HALLOWEERD
BREAK
MICROBIOLOGIA
GENERALE
luciano castagna
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Prefazione
Il documento è diviso in tre sezioni.
La prima sezione tratta i principali argomenti di microbiologia generale.
Nella seconda sezione si considerano le tematiche della biologia molecolare.
Nella terza e ultima sezione si analizzano le principali caratteristiche dei più comuni
batteri di interesse alimentare .
La parte di batteriologia è stata sviluppata con il prezioso contributo di Mattia
Marrancone.
Per quanto possa sembrare esaustivo è sempre consigliabile consultare unitamente a questo
riassunto un testo di microbiologia e utilizzare questa presentazione esclusivamente come
guida e come supporto di approfondimento.
Castagna Luciano
2
MICROBIOLOGIA GENERALE
STORIA DELLA MICROBIOLOGIA
1665:Robert Hooke pubblica la teoria della cellula
1684:Antony Van Lovelock inventa il primo microscopio ottico a
300 ingrandimenti e consente di visualizzare per la prima
volta i microrganismi,di cui si ipotizzava l'esistenza
(animacules).
DIBATTITO SULLA TEORIA DELLA GENERAZIONE SPONTANEA
Alcuni scienziati credevano che alcune forme di vita potessero
essere generate spontaneamente da materia non vivente
1668:Francesco Redi verifica che le larve della mosca domestica
comparivano in contenitori chiusi con garza e contenenti
aria e non erano invece presenti in contenitori sigillati
ermeticamente.
Pasteur scopre che i microrganismi sono presenti su materia
inanimata e possono essere distrutti mediante calore;scopre
inoltre le tecniche di ASEPSI con cui prevenire l'accesso
dei microrganismi ai nutrienti.
1765:Lazzaro Spallanzani dimostra che contenitori contenenti
infusi organici sigillati ermeticamente e sottoposti a
trattamento termico,rimanevano stabili per lungo tempo;
a lievi fratture del vetro seguiva crescita microbica.
1805:Francois Appert scopre che alimenti deperibili sottoposti
a trattamento termico e chiusi in contenitori ermetici,
rimanevano stabili a temperatura ambiente per la
distruzione dei microrganismi.
1861:Pasteur pone fine alle controversie con l'esperimento
dei colli a becco di cigno:un brodo sterilizzato tramite
riscaldamento rimaneva sterile fino a quando si evitava
il contatto coi microrganismi;a contatto avvenuto seguiva
crescita microbica.
(1864):SCOPERTA DELLE SPORE E TYNDALLIZZAZIONE
1796:Jenner inocula il virus del Vaiolo in un bambino di otto ANNI,
DOPO 45 GIORNI SI OSSERVAVA CHE,INFETTATO DALLO
stesso virus,preso da un malato,non contraeva la malattia.
(teoria dell'immunita' e scoperta della vaccinazione).
1860:Lister utilizza il fenolo per la disinfezione delle ferite
chirurgiche (asepsi chirurgica).
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1876:Koch scopre il Bacillus Antracis e correla la presenza di
tale microrganismo alla manifestazione del Carbonchio
Ematico.
POSTULATI DI KOCH (1861)
Criteri necessari a correlare la presenza di un dato
microrganismo a una determinata malattia:
1)MICRORGANISMO EVIDENZIABILE IN OGNI CASO DI MALATTIA
2)MICRORGANISMO DEVE ESSERE ISOLATO IN COLTURA PURA
3)SE INOCULATO IN UN OSPITE RECETTIVO SANO DEVE RIPRODURRE
LA MALATTIA
4)MICRORGANISMO DI PARTENZA ISOLABILE DA OSPITE INFETTATO
SPERIMENTALMENTE
1883:Pasteur inventa i filtri da batteriologia
Abble e Zeiss inventano lenti a immersione e lenti
apocromatiche.
1931:Ernst Rushka inventa il microscopio elettronico.
Berg dimostra che frammenti di DNA umano possono
essere inoculati nel DNA batterico (DNA RICOMBINANTE).
1983:Scoperta del virus dell'HIV (Uman Immunodeficense Virus).
1997:Scoperta delle proteine infettanti (PRIONI),agenti
eziologici di encefalopatie spongiformi.
2000:Botox
2002:Bioterrorismo
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MICROSCOPIA
MICROSCOPIO OTTICO IN CAMPO CHIARO
E' il microscopio piu' usato nei corsi di microbiologia e
biologia. Consiste in due serie di lenti(obiettivo e oculare)
che definiscono l'immagine.La visualizzazione del campione
avviene grazie alla differenza di contrasto tra il campione
e il mezzo circostante,dovuta alla capacita' delle cellule di
assorbire o disperdere in varia misura la luce.
MICROSCOPIO OTTICO A CONTRASTO DI FASE
Possiede la caratteristica di migliorare il contrasto tra
cellula e mezzo circostante senza ricorrere alla colorazione.
Le cellule hanno indice di rifrazione diverso da quello del
mezzo circostante,quindi deviano parte dei raggi luminosi
che le attraversano.La luce che attraversa il campione viene
ritardata,un anello all'interno dell'obiettivo amplifica
tale effetto,si ottiene un'immagine scura su sfondo chiaro.
