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I Nucleotidi Hanno Tre Componenti
Nucleotidi e Acidi Nucleici
Biotec _ 2011
Nucleotidi (1)
Un Nucleotide è una molecola costituita da un composto ad anello contenente azoto (N) legato ad uno zucchero con 5 atomi di carbono.
Lo zucchero può essere o un riboso o un desossiribosio ed è a sua volta collegato ad uno o più gruppi fosfato.
Ribosio Vs. Desossirbosio
Il 2‐Desossi‐Ribosio del DNA viene sostituito dal Ribosio nel RNA.
ll gruppo OH extra del ribosio è molto reattivo ed impedisce la formazione di una doppia elica stabile. http://www.mun.ca/biology/scarr/Deoxyribose_versus_Ribose.html
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Nucleotidi (2)
Gli anelli che contengono N sono chiamati “basi” per ragioni storiche: in condizioni acide ciascuno di essi può legare un protone (H+) e quindi aumentare la concentrazione di ioni OH‐ in soluzione acquosa.
Vi è una forte somiglianza chimica fra le diverse basi azotate:
I nucleotidi che contengono deossiribosio sono i deossiribonucleotidi e sono i monomeri del DNA.
I nucleotidi che contengono ribosio, ribonucleotidi, sono i monomeri del RNA.
La Citosina (C), la Timina (T) e l’Uracile (U) sono chiamate pirimidine in quanto tutte derivano da un anello a sei atomi detto anello pirimidinico.
La Guanina (G) e l’Adenina (A) sono composti purinici ed hanno un secondo anello a 5 atomi fuso con l’anello a 6 atomi.
Basi azotate presenti negli acidi nucleici
Negli acidi nucleici e nei nucleotidi, l’azoto in posizione 9 delle purine e l’azoto in posizione 1 delle pirimidine (rosso) sono legati al carbono 1’ del ribosio o del desossiribosio. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21514/figure/A805/?report
=objectonly
DNA
RNA
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Le purine hanno due anelli collegati con 5 e 6 atomi di carbonio
Le pirimidine hanno un anello con 6 atomi di carbono
Nucleotidi (3)
L’insieme zucchero + base azotata è detto NUCLEOSIDE.
Il nucleoside può legarsi ad uno, due o tre gruppi fosfato.
I gruppi fosfato possono legarsi all’atomo di carbonio 5’ oppure al carbonio 3’ del pentoso.
La base azotata è legata al carbonio 1’ dello zucchero.
I nucleosidi e i loro mono‐, di‐ e tri‐fosfati
Base
DNA
Nucleoside
Nucleotidi
Adenina (A)
Deossiadenosina
dAMP
dADP
dATP
Guanina (G)
Deossiguanosina
dGMP
dGDP
dGTP
Citosina (C)
Deossicitidina
dCMP
dCDP
dCTP
dTTP
Timina (T)
Deossitimidina
dTMP
dTDP
Adenina (A)
Adenosina
AMP
ADP
ATP
Guanina (G)
Guanosina
GMP
GDP
GTP
Citosina (C)
Citosina
CMP
CDP
CTP
Uracile (U)
Uridina
UMP
UDP
UTP
RNA
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Tutti i nucleotidi possono
esistere in composti in
cui vi è più di un gruppo
fosfato legato alla
posizione 5’.
I legami fra il primo (α) e
il secondo (β), e fra il
seondo (β) e il terzo (γ)
gruppi fosfato sono ricchi
di energia e sono usati
per fornire energia per
numerose attività
cellulari.
A seconda dei casi, i nucleotidi posono avere il loro gruppo fosfato legato sia alla posizione 5’ oppure 3’ del pentoso. Quando un acido nucleico è degradato possono quindi venire rilasciati i nucleoside‐3’‐monofosfato e i nucleosidi‐3’‐
monofosfati
Lewin, Genes
Lewin, Genes
Nucleotidi (4)
• Oltre ad essere componenti degli acidi nucleici (DNA e RNA) i nucleotidi possono svolgere altre importanti funzioni. Es.
– La maggior parte dell’energia utilizzata dagli esseri viventi deriva dall’adenosina trifosfato (ATP)
– La guanosina trifosfato (GTP) è un nucleotide si lega d un gran numero di proteine (“proteine G”) e agisce da interrutore per attivarle.
• Proteine G monomeriche
• Proteine G trimeriche
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ATP
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Nucleotidi : Altre funzioni
• I nucleotidi possono giocare altri ruoli importanti:
Il ribonucleotide ATP funge da trasduttore di
energia in molte reazioni biochimiche.
Il ribonucleotide GTP fornisce l’energia per la
sintesi proteica.
Il cAMP (AMP ciclico) è un ribonucleotide
speciale que è essenziale per l’azione ormonale
e per il trasferimento di informazione nel
sistema nervoso.
“Proteine G”
Funzionano da interrutori molecolari. Quando legano la guanosina trifosfato (GTP) si attivano (“on”) e quando legano la guanosina difosfato si disattivano (“off”).
Le proteine G regolano enzimi metabolici, canali ionici, trasportatori di membrana, e altre componenti delle attività cellulari, controllando la trascrizione, motilità, contrattilità e secrezione che, a loro volta, regolano funzioni sistemiche quali lo sviluppo embrionale, l’apprendimento e la memoria e l’omeostasi.
GTP
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Caratteristiche Distintive del DNA e del RNA
Nucleotidfi
ACIDI NUCLEICI
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DNA Æ RNA Æ Proteina
• Il DNA è una molecola informativa. L’informazione
è immagazzinata nell’ordine in cui sono disposte le
sue quattro basi differenti.
• Questo ordine è trasferito alle molecole di RNA, che
sono usate per dirigere l’ordine degli amminoacidi
delle proteine.
3
Acidi Nucleici : Il RNA può essere catalitico
• Alcune molecole di RNA dette ribozimi possono
fungere da catalizzatori.
• La scoperta dei ribozimi ha fornito una soluzione
per la questione su chi è comparso prima quando
la vita è iniziata, le proteine o gli acidi nucleici?
