed by seven to eight uracilcontaining nucleotides. A hybrid helix of U in the RNA base paired with A in the DNA is
less stable than other complementary base pairs.
This property, combined with formation of the stem loop in the exit channel of RNA
polymerase, is sufficient to cause the enzyme to pause, resulting in transcript release.
Termination in prokaryotes
1) Core enzyme can terminate in vitro at certain sites in the absence of any other factor.
These sites are called intrinsic terminators.
2) Rho-dependent terminators are defined by the need for addition of rho factor in
vitro transcription assay.
1) Intrinsic terminator
loop
Stem
(CG rich)
The importance of the run of U bases is
confirmed by making deletions that shorten
this stretch; although the polymerase still
pauses at the hairpin, it no longer terminates.
Termination of transcription
RhoRho
-dependent termination
Rho-dependent termination is controlled by the ability of the Rho protein
to gain access to the mRNA.
Terminator is an inverted repeat with no simple consensus sequence and
no string of Ts in the nontemplate strand.
Rho is a ring-shaped, hexameric
helicase protein with a distinct RNAbinding domain and an ATP-binding
domain.
Rho binds specifically to a C-rich site
called a Rho utilization (or rut site)
at the 5′ end of the newly formed
RNA, as it emerges from the exit
site of RNA polymerase.
Temporary release of one subunit of the hexamer allows the 3′ segment of the
nascent transcript to enter the central channel of the Rho ring.
Termination of transcription
RhoRho
-dependent termination
In an ATP-dependent process, Rho travels along the RNA, “chasing”
the RNA polymerase. When the polymerase stalls at the terminator stemloop structure, Rho catches up and unwinds the weak DNA–RNA hybrid.
This causes termination of RNA synthesis and release of all the
components.
2) Rho dependent termination.
-rho factor is an essential protein in
E. coli (~275 kD) hexamer of
identical subunits).
-Mutations in rpoB gene (b subunit
of RNA polymerase) can reduce
A consensus sequence for rho-dependent terminators
termination at a rho-dependent site. cannot be defined (high C and low G content).
- E. coli has relatively few rhodependent terminators; most of the
known rho-dependent terminators are
found in phage genomes.
- rho has a 5’-3’ helicase action
that can cause an RNA-DNA
hybrid to separate; hydrolysis of
ATP is used to provide energy for
the reaction.
- The idea that rho moves along RNA
leads to an important prediction
about the relationship between
transcription and translation. The
RNA polymerase pauses when it
reaches a terminator, and termination
Stop codon
In some cases, a nonsense mutation in one gene of a transcription unit prevents the expression of
subsequent genes in the unit. This effect is called polarity. Rho and NusA create a link between
transcription and translation.
UAA
UGA
UAG
TECNICHE USATE PER LO STUDIO
DELL’INTERAZIONE RNA pol
pol/DNA
/DNA E PER
INDIVIDUARE IL SITO D’INIZIO DELLA
TRASCRIZIONE
DNAse I Footprinting
1. Prepare end-labeled DNA.
2. Bind protein.
3. Mild digestion with DNAse I (randomly
cleaves ds DNA on each strand)
4. Separate DNA fragments on denaturing
acrylamide gels.
DNase I footprint performed
on an end-labeled DNA
fragmentFIS
Footprint
Samples in lanes 2-4
had increasing amounts
of the DNA-binding
protein (lambda protein
cII); lane 1 had no
protein.
Partially DNase I digested DNA is subjected to linear PCR
DNA-protein
complex
DNase I
Products of DNase I
digestion are primer
extended by linear PCR
using a 5’ end-labeled
oligonucleotide
Sequencing gel
Gel retardation assay
Gel Shift
Electro Mobility Shift Assay (EMSA)
Band Shift
Incubating a purified protein, or a complex mixture
of proteins e.g. nuclear or cell extract, with a 32P
end-labelled DNA fragment containing the putative
protein binding site (from promoter region).
Reaction products are then analysed on a nondenaturing polyacrylamide gel.
The specificity of the DNA-binding protein for the
putative binding site is established by competition
experiments using DNA fragments or
oligonucleotides containing a binding site for the
protein of interest, or other unrelated DNA
sequences.
No protein
add protein
Non-denaturing PAGE
*
*
Retarded
mobility
due to
protein
binding
Free DNA probe
virB
virF
virG
Bound DNA
EMSA
Free DNA
Evaluating the
Binding Affinity
Primer extension
mRNA
5’

annealing
primer -32P
3’
reverse transcriptase
5’
mRNA
cDNA
primer
G A T
primer-32P
mRNA
5’
3’
-32P
run on denaturating gel
C
Early-log
37°C 10°C
Mid-log Late-log
37°C 10°C
37°C 10°C
-10
+1
+24
3’
+42
+77
cspA mRNA
S1 Mapping
[#]
La nucleasi S1
digerisce DNA o RNA a
singolo filamento
[*]
Il sito d’inizio della
trascrizione si trova
a 300 basi
dall’estremità 5’
marcata del
frammento di DNA
usato come sonda
[#]
[*]