MICROSCOPIO OTTICO IN CAMPO SCURO
Ha un potere di risoluzione maggiore dei precedenti,e'
modificato in modo tale che la luce raggiunga il preparato
trasversalmente;l'unica luce che raggiunge la lente e'quella
dispersa dal campione che appare chiaro su sfondo scuro.
Viene utilizzato per osservare i flagelli.
MICROSCOPIO OTTICO A FLUORESCENZA
Si utilizza nel caso di elementi che emettono fluorescenza.
Se irradiati con luce di diverso colore danno all'oggetto un
colore diverso da quello originale,a causa della presenza
nella cellula di substrati fluorescenti(CLOROFILLA) o in
seguito a colorazione con colorante fluorescente.Viene
usato in microbiologia clinica a scopi diagnostici e in
ecologia microbica.
MICROSCOPIO OTTICO A CONTRASTO DI FASE INTERFERENZIALE (DIC)
Utilizza un polarizzatore per produrre luce polarizzata che
attraversa un prisma generando due fasci distinti,i quali,
attraversato il preparato,entrano negli obiettivi e si
condensano in uno solo.A causa di piccole differenze dell'indice
di rifrazione tra le sostanze si crea un'interferenza.
Tale effetto intensifica le differenze all'interno della cellula
e consente di visualizzare nucleo,vacuoli,spore e granuli
citoplasmatici,facendoli apparire TRIDIMENSIONALI.
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MICROSCOPIO OTTICO A FORZA ATOMICA (AFM)
Ha una visuale tridimensionale,simile a quella di un SEM,ma
permette di semplificare la preparazione del campione,consente
di osservare preparati a fresco,cosa impossibile per un
microscopio elettronico.Una punta sottilissima viene posta molto
vicino al campione da osservare,in modo tale che si stabiliscano
forze repulsive deboli,che permettono di scandire il campione
evidenziandone rilievi e avvallamenti.Le informazioni sono
trasmesse a un computer che genera la corrispondente immagine.
MICROSCOPIO OTTICO CONFOCALE A SCANZIONE LASER (CLSM)
Simile a un AFM,utilizza un raggio laser come sorgente luminosa,
il quale viene riflesso da uno specchio che lo dirige verso lo
scanner.Il raggio laser illumina il preparato perpendicolarmente,
cosi' da evidenziare,non solo gli strati superficiali(AFM),ma
anche i piu'interni. I preparati vengono colorati con coloranti
fluorescenti in modo da rendere visibili i diversi piani del
preparato.
MICROSCOPIO ELETTRONICO A TRASMISSIONE (TEM)
La radiazione luminosa e'sostituita da un fascio di elettroni,
le lenti sono costituite da elettromagneti.Il potere di risoluzione
e' piu' elevato di quello dei microscopi ottici e consente di
osservare anche strutture molecolari(PROTEINE-ACIDI NUCLEICI).
Il fascio di elettroni non possiede elevato potere di penetrazione,
occorre quindi tagliare la cellula in parti sottili per poterla
osservare.Il preparato viene colorato con permanganato,acido osmico
sali di uranio e piombo.Poiche' si tratta di elementi con elevato
numero atomico,essi disperdono bene gli elettroni e aumentano il
contrasto.
MICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONE (SEM)
Usato per visualizzare le parti piu' esterne della cellula in
alternativa alla colorazione negativa.Il campione viene ricoperto
di uno strato di metallo pesante.Un fascio di elettroni effettua la
scansione del preparato e gli elettroni dispersi dal metallo vengono
utilizzati per produrre l'immagine sullo schermo.
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STRUTTURA TIPICA DI UN MICROSCOPIO OTTICO
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TIPICO MICROSCOPIO OTTICO UTILIZZATO NEI LABORATORI DI MICROBIOLOGIA
MICRORGANISMI PROCARIOTI ED EUCARIOTI
Dei PROCARIOTI fanno parte batteri e archea:non hanno nucleo ma un
nucleoide,il materiale genetico(DNA) e' sparso nel citoplasma.Non
contengono steroli,e si riproducono per scissione binaria(la cellula
madre e' uguale alla cellula figlia),hanno dimensioni minori rispetto
agli eucarioti.
Degli EUCARIOTI fanno parte protozoi alghe e miceti:hanno nucleo
circondato da membrana contenente dei PORI nucleari,che trasportano
I ribosomi prodotti nel nucleolo(parte interna del nucleo),a livello
del citoplasma dove avviene la sintesi proteica.Contengono steroli
(molecole atte a dare rigidita'alla cellula) e sono piu' grandi dei
procarioti.
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LA PARETE CELLULARE
E' la struttura che circonda la membrana citoplasmatica.Conferisce
stabilita' e morfologia alla cellula.La sua composizione determina
il comportamento dei batteri rispetto alla COLORAZIONE DI GRAM.E'
il bersaglio di molti antibiotici.Costituita da N-ACETIL GLUCOSAMINA,
ACIDO N-ACETIL MURAMICO (mureina)e un glican-tetrapeptide costituito
da aminoacidi che si alternano nelle forme D ed L.