• Dato che il RNA può essere sia informazionale
che catalitico, esso potrebbe avere funzionato
come catalizzatore sia per la sua stessa
replicazione che per quella delle proteine.
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Le cellule contengono istruzioni che:
Specificano STRUTTURA
Dettano FUNZIONE
Regolano ATTIVITA’
Le istruzioni vengono trasmesse fedelmente alle cellule figlie
L’informazione ereditaria é trasmessa sotto forma di unità distinte, i GENI costituiti da DNA.
L’informazione del DNA passa:
fra generazioni di cellule: REPLICAZIONE DEL DNA
all’interno di ogni cellula: TRASCRIZIONE + TRADUZIONE
Molecola Molecola riferimento
risultante
DNA
DNA
Nome processo
Codice
REPLICAZIONE
basi azotate: Nucleotidi (4)
Sia il DNA che l’RNA vengono sintetizzati a partire da nucleosidi trifosfati:
Per il DNA: dATP, dCTP, dGTP e dTTP
Per il RNA: ATP, CTP, GTP e UTP.
In entrambi i casi, dal momento in cui ogni nucleoside viene legato, i secondo e terzo gruppi fosfato vengono rimossi (idrolizzati).
Trascrizione & Traduzione
A,T,G,C
DNA
RNA
TRASCRIZIONE
basi azotate: A,U,G,C
RNA
Proteine
TRADUZIONE
amino acidi:
20 tipi
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I 5’‐trifosfati sono i precursori per la sintesi degli acidi nucleici.
L’estremità 5’ di un trifosfato reagisce con il gruppo 3’‐OH che si trova alla fine della catena polipeptidfica in crescita.
Si forma un legame fra il fosfato α con il gruppo 3’‐
OH dello zucchero all’estremità della catena polipeptidica e i due gruppi fosfato terminali (βe (γ) del trifosfato sono rilasciati (sotto forma di una singola molecola detta pirofosfato).
DNA
In una molecola di DNA da migliaia a milioni di nucleotidi si susseguono in una catena mediante collegamento del gruppo fosfato collegato al carbono 5’ di una molecola di desossiribosio al carbono 3’ di una seconda molecola di desossirbosio (in questo processo viene rilasciata una molecola di acqua).
Poichè i nucleotidi sono collegati da legami fra le loro componenti zucchero e fosfato, si dice che il DNA ha una impalcatura («backbone») di zucchero‐fosfato.
Il legame (covalente) si chiama fosfodiesterico
DNA (1)
Kreuzer & Massey, Biology and Biotechnology
DNA
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RNA
Differenze Chimiche fra DNA e RNA (1)
Da un punto di vista chimico, l’RNA è molto simile al DNA. Tuttavia, ci sono alcune differenze principali: o L’RNA usa lo zucchero RIBOSIO invece del Desossiribosio
nel suo scheletro (“backbone”). o L’RNA usa la base URACILE (U) invece della Timina (T). Anche U è complementare ad A.
o L’RNA tende ad essere a singolo filamento (“single strand”), ma alcune regioni possono ripiegarsi formando zone a doppio filamento. Differenze funzionali tra RNA e DNA
Sia il RNA che il DNA sono composti
da unità che si ripetono:
♦ Nel RNA, queste unità sono ribonucleotidi monofosfati
♦ Nel DNA, le unità sono 2’‐
deossiribonucleotidi
monofosfati.
o Il DNA ha una singola funzione; l’ RNA ha molteplici funzioni
Esempi di tipi di RNA: tRNA, mRNA, rRNA.
Differenze Chimiche fra DNA e RNA (2)
Sia il RNA che il DNA formano lunghe catene polinucleotidiche, non ramificate, in cui diverse basi puriniche
o pirimidiniche sono riunite mediante legami N‐glicosidici ad un’impalcatura strutturale di zuccheri‐fosfato.
Le catene hanno una polarità. La sequenza di un acido nucleico viene per convenzione letta da 5’ a 3’. Ad esempio, la sequenza della molecola di RNA qui rappresentata é AUGC, mentre quella della molecola di DNA é ATGC.
La sequenza di basi porta in se l’informazione, ossia, la sequenza ATGC comporta un’informazione diversa di quella di AGCT nonostante le stesse basi siano coinvolte.
Conseguenze della struttura chimica del RNA/DNA
L’impalcatura strutturale del DNA é più stabile, specialmente in condizione alcalina. Il gruppo OH nella posizione 2’ del RNA può formare intermediari 2’‐3’ fosfodiestere in condizioni basiche, che si rompono, dando una miscela di nucleosidi 2’ e 3’ monofosfati. Perciò il polinucleotide RNA é instabile.
Il 2’ desossiribosio permette allo zucchero di assumere una conformazione a minore energia nell’impalcatura del DNA. Ciò aiuta ad aumentare la stabilità dei polinucleotidi.
La deaminazione della Citidina a Uridina può essere identificata nel DNA, ma non nel RNA, perchè la deaminazione della citidina nel DNA porta a Uridina non a Timidina. Le basi Uridina nel DNA vengono rimosse da un sottogruppo di enzimi di riparo e sostituita con basi citidina.
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Acidi nucleici
DNA
La fotografia di diffrazione (di raggi X) della forma B del DNA fatta da
Rosalind Franklin nel Maggio del 1952 é stata di lunga la migliore fotografia
di questo tipo. Dati ricavati da questa foto furono decisivi per permettere a
James Watson e Francis Crick di costruire il modello del DNA che ha fatto
vincere ad essi il premio Nobel. (Norman Collection on the History of
Molecular Biology in Novato, Calif.)
