Diagnostica delle Epatiti Virali II
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PERIODO DI INCUBAZIONE FASE ACUTA CONVALESC GUARIGIONE Virus B Infezione solo da V Infezione contemp poranea Da Virus B + Virus Delta HBsAg Anti‐HBs HBeAg HBV‐DNA ALT Anti‐Hbe Anti‐HBc IgM Anti‐HBc IgG Anti‐HD IgM Anti HD IgG Anti‐HD IgG 0 1 2 3 MESI 4 5 6 Caratteristiche dei marcatori dell’epatite Caratteristiche dei marcatori dell epatite B B • HB HBeAg non è corpuscolato ma solubile, la sua presenza indica A è l l bil l i di replicazione virale e infettività del soggetto. HBsAg+ HBeAg+ è 10 milioni di volte più infettante di HBsAg+ • HBsAg+, HBeAg+ è 10 milioni di volte più infettante di HBsAg+, HBeAg‐. • HBeAg compare 2‐3 settimane dopo HBsAg. La mancata comparsa di anticorpi indica cronicizzazione. • HBcAg non è rilevabile in circolo (coperto da HBsAg). L’anticorpo IgM indica attiva replicazione virale Può essere L’anticorpo IgM indica attiva replicazione virale. Può essere l’unico marker di infezione se scompare HBsAg e non compare ancora HBsAb. L’anticorpo IgG può persistere per anni senza indicare replicazione. • HBV DNA. E’ il marcatore più specifico di replicazione virale. VIRUS DELTA VIRUS DELTA • Diametro 35‐37nm. Involucro esterno HbsAg. p L’interno contiene RNA.Si replica solo in presenza di HbsAg. Infezione simultanea B, D o sovra infezione D in portatore cronico B sovra infezione D in portatore cronico B. incubazione più rapida. Figura 3-2 TEMPI DI COMPARSA DEI MARCATORI DELL'EPATITE B FASI DELLA MALATTIA MARCATORE INCUBAZ. ACUTA 2 3 CONVAL. GUARIGIONE HBsAg Anti-HBs HBeAg HBV-DNA Anti-HBe Anti-HBc IgM Anti-HBc IgG 0 4 MESI 5 6 Interpretazione dei marcatori sierologici del virus dell’epatite del virus dell epatite B nel siero B nel siero HBsAg IgM anti Hbc Anti Hbc totali HBeAg Anti Hbe Anti Hbs Epatite B acuta (fase tardiva) + + + + + + + + + + - + - Portatore persistente + + + + - - Alta Portatore persistente + - + - + - Bassa Convalescente da infezione acuta + + + - + + Nessuna Infezione pregressa - - + + - + - + - Nessuna - - - - - + Nessuna Epatite B acuta (fase precoce) Infez.pregressa con anti Hbs non valutabili; inizio della convalescenza o infez cronica Immunizzata Infettività del sangue Alta Moderata Moderata Dubbia PROCEDIMENTI DI DISINFEZIONE PER MATERIALI CONTAMINATI DA VIRUS EPATITICI Procedimento Condizioni Tempo Commento Controindicaz Autoclave 1 Atm 10 minuti E’ sempre il metodo di scelta (anche 0,7 Atm) No plastica Ebollizione Acqua bollente 10 minuti Controllare tempo Plastica sensibile Pastorizzazione Bagnomaria (65°) 30 minuti Si per alcuni ogg. in plastica Temperatura e t Occorre apparato idoneo Incenerimento Ossido di etilene Gassoso 10% in Freon Una notte Speciali apparecchiature per la tossicità Irradiazione UV 2800‐2400 1 minuto Scarsa penetrazione in liquidi e solidi Ipocloriti Cl. att.10.000 ppm Cl. att.10.000 ppm 1 minuto 1 minuto Schizzi di sangue Fenolici Ac. Fenico sol2% 10 minuti Ok per trattamento feci Aldeidi formalina Soluzione 10% in H2O 1 ora Ok contro i virus. Organi e tessuti tenuti in soluzione per tessuti tenuti in soluzione per una notte o più. Circ. 57 Min. Sanità del 22‐6‐1983 Glutaraldeide Sol.att. 2% in H2O 15 minuti Strumenti metallici e plastica Vapori tossici