(L alanina,D glutamico,L lisina,D alanina).Nei gram negativi il terzo
aminoacido del tetrapeptide e' sostituito dal DAP(acido diaminopimelico).
La parete si forma tramite legami crociati tra il terzo aminoacido
di un tetrapeptide e il quarto aminoacido del peptide adiacente.
PARETE CELLULARE DEI GRAM POSITIVI
Nei gram positivi circa il 90% della parete e' costituito da
PEPTIDOGLICANO.La parete contiene inoltre ACIDI TEICOICI,ossia
polimeri di glicerolo o ribitolo fosfato i quali conferiscono
carica negativa alla superficie esterna e possono contribuire
al passaggio di ioni.Si legano con un legame covalente al
peptidoglicano.Acidi LIPOTEICOICI,si legano ai lipidi della
membrana citoplasmatica.Nei gram+ il legame si instaura tra la
L-LISINA di un peptide e la D-ALANINA terminale attraverso un
ponte pentaglicinnico.
L-ALANINA
D-GLUTAMICO
L-LISINA
GLiCINA
GLiCINA
D-ALANINA GLiCINA
GLiCINA
GliCINA
L-ALANINA
D-GLUTAMICO
L-LISINA
D-ALANINA
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PARETE CELLULARE DEI GRAM NEGATIVI
Nei gram negativi lo strato di peptidoglicano e' piu' sottile che nei
gram+ e rappresenta circa il 10% di tutta la parete.Lo strato di
peptidoglicano che racchiude la membrana citoplasmatica e' circondato
all'esterno da una membrana esterna costituita da proteine,lipoproteine
e lipopolisaccaridi e forma un doppio strato fosfolipidico.
L-ALANINA
L -ALANINA
D-GLUTAMICO
D-GLUTAMICO
DAP
DAP
D-ALANINA
D-ALANINA
Nei gram negativi vi e' legame diretto tra il DAP di un peptide
e la D-ALANINA del peptide adiacente.
PROTEINE(PORINE):legate al peptidoglicano
regolano la permeabilita' di piccole
molecole
MEMBRANA---LIPOPROTEINE DI BRAWN:legate al peptidoglicano
ESTERNA
e inserite nel doppio
strato lipidico con la
parte idrofobica.
Hanno funzione di ancoraggio.
LIPOPOLISACCARIDI:condizionano le proprieta'
antigeniche dei batteri.
Producono ENDOTOSSINE
Batteri privi di parete sono i MICOPLASMI
TRANSPEPTIDAZIONE
Ultima fase della sintesi della parete cellulare che consiste nella
formazione dei ponti pentaglicinnici dei gram+ e nella formazione dei
legami crociati tra i peptidi.L'azione delle autolisine(che provvedono
alla rottura controllata dei legami della parete) e' correlata a quella
delle proteine FTSZ che sintetizzano nuova parete.Il BACTOPRENOLO
rende
i precursori peptidoglicanici ai quali e' legato,sufficientemente
idrofobici da poter passare attraverso la membrana ,per poter
raggiungere
la parete ,dove daranno luogo alla sintesi di nuovo peptidoglicano,che Si
leghera'a quello preesistente.A livello della parete non e' disponibile ATP e
l'energia per la formazione dei legami e' data da una delle due D-ALANINA
terminali del pentapeptide che il bactoprenolo trasporta assieme a N-acetil
glucosamina e acido N-acetil muramico.
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LA PARETE DEGLI ARCHEA
Differisce da quella dei batteri per assenza di D-aminoacidi.L'acido
N-Acetil Muramico e' sostituito da acido N-Acetil Talosaminuronico
(NAT) e il legame beta 1-4,caratteristico dei batteri,
e' sostituito dal legame beta 1-3 tra gli zuccheri.Quest'ultimo,
a differenza del legame batterico beta1-4,non e' sensibile al
LISOZIMA;un particolare enzima prodotto dall'uomo,presente nella
saliva e nelle lacrime,che danneggia la parete batterica rompendo
i legami beta1-4 che legano tra loro le unita' costitutive del
peptidoglicano.
LE FORME L:Sono batteri che hanno perso la capacita' di produrre
peptidoglicano,possono essere reversibili(se sono in grado
di riacquistare questa capacita') o stabili(nel caso in
cui non sono in grado di riacquisire tale capacita').
ESAME BATTERIOSCOPICO:LA COLORAZIONE DI GRAM
E' una colorazione differenziale:utilizza piu' di un colorante per
distinguere i gram+ dai gram-.
La differente colorazione dei gram+ rispetto ai gram- e'dovuta alla
struttura della parete cellulare.I GRAM+ HANNO UNO STRATO DI
PEPTIDOGLICANO PIU' SPESSO CHE TRATTIENE MEGLIO IL COLORANTE
PRIMARIO
(cristalvioletto).L'alcol favorisce la coartazione del colorante e il
fatto che esso venga trattenuto dai gram+ dopo la decolorazione
dipende proprio dal decolorante;l'alcol infatti nei gram+ riduce la
porosita' della parete,trattenendo il complesso cristalvioletto-iodio
dopo la decolorazione.
