Morini Elena
"Analisi dei fattori di rischio genetici per le malattie cardiovascolari e
identificazione delle varianti genetiche che predispongono alla morte
cardiaca improvvisa"
ABSTRACT
L’attività fisica è definita come qualsiasi movimento corporeo, prodotto dai muscoli scheletrici, che
richiede un dispendio energetico. In particolare nei paesi industrializzati, i livelli di inattività fisica
sono in grande aumento con importanti implicazioni nell’insorgenza di malattie croniche non
trasmissibili (NCD) come l’obesità, l’ipertensione, l’infarto, il diabete di tipo 2, l’insulinoresistenza, il cancro alla mammella e al colon e le malattie cardiovascolari (CVD). Al contrario, è
stato dimostrato come una regolare attività fisica migliori lo stato di benessere della popolazione
contribuendo alla perdita di peso e in particolare riducendo il rischio per molte NCD.
Le malattie cardiovascolari sono patologie multifattoriali e rappresentano una delle più comuni
cause di morte nel mondo. Le CVD presentano un’importante componente genetica anche se, al
momento, i fattori ambientali giocano un ruolo di rilievo nella predizione del rischio. Per quanto
riguarda la loro classificazione, vengono identificate due categorie: malattie cardiovascolari dovute
all’aterosclerosi e malattie cardiovascolari dovute ad altre cause. Nel primo gruppo sono incluse le
patologie cardiache ischemiche o malattie coronariche (CAD), le patologie cerebrovascolari e le
patologie che interessano l’aorta e le arterie. Tra le CVD dovute ad altre cause si annoverano le
malattie congenite del cuore, le cardiomiopatie e le aritmie cardiache ereditarie. Queste ultime
rappresentano le principali cause di morte cardiaca improvvisa in particolare in individui di età
inferiore a 35 anni ed in atleti. La morte cardiaca improvvisa (SCD) è definita come
una morte inattesa per cause cardiache che si verifica entro un’ora dal manifestarsi dei sintomi. Le
tecnologie NGS rappresentano un’opportunità senza precedenti nell’ambito della ricerca e della
diagnostica e mostrano un grande potenziale per lo studio di malattie genetiche eterogenee.
Durante il mio dottorato di ricerca, lo studio è stato focalizzato su differenti aspetti della
predisposizione genetica per la morte cardiaca improvvisa. Un’approfondita ricerca bibliografica
sulle tecnologie di Next-Generation Sequencing (NGS) ha permesso la produzione di linee guida
per l’applicazione di questi nuovi metodi nello screening genetico e nell’identificazione di varianti
associate alla SCD e a difetti cardiaci di conduzione (CCD). In particolare, è stato possibile definire
un protocollo per eventi di SCD in giovani atleti, che rappresentano una delle maggiori categorie
affette da tali patologie.
Successivamente, protocolli NGS sono stati applicati al fine di sviluppare un promettente approccio
diagnostico per SCD e CCD in collaborazione con l’Unità di Genetica Medica, Università di Roma
Tor Vergata. Il primo passo è stato la selezione dei principali geni associati con SCD e CCD e il
design di specifici primers in grado di amplificare la sequenza codificante (CDS) di tutti i geni
selezionati. Seguendo tale approccio sono stati disegnati due diversi pannelli (Ion Chips): il primo
(Ion Chip SCD) contenente 61 geni principalmente associati con SCD e CCD e il secondo (Ion
Chip CCD) composto da 8 geni responsabili di un’alta percentuale di difetti cardiaci della
conduzione.
La validazione dei pannelli è fondamentale per verificare che alcuni parametri, come la qualità della
sequenza, la sensitività e la riproducibilità del test, siano strettamente in linea con i parametri
suggeriti dalle linee guida. La validazione dei pannelli realizzati è stata effettuata su pazienti
selezionati dall’Unità di Genetica Medica presso l’Università di Roma Tor Vergata e
precedentemente analizzati utilizzando il tradizionale metodo Sanger. Il risultato della validazione
ha portato a concludere che il chip contenente un numero minore di geni (Ion Chip CCD) risulta
essere più accurato e rapido, al punto di poter essere considerato un miglior strumento diagnostico.