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Regola di
Chargaff
James Watson & Francis Crick
http://www.achievement.org/autodoc
/photocredit/achievers/wat0-013
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Coppie di basi complementari riempiono il centro della doppia elica proposta da Watson e Crick
Coppie di basi complementari
nella doppia elica del DNA La forma e la struttura chimica delle basi permettono che si formino legami di idrogeno efficacientemente soltanto fra A e T e fra G e C, dove gli atomi in grado di formare legami di idrogeno possono essere portati sufficientemente vicini senza dirtorcere la doppia elica. Come indicato, fra A e T si formano due ponti di idrogeno mentre fra G e C se ne formano tre. Le basi si possono appaiare in questo modo soltanto se le catene polinucleotidiche che le contengono sono antiparallele una all’altra. 12
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Conclusioni di Watson & Crick sulla struttura del DNA
(1953)
•Tratte dai dati cristallografici di Rosalind Franklin e Maurice Wilkins
Due catene polinucleotidiche elicoidali si avvolgono attorno ad un asse centrale con un diametro di 20 angstroms (10‐10 m).
Le due catene sono antiparallele (scorrono in direzioni opposte).
Le impalcature di zucchero‐fosfato rimangono all’esterno della struttura.
Le basi azotate sono perpendicolari all’asse dell’elica e separate da 3.4 angstroms.
La struttura elicoidale si ripete ogni 34 angstroms, e quindi ci sono 10 basi per giro dell’elica.
A. Modello di tipo “space‐filling” di un giro e mezzo della doppia elica del DNA. Ogni giro di DNA è fatto da 10.4 paia di nucleotidi e la distanza da centro a centro fra le coppie adiacenti di nucleotidi è 3.4 nm. L‘avvolgimento dei due filamenti uno attorno all’altro crea due solchi nella doppia elica. Il solco più ampio è detto solco maggiore (“major groove”) e quello meno profondo il solco minore (“minor groove”).
B. Una piccola sezione della doppia elica vista lateralmente, che mostra 4 paia di basi. I nucleotidi sono legati uno all’altro covamentemente mediante legami fosfodiesterici tramite il gruppo 3′ ‐idrossile (‐
OH) di uno zucchero e il 5′‐fosfato (P) del successivo. Quindi, ogni filamento polinucleotidico ha una polarità chimica; ossia le loro due estremità sono diverse chimicamente. L’estremità 3’ porta un gruppo –OH non legato collegato alla posizione 3’ dell’anello di zucchero; l’estremità 5’ porta un gruppo fosfato libero legato alla posizione 5’ dell’anello dello zucchero.
Solco
minore
Solco maggiore
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... una modesta proposta...
It has not escaped our notice that the specific pairing we have
postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the
genetic material.”
‐Watson & Crick, “A Structure for Deoxyribose
Nucleic Acid,” Nature 1953.
“Non è sfuggito alla nostra attenzione che l’appaiamento specifico che abbiamo postulato suggerisce immediatamente un possibile meccanismo di copiatura per il materiale genetico”
Replicazione semiconservativa del DNA.
I due filamenti parentali del DNA si separano e ognuno serve come stampo per la sintesi di un nuovo filamento “figlio” mediante accoppiamento di basi complementari. 14
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Reazione catalizzata dalle DNA polimerasi
Tutte le DNA polimerasi aggiungono un desossiribonucleotide 5’‐
trifosfato al gruppo 3’‐idrossilico (‐OH) di una catena in crescita del DNA ((filamento guida).
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9940/figure/A775/?report=objectonly
DNA polimerasi
Replicazione del DNA
Tutti le DNA polimerasi note condividono due proprietà fondamentali che hanno implicazioni critiche per la replicazione del DNA:
Tutte le polimerasi sintetizzano il DNA soltanto nel verso 5’ a 3’, aggiungendo un dNTP al gruppo idrossilico della catena in crescita.
Le DNA polimerasi possono aggiungere un nuovo desorriribonucleotide soltanto ad un “primer” (innesco) preformato che è legato mediante ponti di idrogeno al templato; non sono in grado di iniziare la sintesi del DNA de novo catalizzando la polimerizzazione di dNTPs liberi. Da questo punto di vista, le DNA polimerasi differiscono dalle RNA polimerasi, che possono inziare la sintesi di un nuovo filamento di RNA in assenza di un primer.
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DNA polimerasi
Enzimi responsabili dalla costruzione di nuovi filamenti di DNA durante la replicazione e il riparo del DNA.
a,. Polimerizzazione di un nucleotide all’estremità 3’ di un filamento primer.
L’enzima seleziona i nucleotidi in base alla loro abilità di appai con i nucleotid presenti
sul filamento stampo.
Rappresentazione schematica del meccanismo di duplicazione del DNA a livello della forcella di replicazione.
Ad entrambi i filamenti in allungamento, i nucleotidi vengono addizionati dalla DNA polimerasi in direzione 5’ ‐‐‐> 3’ (indicata dalle frecce). La sintesi del filamento guida avviene in modo continuo, a partire da un unico innesco a RNA legato alla sua estremità 5’ (non mostrato). La sintesi dell’altro filamento figlio (il filamento lento), procede in modo discontinuo; all’inizio si formano i frammenti di Okazaki, che si allungano a partire da numerosi inneschi a RNA, che vengono formati, sul filamento parentale man mano che, a livello della forcella di replicazione, viene esposta una nuova porzione di DNA. Gli inneschi a RNA vengono allungati dalla DNA polimerasi. Man mano che ogni frammento si avvicina ad un innesco che lo precede lungo il filamento parentale, l’innesco viene rimosso, da un enzima e i frammenti di DNA vengono uniti dalla DNA ligasi per formare un filamento continuo. La sintesi dell’intero filamento lento viene compiuta attraverso numerose ripetizioni di questo processo.
Ad ogni forcella di replicazione, uno dei due filamenti è sintetizzato mediante più inneschi. (a) La struttura completa della forcella di replicazione. La sintesi del filamento guida, catalizzata dalla DNA polimerasi III, si sttua per aggiunta sequenziale di deossiribonucleotidi nella stressa direzione di spostamento della forcella di replicazione.
(b) Passaggi della sintesi discontinua del filamento tardivo. Questo processo richiede numerosi inneschi, due DNA polimerasi e una ligasi, che unisce l’estremità 3’ idrossile di un frammento (frammento di Okazaki) con l’estremità 5’‐fosfato del frammento adiacente.