Nei gram- la decolorazione con acetone estrae i lipidi della membrana
esterna aumentando la porosita' della parete.La decolorazione e'
inoltre favorita dal peptidoglicano,che come gia' ricordato,ha
spessore inferiore rispetto ai gram+ e non riesce a trattenere il
complesso cristalvioletto-iodio.
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FASI DELLA COLORAZIONE DI GRAM
1. ALLESTIMENTO DEL PREPARATO,da brodocoltura,puo' essere immesso
direttamente sul vetrino portaoggetto,o da coltura su agar,in tal caso
il preparato e' stemperato con una goccia di diluente posizionata
sul vetrino(si usa sempre soluzione fisiologica isotonica
ES:0,85%diNaCl).
2).DISTENSIONE:Il preparato e' disteso sul vetrino tramite un'ansa di
modo da ottenere uno strato uniforme e adeguato,non troppo spesso(tale
da rendere inefficace la decolorazione) e non troppo sottile (il che
causerebbe la rarefazione dei microrganismi).
3).ESSICCAMENTO:Il preparato e' asciugato all'aria o tramite blando
riscaldamento su fiamma bunsen.
4).FISSAZIONE:Garantisce l'adesione del preparato al vetrino e la
stabilita' della morfologia batterica.Puo' essere effettuata
fisicamente,tramite prolungato passaggio del vetrino sul
bunsen(2-3volte),o chimicamente tramite l'utilizzo di solventi
fissatori:ETANOLO PURO 10min,ETANOLO-ETERE in parti uguali 5min o
METANOLO 3min.
5).COLORAZIONE:con cristalvioletto per 2-3 minuti e successivo
risciacquo per eliminare il colorante in eccesso.TUTTI I BATTERI SONO
COLORATI DI VIOLA.
6).TRATTAMENTO CON LIQUIDO DI LUGOL:Soluzione di iodio e ioduro di
potassio per 2-3 minuti.Formazione dei complessi cristalvioletto-iodio
(insolubili in H2O ma solubili in alcol),che vengono assorbiti dai
gram+.Successivo risciacquo e allontanamento dell'acqua in eccesso.
7).DECOLORAZIONE CON ALCOL-ACETONE(4-1) per 30sec/1min.
Successivo risciacquo e allontanamento dell'acqua in eccesso.LA
DECOLORAZIONE RIMUOVE I COMPLESSI CRISTALVIOLETTO-IODIO DAI
GRAM- E IL COLORANTE RESTA ESCLUSIVAMENTE SUI GRAM+ CHE RESTANO
VIOLETTI.
8).COLORAZIONE DI CONTRASTO con safranina,fucsina basica eosina5 o
carbolfucsina per 1 o 2 min.Il colore rosso di contrasto e' assorbito
dai gram-,decolorati precedentemente con alcol o acetone.
9).LAVAGGIO E ASIUGAMENTO:All'aria o con carta bibula.
10).OSSERVAZIONE al microscopio ottico.Si pone il preparato con sopra
una goccia di olio di cedro utilizzando per l'osservazione un
obiettivo a immersione con un ingrandimento di 1000x.
GRAM POSITIVI VIOLA(o blu se si utilizza blu di metilene al posto
del cristalvioletto come colorante primario)
GRAM POSITIVI BLU-VIOLA
GRAM NEGATIVI ROSSO/ROSA
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LA MEMBRANA CITOPLASMATICA DEI BATTERI
Presente in tutti i batteri,e'la struttura posta all'interno della
parete cellulare,composta da un doppio strato
fosfolipidico.E'attraversata da proteine transmembrana.Non contiene
steroli,presenti invece nella cellula eucariotica,essi forniscono
stabilita' alla cellula.La membrana dei batteri e' meno rigida di
quella degli eucarioti:cio' e' dovuto proprio all'assenza di
steroli,molecole presenti nei MICOPLASMI,i quali rappresentano una
eccezione tra i batteri.Altri batteri contengono molecole
simili agli steroli:gli OPANOIDI che stabilizzano la membrana.
La struttura generale della membrana e' a
MOSAICO FLUIDO (il doppio strato fosfolipidico e'
attraversato da proteine transmembrana che scorrono liberamente al suo
interno,cio' e' dovuto alla consistenza oleosa della membrana che e'
fondamentale per permettere alla cellula di effettuare gli scambi di
nutrienti:Prendere sostanze dall'esterno ed allo stesso tempo,
espellere le sostanze di rifiuto prodotte nel citoplasma.Con una
variazione di temperatura,si verifica la TRANSIZIONE DI FASE DEI LIPIDI
DI MEMBRANA,un processo di cambiamento di stato dei lipidi da rigido a
fluido tramite riarrangiamento delle catene di acidi grassi dei
fosfolipidi.Lo stato RIGIDO e' favorito da acidi grassi SATURI
contenenti legami singoli e caratterizzati da catene diritte e
lunghe. (TRANS).(Essi sono solidi a temperatura ambiente)
Lo stato FLUIDO e' favorito da acidi grassi
INSATURI,contenenti doppi e tripli legami e caratterizzati da catene
corte (CIS),che sono fluidi a temperatura ambiente.
