Crescita batterica
Giovanni Di Bonaventura, Ph.D.
CI «Microbiologia e Microbiologia Clinica»
CdS Medicina e Chirurgia
Università “G. d’Annunzio”, Chieti-Pescara
AA 2015-2016
Crescita batterica – fissione binaria
Crescita batterica – divisione cellulare
Durante la divisione, l’aumento dei costituenti
cellulari può tradursi in:
aumento delle dimensioni cellulari
microrganismi cenocitici: divisioni nucleari
non accompagnate da divisioni cellulari (es.
alghe, muffe)
aumento del numero cellulare (es. batteri,
lieviti, protozoi)
Rhodophyta spp. (alga rossa)
La Microbiologia generalmente studia la crescita di
una popolazione, piuttosto che la crescita delle
singole cellule
Rhizopus spp (Zigomicete, muffa)
Cinetica della divisione cellulare
La curva di crescita
Osservata quando i microrganismi vengono coltivati in terreno liquido (brodo)
Misura la variazione della “quantità” (massa totale o concentrazione) di batteri
nel tempo:
rappresentazione grafica di tipo “semilogaritmica”
Log10 (concentrazione cellulare espressa come CFU/ml, dove CFU= unità
formanti colonie) vs tempo
Si articola in 4 fasi (periodi), distinte e sequenziali
Fase di latenza (lag phase)
Fase di adattamento metabolico:
sintesi di nuovi enzimi per il metabolismo cellulare
sintesi di nuovi componenti strutturali cellulari
Numero cellulare costante; lieve aumento volumetrico
Durata variabile (specie-specifica):
in alcuni casi può essere di breve durata od assente
Fase esponenziale (log phase)
Tutti i microrganismi sono in fase di riproduzione attiva (max velocità)
gli eventi riproduttivi (di ciascuna cellula della popolazione) non
avvengono nello stesso tempo (coltura non sincronizzata)
Velocità di crescita costante nel tempo:
aumento del numero cellulare
aumento della massa cellulare totale
Popolazione uniforme per proprietà chimico-fisiche
Chiamata anche fase logaritmica
Fase stazionaria
Numero totale di cellulare vitali rimane costante:
Arresto della riproduzione Tasso riproduttivo controbilanciato dal tasso di
mortalità (no aumento n cellulare)
Metabolismo quasi quiescente (cryptic growth)
Espressione di specifici geni “di sopravvivenza”
Possibili cause:
Raggiungimento di una densità critica di popolazione
Accumulo dei cataboliti (azione tossica)
Limitazione dei nutrienti
Limitata disponibilità di O2
Fase di morte (declino)
Morte cellulare a velocità esponenziale
Morte:
perdita irreversibile della capacità di riprodursi
lisi cellulare
In alcuni casi, il tasso di mortalità rallenta a causa di un accumulo di cellule
“resistenti” (viable but not culturable, VBNC)
Crescita batterica
Modellizzazione matematica
Nt = N 0 x 2n
Nt = No x 2t
logNt = logN0 + n x log2
logNt - logN0= n x log2
n=
logNt - logN0
log2
n = 3.3 x (logNt - logN0)
Nt = n. cellule al tempo t
No = n. cellule al tempo 0
n= n. generazioni al tempo t
= n. generazioni nell’unità di tempo (h)
t = tempo trascorso
logNt = logNo + t
Tempo di generazione e velocità di crescita
g = t/n = tempo di generazione (necessario perchè il numero cellulare raddoppi)
k = n/t = velocità di crescita
La pendenza (slope) della retta è diretta funzione della velocità di crescita
La gran parte dei batteri ha un tempo di
generazione che oscilla tra 20 e 60
minuti, in condizioni ottimali (in vitro, in
laboratorio).
La maggior parte dei patogeni il tempo
di generazione osservato nell’ospite (in
vivo, al sito di infezione) è maggiore,
oscillando tra le 5 e le 10 h.
Crescita batterica
Diamo i numeri …
Se si avviasse una coltura batterica contenente 10 cellule di Escherichia coli (N0=10),
dopo 12 h di incubazione (t=12) avrebbero avuto luogo 36 generazioni (n=36;
considerando un tempo di generazione medio di 20 min), ossia la popolazione
batterica sarebbe composta da un numero Nt di cellule pari a:
Nt = N 0 x 2n
12 h
10 x 236 = Nt = 687.194.767.360 E. coli
… dopo 48 h di incubazione, il peso della popolazione risultante sarebbe
4.000 volte maggiore quello della Terra !!!