(c) Giunzione fra i frammenti di DNA. Durante questa reazione, la ligasi si lega momentaneamente ed in modo covalente all’estremità 5’‐fosfato di un filamento di DNA, attivandone così il gruppo fosfato. La DNA ligasi di E. coli usa come cofattore il NAD+, generando NMN e AMP, mentre la ligasi del batteriofago T4, normalmente usata nel clonaggio del DNA, usa ATP, generando PPi e AMP. Molecular Cell Biology 12. DNA Replication, Repair, and Recombination 12.2. The DNA Replication Machinery
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Replicazione del DNA (a)
As depicted in the following drawing, the DNA of a cell is tightly packed into
chromosomes. First, the DNA is wrapped around small proteins called histones
(colored pink below). These bead-like structures are then further organized and
folded into chromatin aggregates that make up the chromosomes. An overall
packing efficiency of 7,000 or more is thus achieved. Clearly a sequence of
unfolding events must take place before the information encoded in the DNA
can be used or replicated.
http://www2.chemistry.msu.edu/faculty/reusch/VirtTxtJml/nucacids.htm
Replicazione del DNA (b)
• Once the double stranded DNA is exposed, a group of enzymes act to accomplish its replication. These are described briefly here:
• Topoisomerase: This enzyme initiates unwinding of the double helix by cutting one of the strands. • Helicase: This enzyme assists the unwinding. Note that many hydrogen bonds must be broken if the strands are to be separated..
• SSB: A single‐strand binding‐protein stabilizes the separated strands, and prevents them from recombining, so that the polymerization chemistry can function on the individual strands. • DNA Polymerase: This family of enzymes link together nucleotide triphosphate monomers as they hydrogen bond to complementary bases. These enzymes also check for errors (roughly ten per billion), and make corrections. • Ligase: Small unattached DNA segments on a strand are united by this enzyme. Replicazione del DNA (c)
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Differenze tra RNA e DNA
Acidi nucleici
RNA
Trascrizione: Sintesi dell’RNA a partire dal DNA. I due filamenti di DNA si svolgono ed uno é usato come stampo (“template”) per la sintesi di un filamento complementare di RNA.
TIPI PRINCIPALI DI RNA
PRODOTTI NELLE CELLULE
Tipo di RNA
mRNA
rRNA
tRNA
Funzione
RNA messaggeri, codificano per
proteine
RNA ribosomiali, formano la
struttura di base dei ribosomi e
catalizzano la sintesi proteica
RNA transfer, fondamentali per la
sintesi proteica come adattatori fra
mRNA e aminoacidi
snRNA
piccoli RNA nucleari, agiscono in una
varietà di processi nucleari, compreso lo
snoRNA
piccoli RNA nucleolari, usati per
processare e modificare chimicamente gli
Altri RNA non codificanti
Agiscono in diversi processi cellulari,
compreso sintesi dei telomeri, disattivazione
splicing del pre-mRNA
rRNA
del cromosoma X, trasporto di proteine
nell’ER, regolazione genica (microRNA)*.
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Funzione e struttura del RNA
La struttura terziaria del RNA é simile a quella del DNA, ma ci sono diverse differenze importanti:
Il RNA di solito forma coppie di basi intramolecolari
L’informazione trasportata dal RNA non é ridondante perchè queste coppie di basi sono intramolecolari.
I solchi maggiore e minore sono molto meno pronunciati.
Tutti i ruoli svolti dal RNA (strutturale, adattatore informazionale, trasferimento di informazione) sono coinvolti nella decodificazione trasportata dal DNA.
Trascrizione: Sintesi del RNA
La reazione di allungamento della catena catalizzata dall’enzima RNA polimerasi. Ad ogni passo viene selezionato un ribonucleotide trifosfato dalla sua capacità di accoppiarsi con il filamento della doppia elica del DNA esposto che funge da “stampo” (“template”); viene quindi aggiunto un ribonucleotide monofosfato
all’estremità 3’‐OH della catena di RNA (freccia rossa), e viene rilasciato il pirofosfato (Pi‐Pi; atomi rossi). Quindi, la nuova catena di RNA cresce un nucleotide alla volta, in direzione 5’‐3’, ed é complementare alla sequenza del filamento stampo del DNA. La reazione é resa energeticamente favorevole dai cambiamenti di energia libera che accompagnano il rilascio di pirofosfato e dall’ulteriore idrolisi del pirofosfato a fosfato inorganico.
Trascrizione e maturazione del RNA
negli eucarioti (1)
Nelle cellule eucarioti ci sono tre distinti enzimi di trascrizione, ognuno
dei quali é responsabile della sintesi di gruppi diversi di RNA:
RNA polimerasi I: sintetizza i grandi RNA ribosomali (28 S, 18S e
5,8 S)
RNA polimerasi II: sintetizza gli RNA messaggeri e la maggior parte
dei piccoli RNA nucleari
RNA polimerasi III: sintetizza gli RNA a basso peso molecolare,
compresi gli RNA di transferimento e l’RNA ribosomico 5S.
Nessun procariote possiede più di una RNA polimerasi, mentre gli
eucarioti più semplici (lieviti) hanno gli stessi tipi di polimerasi che sono
presenti nelle cellule dei mammiferi.
Ulteriore distinzione fra procarioti ed eucarioti.
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Trascrizione e maturazione del RNA
negli eucarioti (cont.)
Le polimerasi degli eucarioti sono enzimi estremamente complessi, che contengono da 8 a 14 polipeptidi distinti (subunità) e sono abbastanza grandi da essere visualizzati al microscopio elettronico:
Oltre alle subunità, che costituiscono gli enzimi, ciascuna delle polimerasi é coadiuvata nelle sue funzioni da proteine ausiliarie: fattori di trascrizione:
Fattori generali di trascrizione: necessari alla polimerasi per iniziare la trascrizione;
Fattori specifici di trascrizione (“proteine regolatrici dei geni”): determinano la velocità alla quale un particolare gene o gruppo di geni viene trascritto
RNA POLIMERASI
I geni possono essere espressi con efficienza diversa.