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FUNZIONI DELLA MEMBRANA CITOPLASMATICA
1).TRASPORTO DI MOLECOLE:La membrana citoplasmatica e'una membrana
a permeabilita' selettiva,essa consente il passaggio di particolari
nutrienti utili alla cellula e impedisce che ne entrino altri.Regola
inoltre la quantita'di acqua all'interno e all'esterno della cellula.
2).SITO DI ANCORAGGIO:Di numerose proteine nonche' sede della
produzione di energia(a livello della membrana avviene la sintesi di
ATP,utilizzato per il trasporto di sostanze generalmente dall'esterno
verso l'interno.LA MEMBRANA CITOPLASMATICA SVOLGE LA STESSA
FUNZIONE A
CUI SONO ADIBITI I MITOCONDRI NELLA CELLULA EUCARIOTICA.
3).REGOLAZIONE DELLA RIPRODUZIONE:Le proteine della membrana si
legano al DNA favorendo la separazione dei cromosomi.La separazione
delle due cellule figlie avviene a partire dal setto trasverso generato
dalla membrana o forse dai MESOSOMI.
4).SINTESI DELLA PARETE CELLULARE:Le proteine di membrana specifiche
trasportano le molecole necessarie alla formazione della
parete,attraverso la membrana.Inoltre il setto per la formazione della
parete si origina dalla membrana.
5).RESPIRAZIONE:La membrana contiene enzimi dei MITOCONDRI e dei
CLOROPLASTI.Aumentando la superficie aumenta l'attivita' respiratoria
6).FOTOSINTESI:Altre invaginazioni della membrana:CROMATOFORI E
TILACOIDI,incrementano l'attivita' fotosintetica poiche' contengono
pigmenti ed enzimi fotosintetici.
fotosintetica.La respirazione e'favorita anche da particolari
invaginazioni della membrana:i MESOSOMI.
TRASPORTO ATTIVO E PASSIVO
TRASPORTO ATTIVO:Avviene contro gradiente di concentrazione e richiede
energia.Tipi di trasporto attivo sono:1)ANTIPORTER 2)SIMPORTER
3)UNIPORTER 4)TRASLOCAZIONE DI GRUPPO 5)SISTEMA A-B-C.
TRASPORTO PASSIVO:Avviene secondo gradiente di concentrazione e non
richiede energia.Tipi di trasporto passivo sono:1)DIFFUSIONE SEMPLICE
2)DIFFUSIONE FACILITATA 3)OSMOSI.
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SISTEMI DI TRASPORTO ATTIVO
1).SIMPORTER:trasporto contemporaneo di due molecole nello stesso
senso.
2).ANTIPORTER:trasporto contemporaneo di due molecole nelle
direzioni opposte.
3).UNIPORTER:trasporto di un'unica sostanza dall'esterno all'interno.
LAC-PERMEASI DI E.coli
E' un simporter,prende una molecola di lattosio assieme ad un protone
H+,man mano che il lattosio viene trasportato all'interno della cellula
diminuisce la forza proton-motrice e si accumula soluto a sufficienza
(in tal caso il lattosio),per essere metabolizzato dalla cellula.
TRASLOCAZIONE DI GRUPPO
La cellula utilizza energia fornita dal PEP (fosfoenolpiruvato).Durante
il trasporto attraverso la membrana la molecola da trasportare viene
modificata chimicamente in modo da non poter piu' riattraversare la
membrana in senso inverso,attraverso la FOSFOTRASFERASI.
Un esempio di traslocazione di gruppo e' la fosforilazione del
glucosio in E.coli.
FOSFORILAZIONE DEL GLUCOSIO
Tale processo atto alla produzione di energia utilizzata per il
trasporto del glucosio all'interno della cellula,consiste in una
modifica della struttura chimica del glucosio tramite l'aggiunta di un
gruppo fosfato.Quet'ultimo proviene dal fosfoenolpiruvato e fornisce
l'energia per il trasporto del glucosio all'interno della cellula
previo attraversamento della membrana citoplasmatica.In E.coli il
sistema fosfotrasferasico e'costituito da 5 componenti proteici,piu'
esattamente enzimi.Il gruppo fosfato proveniente dal
fosfoenolpiruvato,si stacca da quest'ultimo e viene trasferito
alternativamente attraverso i componenti del sistema
fosfotrasferasico,le cui proteine,vengono fosforilate e defosforilate
prima che il gruppo fosfato raggiunga l'enzima 2c,ossia la proteina
transmembrana che si occupa del trasporto della molecola di glucosio
fosforilato all'interno della cellula.Tale processo richiede energia
che viene tuttavia ampliamente recuperata successivamente mediante la
GLICOLISI.LA FOSFORILAZIONE DEL GLUCOSIO E' SOLO LA PRIMA TAPPA DI
TALE PROCESSO FINALIZZATO ALLA PRODUZIONE DI ATP MEDIANTE
SCISSIONE DEL GLUCOSIO IN PIRUVATO.