L’applicazione dell’Ion Chip CCD ha permesso di analizzare una famiglia italiana con fenotipi
cardiaci multipli (cardiomiopatia dilatativa e ipertrofica), inclusi difetti della conduzione cardiaca
(SCD). Per identificare le cause genetiche di tali patologie, il DNA genomico del “caso index” è
stato analizzato mediante le tecnologie NGS utilizzando il Chip CCD. I risultati ottenuti hanno
mostrato la presenza di una variante nel gene SCN5A (p.R222Q) strettamente correlata con
cardiomiopatia dilatativa caratterizzata da difetti nella conduzione cardiaca. Il soggetto in esame
non presentava ulteriori varianti patogenetiche bensì due polimorfismi correlati con lo sviluppo di
difetti nella conduzione cardiaca (p.H558R e p.R1193Q). I risultati NGS sono stati ulteriormente
confermati attraverso sequenziamento Sanger. L’analisi è stata quindi estesa agli altri membri della
famiglia allo scopo di definire con maggior chiarezza il quadro fenotipico dei soggetti in esame.
In individui di età superiore ai 35 anni la morte improvvisa è spesso causata da patologie
coronariche dovute ad aterosclerosi. A tal proposito è stata presa in esame la regolazione del gene
OLR1 (Oxidized Low-Density Lipoprotein Receptor 1), che codifica per il recettore scavenger
LOX-1, appartenente alla famiglia delle lectine di tipo C e coinvolto nell’endocitosi delle oxLDL.
L’attivazione del recettore, a seguito del legame con le oxLDL, è lo step fondamentale per l’innesco
di una serie di processi chiave coinvolti nell’aterosclerosi: dallo sviluppo della placca
aterosclerotica alla sua rottura e al conseguente infarto del miocardio. L’over-espressione di LOX-1
è strettamente correlata con lo sviluppo dell’aterosclerosi, quindi la sua down-regolazione potrebbe
essere un promettente approccio terapeutico.
Tra i principali meccanismi regolatori dell’espressione genica sono noti i microRNA (miRNA),
piccoli RNA non codificanti a singolo filamento della lunghezza di 18-23 nucleotidi,
principalmente attivi nella regolazione dell'espressione genica a livello trascrizionale e posttrascrizionale. Utilizzando specifici software di predizione come TargetScan, PITA e miRanda, è
stato possibile effettuare un’analisi in silico che ha permesso l’identificazione di 89 sequenze di
riconoscimento di miRNA localizzate lungo tutta la sequenza nucleotidica del gene ORL1. Tra i
miR presi in esame, l’interesse è stato focalizzato sul miR-24 il cui sito putativo di legame è
“naturalmente” alterato per la presenza dello SNP rs1050286 (G/A). La seed region del miR-24
riconosce e interagisce in modo specifico con la regione 3’ UTR in presenza del nucleotide G, ma
non del nucleotide A. Studi in vitro hanno permesso di verificare l’influenza della differente
configurazione allelica relativa allo SNP rs1050286 (G/A) sul legame del miR-24 al suo putativo
sito di binding sul gene OLR1. L’inibizione dell’espressione di OLR1 in presenza del miR-24 è stata
dimostrata attraverso un saggio di luciferasi; inoltre la sua over-espressione in linee cellulari,
eterozigoti/omozigoti per lo SNP 1050286, determina una diminuzione della presenza in membrana
del recettore LOX-1, come verificato attraverso esperimenti di immucitochimica.
In conclusione, i risultati ottenuti identificano il gene OLR1 come nuovo possibile target del miR24, permettendo di ipotizzare che lo SNP rs1050286 possa modulare l’espressione di OLR1 e quindi
avere un ruolo chiave nella suscettibilità all’aterosclerosi.