Il gene A é trascritto e tradotto in modo molto più efficiente del gene B. Ciò fa sì che la quantità di proteina A nella cellula sia molto maggiore di quella della proteina B.
Le RNA polimerasi sono enzimi che catalizzano la formazione del RNA usando uno stampo (“template”) sul DNA
I substrati della reazione sono i nucleotidi‐trifosfato
L’accesso della RNA polimerasi allo stampo è regolato, sia nei procarioti che negli eucarioti
I procarioti hanno una singola RNA polimerasi
Gli eucarioti hanno tre RNA polimerasi
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RNA polimerasi nelle cellule eucariotiche
Tipo di polimerasi
TERMINOLOGIA DEL PROCESSAMENTO
DEL DNA E DEL RNA
Geni trascritti
Termine
RNA polimerasi I
geni degli rRNA 5.8S, 18S e 28S
RNA polimerasi II
tutti i geni che codificano
proteine, più geni di snoRNA e
alcuni geni di snRNA
RNA polimerasi III
geni dei tRNA, geni di rRNA 5S,
alcuni geni di snRNA e geni
per altri piccoli RNA
RNA polimerasi mitocondriale*
geni mitocondriali
RNA polimerasi dei cloroplasti*
geni dei cloroplasti
Significato letterale
Replicazione
Fare un duplicato
identico
Trascrizione
Copiare informazione
da un supporto ad un
altro, come avviene ad
es. quando si passa da
un nastro audio ad un
testo scritto
Prendere informazione
da una lingua e
convertirla in un’altra
lingua
Traduzione
Processo in cui sono
coinvolti gli acidi
nucleici
Usare una molecola di
DNA come riferimento
per ottenere due copie
di molecole figlie
identiche
Copiare la sequenza di
basi di una molecola di
DNA sotto forma di
sequenza di basi di una
molecola di RNA
Prendere la sequenza di
codoni del mRNA e
convertirla in una
catena di aminoacidi di
una proteina
*Le RNA polimerasi mitocondriale e dei cloroplasti sono simili agli enzimi batterici
Maturazione del RNA
TRASCRITTO primario: molecola di RNA appena prodotta per trascrizione del DNA.
MATURAZIONE: Modificazioni chimiche necessarie per produrre un mRNA funzionale a partire dal trascritto primario (precursore):
RIMOZIONE DI REGIONI DEL TRASCRITTO PRIMARIO (es. splicing del mRNA).
AGGIUNTA DI MODIFICAZIONI DI SPECIFICI NUCLEOTIDI (particolarmente negli tRNA).
Associazione con proteine.
Passaggio dal nucleo al citoplasma
I tre ruoli dell’RNA nella sintesi proteica.
L’RNA messaggero (mRNA) viene tradotto in una proteina mediante l’azione concertata dell’RNA di trasferimento (tRNA) e del ribosoma, che è composto da numerose proteine e da due principali molecule di RNA ribosomale (rRNA).
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STRUTTURA DEI GENI DEGLI EUCARIOTI
La maggior parte dei geni degli eucarioti contiene segmenti di sequenze codificanti (esoni) interrotte da sequenze non‐
codificanti (introni).
Le sequenze di spaziatura (“spacers”) sono lunghe sequenze di DNA non codificanti che rimangono fra i geni.
RNA
RNA MESSAGGERO (mRNA)
Cooper – The Cell, a Molecular Approach (2nd ed.)
mRNA (1)
• Il RNA messaggero o mRNA é una copia
dell’informazione trasportata da un
gene sul DNA.
• Il ruolo del mRNA é quello di trasportare
l’informazione contenuta nel DNA fino
all’apparato di traduzione.
mRNA (2)
•
Ha sempre un cappello 5’ composto da un legame trifosfato 5’ a 5’ fra due
nucleotidi modificati: una 7‐metilguanosina e una 2’ O‐metil purina.
•
Il cappello serve per segnalare questa molecola di RNA come un mRNA
all’apparato di traduzione.
•
Inoltre, la maggior parte delle molecole di mRNA contengono una coda di poli‐
Adenosina all’estremità 3’.
•
Sia il cappello 5’ che la coda 3’ vengono aggiunte dopo che il RNA é trascritto e
contribuiscono alla stabilità del mRNA nella cellula.
• Il mRNA é eterogeneo in dimensioni e
sequenza.
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mRNA (3)
Il mRNA non viene sintetizzato direttamente nella cellula eucariotica.
Esso é trascritto nel nucleo sotto forma di RNA nucleare eterogeneo (“heterogeneous nuclear“ RNA, hnRNA).
Il hnRNA contiene introni ed esoni.
Gl introni sono rimossi mediante “splicing” del RNA, lasciando gli esoni, che contengono l’informazione, riuniti fra di loro.
In alcuni casi, singoli nucleotidi possono venire aggiunti nel mezzo di una sequenza di mRNA mediante un processo detto di “editting” del RNA.
Cappello del mRNA
Quadri complessi di splicing del mRNA
Quadri complessi dello “splicing” del mRNA negli eucarioti. Il pre‐RNA trascritto del gene dell’alfa‐tropomiosina viene “spliced” in modo alternativo in tipi cellulari diversi. Le caselle verde chiaro rappresentano gli introni, gli altri colori gli esoni. I segnali di poliadenilazione sono indicati da una A. Le linee tratteggiate nei mRNA maturi indicano regioni che sono state rimosse dallo splicing. TM: tropomyosin. Griffiths et al., An Introduction to Genetic Analysis, W.H. Freeman & Co.
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Schema generale della maturazione degli mRNA negli eucarioti.