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IL SISTEMA A-B-C (trasporto del maltosio in E.coli)
Avviene grazie a tre componenti:
1).proteina di legame periplasmatica con elevata affinita' per il
substrato
2).proteina transmembrana con funzione di canale di trasporto
3).proteina citoplasmatica(ATP-asi)in grado di idrolizzare l'ATP in
ADP+P INORGANICO,per fornire l'energia utile al processo di
trasporto.
Nei gram- le proteine periplasmatiche che sono mobili nel periplasma
legano il substrato formando un complesso che interagisce con la
proteina integrale di membrana(TRANSMEMBRANA)e il trasporto avviene
per idrolisi di ATP.
Nei gram+ le proteine non sono mobili ma ancorate alla membrana,una
volta che il substrato si e' legato alla proteina di legame il
complesso che si forma interagisce con la proteina transmembrana.Anche
in
questo
caso
il
trasporto
avviene
per
idrolisi
di
ATP.
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SISTEMI DI TRASPORTO PASSIVO
1).DIFFUSIONE SEMPLICE:Movimento di molecole o ioni dovuto a un
gradiente di concentrazione;il processo continua
spontaneamente fino al raggiungimento
dell'equilibrio.
2).DIFFUSIONE FACILITATA:La sostanza si lega a una proteina di
trasporto specifica.Se la molecola e' troppo
grande viene degradata da enzimi prodotti dai
batteri e poi trasportata con la PERMEASI.
3).OSMOSI:Movimento di molecole di solvente (H2O) attraverso una
membrana semipermeabile causata da un gradiente di
concentrazione esterno.
LA PRESSIONE OSMOTICA
Pressione necessaria a impedire il passaggio di acqua da una soluzione
piu' diluita ad una piu' concentrata attraverso una membrana
semipermeabile.
EFFETTO DELLA PRESSIONE OSMOTICA SULLA CELLULA
CASO1:soluzione IPOTONICA rispetto alla cellula:la pressione osmotica
della cellula e' maggiore rispetto a quella della soluzione.La cellula
non puo' contrastare l'osmosi e l'acqua,dalla soluzione si riversa
all'interno della cellula che va in LISI OSMOTICA.
CASO2:soluzione IPERTONICA rispetto alla cellula:la cellula contrasta
l'osmosi ma la pressione osmotica cellulare e' troppo forte,tanto da
consentire il superamento del VOLUME CRITICO.L'acqua passa dalla
cellula all'esterno e la cellula riduce le sue dimensioni tanto da non
poter piu' contenere al suo interno i ribosomi e gli altri organuli
cellulari,che si distruggono provocando la morte della cellula stessa.
CASO3:soluzione ISOTONICA con la cellula:La pressione osmotica della
soluzione eguaglia quella all'interno della cellula.La parete si rompe
e la cellula rimane intatta liberando il PROTOPLASTO.
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------N.B.
PROTOPLASTO:cellula che ha perso la parete cellulare
SFEROPLASTO:cellula che ha perso la parete cellulare ma alla quale
sono rimasti attaccati dei resti della stessa.
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PER LA COLTIVAZIONE DI UN MICRORGANISMO NON SI USA MAI ACQUA
DISTILLATA
POICHE' NON SI PUO' RAGGIUNGERE L'EQUILIBRIO E LA CELLULA LISA
IMMEDIATAMENTE.PER EVITARE LA LISI CELLULARE SI USA SEMPRE
SOLUZIONE FISIOLOGICA ISOTONICA RISPETTO ALLA CELLULA (nella
maggior parte dei casi si utilizza NaCl 0,85%).
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STRUTTURE DI SUPERFICIE DEI BATTERI
1).CAPSULA:Rivestimento esterno di natura polisaccaridica che aderisce
in modo compatto alla superficie ed e' differenziabile tramite
COLORAZIONE NEGATIVA utilizzando inchiostro di china.La capsula
aderisce ai tessuti protegge da antibatterici e favorisce l'azione patogena.
2).STRATO MUCOSO:Rivestimento esterno di natura polisaccaridica
costituito da materiale distribuito in modo lasso e diffuso
nell'ambiente circostante.
3).GLICOCALICE:Rivestimento esterno composto da fibrille
polisaccaridiche lasse che favoriscono l'adesione della
cellula batterica alle superfici e/o ad altre cellule
batteriche .Nei batteri di interesse alimentare e
biomedico favorisce l'adesione alle superfici e la
creazione del BIOFILM.
UN BATTERIO CAPACE DI FORMARE BIOFILM E'LO STREPTOCOCCUS
MUTANS AGENTE EZIOLOGICO DELLA CARIE DENTARIA.
4.S.LAYER O STRATO PARACRISTALLINO:strato superficiale composto da
proteine, presente in molti batteri(negli archea corrisponde alla parete
cellulare).La struttura cristallina dell'S.LAYER puo' essere:
ESAGONALE:a 6 lati
TETRAGONALE:a 4 lati
TRIMERICA:a 3 lati
Si ipotizza che abbia due funzioni:
1).REGOLAZIONE DELLA PERMEABILITA':consente il passaggio di
molecole a basso peso molecolare ed esclude
quelle di dimensioni maggiori.