Fumigazione di stanze e cappe Fumigazione di stanze e cappe sterili V di f Vedi formalina li Trattamento reattivi speciali Cancerogeno Vapori di V i di formalina Beta propionol Sol. 0.35% in H2O Corrodono metalli Cause di epatite post trasfusionale Virus NANB 80 85% (di cui 80% HCV) 80-85% CMV 15% HBV 1 3% (incluso HDV) 1-3% Rischio di infezione post trasfusionale in relazione al numero di unità di sangue utilizzate USA HIV 1:225.000 HCV HBV 1:2000/6000 1:200.000 ((0,05-0,017%)) ITALIA 1:100.000 1:1000 1:50.000 Figura 3-1 TEMPI DI COMPARSA DEI MARCATORI DELL'EPATITE C FASI DELLA MALATTIA INCUBAZ. MARCATORE ACUTA CONVAL. GUARIGIONE? HCV-RNA nel siero HCV-RNA negli epatoc. HCV-RNA in cellule mononucl. Ab anti HCV C22 E2 NS5 EVIDENZA CLINICA 0 5 10 30 SETTIMANE sempre presente 50 non sempre presente presente sporadicamente Sensibilità dei metodi per la rilevazione del genoma HCV Unità virali/ml di siero rilevabili Unità virali/ml di siero rilevabili 1‐10 10‐102 102‐103 103‐104 PCR ‐ ‐ + +‐ +++ (2500/ml) Nested PCR +‐ +++ (25/ml) bDNA ‐ ‐ ‐ ‐ 104‐105 105‐106 ‐ + ++ Metodo (3500000/ml) Sensibilità dei metodi molecolari I Sensibilità dei metodi molecolari ‐ • La sensibilità La sensibilità di ibridazione di ibrida ione di una di na sonda non è assoluta. non è assol ta • Esempio: due palline spalmate di colla che si muovono in un contenitore si legano in ragione inversamente proporzionale alla dimensione del contenitore. In pratica, se il contenitore è troppo grande, le palline potrebbero non incontrarsi mai. Se però aumentiamo ti il numero delle d ll palline, la probabilità lli l b bilità aumenta t sensibilmente. Allo stesso modo, una sonda potrà agganciarsi alla sequenza di DNA complementare a patto che quest’ultima sia in quantità sufficiente. sufficiente • La capacità di una sonda di agganciare una sequenza di acido nucleico complementare è pari è ad 1pg (deve ( cioè è essere presente almeno 1pg di acido nucleico perché la relativa sonda si agganci). Sensibilità dei metodi molecolari - II • N Nell caso di HCV la sonda di HCV l d è costituita è tit it da d 40 40 nucleotidi, il peso dell’acido nucleico da agganciare è 40 x 330 (che è 40 x 330 (che è il è il peso molecolare peso molecolare di di ciascun nucleotide) = 13.200. mole di una sostanza chimica corrisponde è è • Una mole di una la quantità in grammi pari al suo peso molecolare. Così, una mole dell’acido nucleico da ibridare corrisponderà a 13.200 (che arrotondiamo per comodità a 13.000 grammi ovvero 13.000.000.000.000.000 picogrammi 13 000 000 000 000 000 picogrammi (1015 pg). Sensibilità dei metodi molecolari - III • LLa seguente t proporzione i mostra t quante t molecole l l sono presenti in 1pg di acido nucleico: • 6 x 1023 (n. di molec. in una mole) : X (n. di molec. in 1pg) = 13 x 1015 (pg in una mole) : 1pg • X = 50 x 106 • che è il è il numero di molecole di molecole che debbono essere presenti nel prodotto da analizzare, cioè la quantità minima di acido nucleico rilevabile mediante una sonda, che corrispondono ad altrettante molecole virali. Perciò, per poter virali Perciò per poter rilevare mediante una sonda la la presenza di una sequenza di acido nucleico virale, è necessaria la presenza di 50x106 molecole virali nella reazione di ibridazione.