Poco dopo che la RNA polimerasi II ha ha iniziato la trascrizone del primo nucleotide del primo esone di un gene, l’estremità 5’ dell’RNA in formazione viene protetta con una 7‐
metilguanina. La trascrizione effettuata dalla RNA polimerasi II ha termine ad uno qualsiasi degli svariati siti di terminazione a valle del sito poli(A), che è localizzato all’estremità 3’ dell’ultimo esone. Dopo che il trascritto primario é stato tagliato in corrispondenza del sito poli(A), viene aggiunta una serie di residui di adenina. La coda poli(A) contiene circa 250 residui di adenina nei mammiferi, circa 1250 negli insetti, e circa 100 nei lieviti. Per trascritti primari brevi, con pochi introni, la poliadenilazione e lo “splicing” generalmente seguono la terminazione, come mostrato nella figura. Per geni lunghi, con molti introni, gli introni sono spesso recisi dall’RNA in formazione, prima che la trascrizione del gene sia completata. Si noti che il cap 5’ permane negli mRNA maturi..
I tre ruoli dell’RNA nella sintesi proteica.
L’RNA messaggero (mRNA) viene tradotto in una proteina mediante l’azione concertata dell’RNA di trasferimento (tRNA) e del ribosoma, che è composto da numerose proteine e da due principali molecule di RNA ribosomale (rRNA).
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rRNA (RNA ribosomiale)
Un ribosoma consiste di due sub‐unità
I ribosomi sono organelli presente nel citoplasma oppure ancorati al reticolo endoplasmatico ruvido.
Sono particelle responsabili della sintesi proteica, leggendo le informazioni contenute in una catena di RNA messaggero (mRNA).
Lewis, Genes
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Subunità dei ribosomi
In tutte le cellule, ogni ribosoma consiste di una subunità grande e una piccola. Le due subunità contengono rRNAs di diversa lunghezza e un insieme diverso di proteine. Tutti i ribosomi contengono due molecole principali di rRNA (rosso scuro) – 23S e 16S rRNA nei batteri, 28S e 18S rRNA negli eucarioti – e uno o due piccoli rRNA (rosso chiaro). Le proteine sono disegnate L1, L2, ecc e S1, S2, ecc., a seconda che siano presenti nella subunità grande (“large”) o piccola (“small»).
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21603/figure/A888/
PROCARIOTI
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21603/figure/A888/?report=objectonly
EUCARIOTI
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Struttura di un
rRNA batterico
Lewis, Genes
Geni dell’ RNA ribosomale
Ciascun gene dell’ rRNA è una singola unità di trascrizione contenente gli rRNAs 18S, 5.8S, e 28S e sequenze spaziatrici trascritte. I geni degli rRNA sono organizzati in serie in tandem, separate da DNA spaziatore non trascritto. Ciascun gene dell’ rRNA è una singola unità di trascrizione contenente gli rRNAs 18S, 5.8S, e 28S e sequenze spaziatrici trascritte. I geni degli rRNA sono organizzati in serie in tandem, separate da DNA spaziatore non trascritto. Cooper: The Cell III. Cell Structure and Function 8. The Nucleus The Nucleolus
Processamento della molecola del precursore rRNA 45S in tre separati RNA ribosomali
Quasi la metà delle sequenze di nucleotidi dell’RNA trascritto primario sono degradate nel nucleo.
Molecular Biology of the Cell 3rd ed. Alberts, Bruce; Johnson, Alexander; Lewis, Julian; Raff, Martin; Roberts, Keith;
Walter, Peter. New York
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Processazione del pre‐rRNA
Il trascritto 45S del pre‐rRNA contiene spaziatori esterni trascritti (ETS) ad entrambe le estremità e spaziatori interni trascritti (ITS) fra le sequenze degli rRNA 18S, 5.8S e 28S. Il pre‐rRNA è processato mediante una serie di tagli (illustrati per il pre‐rRNA umano) che producono le specie mature di rRNA.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9939/figure/A1369/?report=objectonly
Processamento del pre‐rRNA ed assemblaggio dei ribosomi negli eucarioti.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?
highlight=ribosomes,rRNA&rid=mcb.figgrp.2
981
(a) Principali intermediari e tempi richiesti per i vari passi del processamento del pre‐rRNA negli eucarioti superiori. Le proteine ribosomali e nucleolari si associano con il 45S pre‐rRNA quasi subito dopo la sua trascrizione, formando un 80S pre‐rRNP. La sintesi del 5S rRNA ha luogo fuori dal nucleolo. In questo schema non viene illustrata la complessa struttura secondaria degli rRNA. Notare che il RNA costituisce circa il 2/3 della massa delle subunità ribosomiali, e le proteine circa 1/3. (b) Via di processamento del trascritto primario per il 6.6‐kb (35S) pre‐rRNA nella S. cerevisiae. Le regioni di spaziatura trascritte (tan), che vengono scartate durante il processamento, separano le regioni corrispondenti agli rRNA maturi 18S, 5.8S, and 25S rRNAs. Tutti gli intermediari diagrammati sono stati identificati; le loro dimensioni sono indicate in rosso.
RNA
I tre ruoli dell’RNA nella sintesi proteica.
L’RNA messaggero (mRNA) viene tradotto in una proteina mediante l’azione concertata dell’RNA di trasferimento (tRNA) e del ribosoma, che è composto da numerose proteine e da due principali molecule di RNA ribosomale (rRNA).
RNA TRANSFER (tRNA)
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Legami di idrogeno nell’RNA (1)
Aminoacil‐ tRNA‐ sintasi
Enzima che catalizza
l’esterificazione di un specifico
aminoacido o del suo precurosore
ad uno dei suoi tRNA specifici per formare un aminoacil‐tRNA.
Questo processo viene talvolta
chiamato “caricamento” del tRNA
con l’amminaocido.
Una volta che il tRNAè carico, un ribosoma può trasferire l’AA dal tRNA ad un polipeptide in crescita, secondo il codice genetico. http://en.wikipedia.org/wiki/Aminoacyl_tRNA_synthetase
http://journals.prous.com/journals/dnp/20061906/html/dn190347/images/fig1.gif
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La molecola di tRNA viene sintetizzata in due parti, Il corpo del tRNA é trascritto da un gene tRNA. Il braccio accettore (“acceptor stem”) é lo stesso per tutte le molecole di tRNA ed é aggiunto dopo che il corpo é stato sintetizzato. Esso viene sostituito spesso durante il tempo di vita di una molecola di tRNA.