2).FUNZIONI ANTIFAGOCITARIE:protegge la cellula batterica da danni
alla struttura esterna e dai meccanismi di difesa dell'ospite.
PROTEGGE LA CELLULA DALLA LISI OSMOTICA.
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REAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO:L'anticorpo si lega all'antigene
impedendo a quest'ultimo di manifestare l'infezione.
(nel caso dell'antigene K inibisce l'azione patogena)
LE APPEDICI BATTERICHE
I FLAGELLI:Filamenti proteici responsabili della motilita' dei
batteri.Osservati al microscopio ottico tramite colorazione di LEIFSON
e GREY,e al microscopio elettronico.I flagelli degli eucarioti spostano
la cellula con movimento ondulatorio (per SBATTIMENTO).I flagelli dei
batteri attraverso movimento ROTATORIO antiorario per avanzare e orario
per indietreggire o semplicemente fermarsi.
I flagelli sono composti da:
1).FILAMENTO:Cilindro rigido,a cui si imprime il movimento rotatorio.
composto da una singola proteina (flagellina).
2).GANCIO:Segmento curvo giunto tra filamento e corpo basale costituito
da proteine diverse dalla flagellina.
3).CORPO BASALE:Piccolo asse centrale inserito in una serie di anelli
che imprime il movimento rotatorio.Costituito da proteine FLI,che
invertono la rotazione in risposta agli stimoli,e da proteine MOT che
fanno ruotare il filamento.I flagelli si formano da 40 geni (geni fla).
Le subunita' di flagellina codificate dai geni fla sono trasportate
attraverso il nucleo del filamento e si aggregano in catene,(il
filamento cresce dalla punta alla base),guidate dalla proteina
CAP(cappuccio).
GLI ANELLI DEL CORPO BASALE SONO:anelli SM:localizzati a livello della
membrana citolasmatica,anello P:localizzato a livello del
peptidoglicano e anello L:localizzato a livello dei lipopolisaccaridi.
Gli anelli S-M sono presenti sia nei gram+ che nei gram-.
Gli anelli P-L sono presenti solo nei gram-.
LE TASSI
Associate al movimento flagellare.Sono movimenti verso uno stimolo o in
direzione opposta ad esso.La cellula e' dotata di recettori a livello
della parete che la orientano nell'ambiente:la conducono verso i
nutrienti e attivano le proteine FLI per cambiare direzione,se il
batterio si trova nelle vicinanze di un antibiotico (sostanza dannosa
per i batteri).
IL MOVIMENTO FLAGELLARE
L'energia per il movimento dei flagelli e'fornita dalla FORZA
PROTON-MOTRICE:uno strato energizzato tra le due facce della membrana.
La proteina MOT consuma il gradiente di H+ che produce ATP,usato come
fonte energetica per il movimento.A seconda della capacita' di
movimento i flagelli si classificano in:
1).POLARI UNIDIREZIONALI:caratterizzati da rotazione esclusivamente
oraria con cui il flagello spinge la cellula
in avanti.Per cambiare direzione la cellula si
19
ferma e cambia orientamento in risposta agli
stimoli.
2).POLARI BIDIREZIONALI:caratterizzati da rotazione ANTIORARIA(con cui
il flagello spinge la cellula in avanti),e da
rotazione ORARIA(con cui il flagello spinge la
cellula in direzione opposta a quella normale).
A seconda della posizione in cui si trovano rispetto alla cellula i
flagelli si classificano in:
1).LOFOTRICHI:Ciuffo di flagelli localizzato in un unico
punto(Campylobacter)
2).PERITRICHI:Singoli flagelli sparsi in piu' punti della cellula,che
si uniscono a formare un fascio che produce il
movimento.(tipici delle enterobacteriacee esclusi
SHIGELLA e ENTEROBACTER che sono immobili.Si trovano nel
genere LISTERIA e in alcune specie del genere VIBRIO).
CLOSTRIDIUM spp (mobile per ciglia peritriche).
3).POLARI:Si muovono in una sola direzione (UNIDIREZIONALI) o in
entrambe le direzioni (BIDIREZIONALI).Generalmente si tratta
di un singolo localizzato ai poli della cellula.(tipici di
LEGIONELLA,PSEUDOMONAS E VIBRIONACEE
LA COLORAZIONE DEI FLAGELLI
I flagelli sono osservati comunemente col microscopio elettronico,per
poterli osservare al microscopio ottico,e' necessaria una specifica
colorazione chiamata COLORAZIONE DI LEIFSON-GREY.
I flagelli vengono dapprima trattati con ACIDO TANNICO e ALLUME DI
POTASSIO,per aumentarne lo spessore,e successivamente vengono
colorati
con:PARAROSANILINA(metodo di Leifson) o con FUCSINA BASICA(metodo di
Grey).