(una singola cellula pesa ~ 9.5 x 10-13 g)
Fortunatamente…non accade! La crescita viene infatti limitata dalla mancanza di
nutrienti essenziali e/o dalla produzione di cataboliti tossici.
La popolazione entra nella fase stazionaria.
Log phase (fase esponenziale)
Crescita “bilanciata”
Durante tale fase le cellule esibiscono una crescita bilanciata:
i costituenti cellulari vengono sintetizzati a velocità costante ed in maniera
congiunta
Di contro, si osserva crescita non bilanciata, quando:
modificazione del livello dei nutrienti
- shift-up (terreno "povero”
terreno “ricco”)
- shift-down (terreno “ricco”
terreno “povero”)
modificazioni delle condizioni ambientali
Concentrazione di nutrienti vs crescita
Colture continue
Chemostato
Coltura “vecchia” (in fase stazionaria)
Coltura “giovane” (in fase logaritmica)
Necessità di un modello che riproduca fedelmente la
situazione in vivo
Chemostato, consente il controllo indipendente di
velocità di crescita e densità cellulare:
velocità del terreno in ingresso = velocità del
terreno in uscita
nutriente essenziale in quantità limitanti
incremento costante del numero cellulare e
della massa batterica
Coltura sincronizzata vs non sincronizzata
Coltura non sincronizzata:
ogni cellula si riproduce a tempi
LEGGERMENTE DIFFERENTI.
La curva ha andamento lineare.
Coltura sincronizzata:
ogni cellula si riproduce allo
STESSO tempo.
La curva ha andamento a scala
(altezza di un gradino è 2x quella
del gradino precedente)
Escherichia coli
(tgen = 20 min)
Tecniche per la determinazione della
dimensione di una popolazione cellulare
Conta diretta cellulare
Conteggio in camera contaglobuli
Contatori elettronici
Filtrazione su membrana
Conta vitale cellulare
Metodo della semina su terreno agarizzato
Metodo di filtrazione su membrana
Conteggio mediante contaglobuli
Semplice, economico e veloce
Adatto per la conta di eucarioti e procarioti
Limitazioni:
NON fornisce informazioni sulla vitalità cellulare
scarsa precisione
disponibilità di un microscopio ottico
6
scarsa sensiblità (≥ 10 cells/ml)
Contatori elettronici
Passaggio “forzato” della sospensione microbica attraverso un orifizio di piccole
dimensioni
Il batterio viene investito da una corrente elettrica applicata all’orifizio
Conteggio degli eventi “interruzione” della corrente elettrica
Veloce e di semplice esecuzione
Adatto per microrganismi di dimensioni rilevanti e per cellule ematiche
Limitazioni:
NON distingue le cellule vive dalle morte
Conta vitale cellulare
Determina il numero di cellule vitali
La dimensione di popolazione viene espressa come unità formanti colonie
(UFC; oppure CFU: colony-forming units)
Conta vitale cellulare
Diluizioni seriali (10-fold) del campione
Semina (su terreno solido) delle
diluizioni del campione
Incubazione (37°C, 24h)
Conteggio del numero di colonie (UFC)
Calcolo n cellule nella popolazione
UFC/ml = n UFC x fattore diluizione
Metodo delle membrane filtranti
Particolarmente adatto per l’analisi dei campioni ambientali
Misura della massa cellulare
Peso secco
tempi lunghi
scarsamente sensibile
Quantità di un particolare costituente cellulare
proteina, DNA o ATP
adeguato se la quantità del target è costante in ogni cellula
Misurazione turbidimetrica (light scattering)
comune impiego
veloce, semplice e sensibile
Misurazione turbidimetrica
La densità ottica è la quantità di luce in
grado di passare attraverso la
sospensione batterica.
Principio: tanto maggiore sarà il numero
cellulare, tanto più densa (opaca) sarà la
coltura.
Questo significa che, in presenza di
crescita batterica, una quantità minore di
luce sarà in grado di passare attraverso il
campione, a causa della torbidità della
sospensione cellulare.
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