Il braccio accettore è il sito che trasporta uno specifico aminoacido, che é stato attaccato da una amino‐acil‐
tRNA sintasi.
L’anticodone legge l’informazione in una sequenza del mRNA mediante accoppiamento di basi.
Strutture degli tRNAs
E’ illustrata la struttura del fenilalanina‐tRNA del lievito nella forma aperta a “foglia di trigoglio” (A) per mostrare accoppiamenti fra basi complementari. Le basi modificate sono indicate come mG (metilguanosina), mc (metilcitosina), DHU (diidrouridina), T (ribotimidina), Y (una purina modificata, di solito adenosina) e y ( pseudouridina). (B) Forma ripiegata della molecola.
N.B. Gli RNA contengono spesso basi modificate chimicamente rispetto al DNA
STRUTTURA DEGLI RNA
A FORMA TRIDIMENSIONALE COMPLESSA
(es. rRNA, tRNA) (1)
Sia gli rRNA che i tRNA devono la loro attività alle loro complesse strutture secondaria e terziaria.
Diversamente dal DNA che ha struttura a doppia elica relativamente definita indipendentemente dalla sua origine, gli RNA si ripiegano in complesse forme tridimensionali, notoriamente diverse da un tipo di RNA all’altro.
Perciò, come le proteine, gli RNA sono in grado di svolgere molte funzioni, perchè possono assumere un gran varietà di forme.
Come per le proteine, il ripiegamento degli RNA segue certe regole.
Durante il ripiegamento delle catene proteiche che lavorano in ambiente acquoso i residui idrofobici vengono portati all’interno‐
Nell’RNA il ripiegamento dipende dalla formazione di regioni che hanno coppie di basi complementari.
Le regioni di basi appaiate formano tipicamente degli “steli” a doppio filamento (e a doppia elica), connessi ad “anse” a filamento singolo.
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STRUTTURA DEGLI RNA
A FORMA TRIDIMENSIONALE COMPLESSA
(es. rRNA, tRNA) (2)
A differenze del DNA, costituito unicamente dalle coppie di basi A‐T e G‐C, il RNA contiene spesso coppie di basi non convenzionali e basi azotate modificate.
Queste regioni peculiari spesso fungono da siti di riconoscimento per proteine ed altri RNA
Promuovono il ripiegamento del RNA
Aiutano a stabilizzare la struttura della molecola.
L’appaiamento delle basi fra le diverse molecole di RNA svolge un ruolo cruciale nella gran parte delle attività in cui sono coinvolti gli RNA.
RNA transfer (tRNA)
Il tRNA é la molecola portatrice di informazione con funzione di adattatore.
Rappresenta l’interfaccia diretta fra la sequenza di aminoacidi di una proteina e l’informazione sul DNA. Perciò essa decodifica l’informazione sul DNA.
Ci sono più di 20 diverse molecole di tRNA. Tutte hanno da 75 a 95 nucleotidi.
Tutti i tRNA di tutti gli organismi hanno una struttura similare: in verità, un tRNA umano può funzionare in un lievito.
Nelle molecole di tRNA ci sono 4 braccia (accettore, braccio D, braccio T pseudouridina C, braccio anticodone) e 3 “loops.” (loop D, loop T e loop anticodone).
Talvolta le molecole di tRNA hannno un loop extra o variabile (uno é illustrato in giallo nella figura).
L’RNA si può ripiegare in strutture specifiche. L’RNA è in gran parte a singolo filamento, ma spesso contiene brevi tratti di nucleotidi che possono formare coppie di basi convenzionali con sequenza complementari presenti altrove sulla stessa molecola. Queste interazioni, insieme ad ulteriori interazioni di appaiamento “non convenzionale” di basi, permettono ad una molecola di RNA di ripiegarsi in una struttura tridimensionale che è determinata dalla sua sequenza di nucleotidi. (A) Diagramma di una struttura ripiegata di RNA che mostra soltanto interazioni di appaiamento convenzionale; (B) struttura con interazioni di accoppiamento convenzionale (rosso) e non convenzionale (verde); (C) struttura di un RNA reale, una porzione di un introne di gruppo 1. Ciascuna interazione di accoppiamento convenzionale é indicata da un “piolo” nella doppia elica. Le basi in altre configurazioni sono indicate da pioli spezzati.
Struttura dei tRNA
Struttura primaria e secondaria (1)
Tutti i tRNA hanno una sequenza simile di 73 a 93 nucleotidi.
L’estremità 3’ finisce sempre con la sequenza CCA, in cui il gruppo idrossilico 3’ del ribosio della A
terminale é il punto di legame covalente per l’aminoacido.
Essi contengono un certo numero (7‐15%) di basi uniche/ o modificate. Queste vengono modificate post‐trascrizionalmente dopo la sintesi, mediante l’enzima RNA polimerasi.
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Struttura dei tRNA
Struttura primaria e secondaria (2)
In particolare, l’adenosina (A) nella prima o 5’ posizione dell’anticodone (corrispondente alla terza o posizione 3’ del codone) é sempre modificata in inosina (I) che manca del gruppo aminico (‐NH2) nell’anello purinico. L’inosina può appaiarsi con A, U o C e perciò spiega molta della degenerazione del Codice Genetico (Teoria di Wobble). Adenosina
Struttura dei tRNA
Struttura primaria e secondaria (2)
Il tRNA ha una struttura secondaria a forma di trifoglio a causa due gambi (“stems”) in cui vi é appaiamento intramolecolare tra basi.
Il trifoglio contiene tre loops senza appaiamento di basi: il loop D, l’anticodone e il loop TpsiC.
Struttura dei tRNA
Struttura Terziaria del tRNA (1)
La struttura terziaria del tRNA é meglio descritta come una forma compatta a “L”.
L’anticodone é un loop a singola elica all’estremità della Figura, che ulteriormente si appaierà con la tripletta codone.
L’aminoacido é legato alla A terminale sulla parte superiore destra.
I siti attivi (anticodone e aminoacido) sono separati al massimo.
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Struttura dei tRNA
Struttura Terziaria del tRNA (2)
RUOLO DEI LEGAMI DI IDROGENO
NELLA TRASCRIZIONE DEL RNA
STRUTTURA DEGLI RNA & INTERAZIONE tRNA/mRNA
Come succede con le proteine, la struttura terziaria é dettata dalla sequenza primaria.
La struttura terziaria é stabilizzata da appaiamento tra basi e accatastamento di basi.
Due aree (braccio anticodone e braccio accettore) formano una doppia elica.
CODICE GENETICO
Codice mediante il quale la sequenza nucleotidica di una molecola di DNA o di RNA specifica la sequenza amminoacidica di un polipeptide.
Consiste di codoni a tre nucleotidi che specificano un particolare amminoacido oppure dicono al ribosoma di fermare la traduzione e rilasciare il polipeptide.
Con poche eccezioni, tutti gli organismi viventi utilizzano lo stesso codice.
(Mathews et al., Biochimica)
Codiced Genetico (segue)
Un gene una catena polipeptidica
Corrispondenza lineare solo nei PROCARIOTI.
EUCARIOTI: sequenze codificanti (esoni) + sequenza non codificanti (introni)
ATTENZIONE: alcuni geni NON codificano per proteine (mediante un mRNA), codificano per gli altri RNA: tRNA, rRNA, snRNA, snoRNA, ecc. 33
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Codiced Genetico (segue)
CODICE GENETICO detto «DEGENERATO» O «RIDONDANTE»:
Un singolo amminoacido può essere specificato da più di una tripletta di nucleotidi.
Non significa malfunzionalità (ambiguità).
Aumenta l’adattabilità del sistema di codificazione.
Il codice genetico non è sovrapposto:
– Ogni nucleotide è parte di una sola tripletta.
Decodificazione di una molecola di mRNA
Ogni aminoacido addizionato all’estremità crescente della catena polipeptidica viene selezionato mediante appaiamento complementare di basi fra l’anticodone nel tRNA a cui é legato e il codone successivo nella catena del mRNA
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One gene ‐‐> one protein
Genetic code
• Triplet code
Same language/monomers
Three basepairs specify one amino acid = codon
Different language/monomers
Genetic code
• Triplet code
DNA Template strand = complementary to mRNA
Coding strand = nontemplate strand = similar sequence to mRNA
Genetic code
• Triplet code
DNA Template strand = complementary to mRNA
Coding strand = nontemplate strand = similar sequence to mRNA
Uracil used instead of Thymine
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Genetic code
• Triplet code
• Nonoverlapping
Genetic code
• Triplet code
• Nonoverlapping
• Degenerate Genetic code
• Triplet code
• Nonoverlapping
• Degenerate ‐ 4 nucleotides ‐‐ > 20 amino acids doublet code ‐‐> 42 ‐‐> 16 combinations
triplet code ‐‐> 43 ‐‐> 64 combinations
61 codons code for amino acids
triplet code ‐‐> 43
‐‐> 64 combinations
Each amino acid specified by more than one nucleotide triplet (codon)
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61 codons code for amino acids
•
•
•
•
Genetic code
AUG = Met = start
UAG
UAA
Stop
UGA
Genetic code
L’uracile forma coppie di basi con adenina. L’assenza di un gruppo metilico in U non ha effetto sull’accoppiamento delle basi; così, le coppie di basi U‐A assomigliano molto alle coppie di basi T‐A.
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Aminoacil tRNA sintetasi
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21603/figure/A883/
«WOBBLE» NEL CODICE GENETICO
(TENTENAMENTO) (1)
D’accordo con il codice genetico, una cellula avrebbe bisogno di tRNA con 61 diversi anticodoni per complementare i 61 codoni disponibili.
Tuttavia, dovuto alla degenerazione del codice genetico, la terza base è meno discriminatoria per l’aminoacido delle altre due basi.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21603/figure/A883/?report=obj
ectonly
Aminoacylation of tRNA. Amino acids are covalently linked to tRNAs by aminoacyl‐tRNA synthetases
Each of these enzymes recognizes one kind of amino acid and all the cognate tRNAs that recognize codons for that amino acid. The two‐step aminoacylation reaction requires energy from the hydrolysis of ATP. The equilibrium of the overall reaction favors the indicated products because the pyrophosphate (PPi) released in step 1 is converted to inorganic phosphate (Pi) by a pyrophosphatase. The 3′ end of all tRNAs, to which the amino acid attaches, has the sequence CCA. Class I synthetases (purple) attach the amino acid to the 2′ hydroxyl of the terminal adenylate in tRNA; class II synthetases (green) attach the amino acid to the 3′ hydroxyl. (Ad = adenine; Cyt = cytosine.)
«WOBBLE» NEL CODICE GENETICO
(TENTENAMENTO) (2)
Questa terza posizione del codone viene detta posizione di “wobble” (tentenamento).
In questa posizione, gli U e le C possono essere letti come G nell’anticodone.
Allo stesso modo, le A e le G possono essere lette come U o Y (pseudouridina) nell’anticodone.
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«WOBBLE» NEL CODICE GENETICO
(TENTENAMENTO) (3)
I tRNA inoltre contengono una serie nucleotidi modificati.
Uno di questi nucleotidi è l’inosina (I).
Se il tRNA contiene una Inosina nell’anticodone in posizione “wobble”, questo tRNA può leggere codoni che hanno A, U oppure C nella terza posizione.
Appaiamento non-standard codoneanticodone (“woobling”;
tentenamento).
L’accoppiamento delle basi nella 3°
posizione del codone è rilassata,
permettendo a G di appaiarsi con U, e
all’inosina (I) dell’anticodone di
appaiarsi con U, C oppure A. Sono
illustrati due esempi di appaiamentp tra
basi anomali, che permettono alla PhetRNA (tRNA che trasporta la fenilalanina)
di riconoscere sia i codoni UUC che
UUU, e al Ala-tRNA (tRNA che trasporta
l’alanina) di riconoscere GCU, GCC e
GCA.
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