I FILAMENTI ASSIALI
Chiamati anche ENDOFLAGELLI,sono fasci di fibre che originano alle due
estremita' della cellula,sono rivestiti di materiale della parete
cellulare e sono presenti in alcuni microrganismi,si muovono per
rotazione longitudinale,flessione o movimento
ondulatorio.Caratteristici di TREPONEMA PALLIDUM e BORRELIA
BURGDORFERI.
20
PILI O FIMBRIE
Sono simili ai flagelli,anche loro di natura proteica,non hanno
funzione motoria e sono costituiti da catene di PILINA.Si dividono in:
PILI COMUNI:Aderiscono ai tessuti dell'ospite e a superfici
PILI SESSUALI:Coinvolti nel processo di coniugazione dei batteri.
CITOPLASMA E STRUTTURE INTRACITOPLASMATICHE
Il citoplasma dei procarioti si compone di acqua,proteine,lipidi e
altre molecole.Negli eucarioti vi e' la presenza del citoscheletro
(cellule animali e vegetali),ossia una rete di microfilamenti e
microtubuli che ha funzione di sostegno.
NUCLEOIDE:Singola molecola di DNA circolare a doppio filamento,
CROMOSOMA:aploide(la cellula figlia e' identica alla cellula madre).
il cromosoma e' attaccato alla membrana.Contiene le
informazioni indispensabili alla sopravvivenza della
cellula(la perdita del cromosoma comporta la morte della
cellula).
DNA:privo di rivestimenti proteici (nei procarioti dna nudo sparso nel
citoplasma),ripiegato a formare una struttura circolare tramite
legame covalentemente chiuso tra le estremita' coesive.(lunghezza
di 1mm).
PLASMIDI:Porzioni di DNA extracromosomico a doppio filamento,veicolano
informazioni non essenziali alla sopravvivenza della cellula,ma possono
conferire alla cellula caratteristiche
speciali quali la resistenza agli antibiotici e alle
tossine,nonche' la capacita' di produrre tossine e particolari
enzimi.
CURING:Eliminazione dei plasmidi,non comporta la morte della cellula e
il batterio sopravvive.Un plasmide puo' essere trasferito da un
batterio ad un altro tramite coniugazione e puo' essere altresi'
inglobato all'interno del cromosoma,in tal caso si definisce EPISOMA.
PLASMID FINGERPRINT:Consiste nella separazione dei plasmidi mediante
elettroforesi in GEL DI AGAROSIO previa lisi cellulare.E' un profilo
plasmidico utile per la tassonomia e gli studi sulla patogenicita'.Si
effettua tramite confronto tra il profilo ottenuto e quello dei
patogeni accertati.Pur essendo un ottimo metodo non viene mai usato da
solo poiche' i patogeni possono acquisire plasmidi da altre specie e
perdere i propri.
21
I PLASMIDI CONIUGATIVI:Sono piu' grandi dei normali poiche' possiedono
i geni per il trasporto da un batterio all'altro.Tali geni,sono localizzati
nella regione TRA dove sono presenti anche i geni per la formazione dei PILI
SESSUALI,fondamentali per la coniugazione.
I RIBOSOMI:Organuli cellulari responsabili della sintesi proteica,il
loro numero e' direttamente proporzionale alla velocita' con cui tale
processo si verifica.
N.B.
ALCUNI ANTIBIOTICI INIBISCONO LA SINTESI PROTEICA DEI BATTERI E NON
DELL'OSPITE PERCHE' LA COMPOSIZIONE CHIMICA DEI RIBOSOMI
BATTERICI E' DIFFERENTE DA QUELLA DEI RIBOSOMI EUCARIOTICI:
PROCARIOTI ribosomi 70S
EUCARIOTI ribosomi 80S
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INCLUSIONI CITOPLASMATICHE
1).GRANULI METACROMATICI:Chiamati cosi' perche' talvolta,se trattati
con coloranti blu si colorano di rosso.Sono
riserve di fosfato inorganico utilizzate per
la sintesi di ATP.Sono presenti nei batteri,
miceti,alghe e protozoi.
2).GRANULI POLISACCARIDICI:sono riserve di Glicogeno(rosso)
e di Amido(blu),dimostrabili tramite
colorazione con iodio.
3).INCLUSIONI LIPIDICHE:Presenti in
Bacillus,Mycobacterium,Azotobacter,Spirillum.
Dimostrabili tramite colorazione con coloranti
liposolubili(colorante di SUDAN).Nei batteri
una delle sostanze lipidiche di riserva e'
l'acido poli-beta-idrossibutirrico.
4).GRANULI SULFUREI:Riserve costituite da zolfo e da composti
solforati,presenti nei batteri
sulfurei(TYOBACILLUS),i quali ricavano energia
dall'ossidazione dello zolfo e dei composti
solforatI.
5).CARBOSSISOMI :Inclusioni contenenti l'enzima RIBULOSIO 1-5
DIFOSFATOCARBOSSILASI che fissa la CO2 durante la
fotosintesi.Si trovano nei batteri nitrificanti,
tiobatteri e cianobatteri.
6).MAGNETOSOMI:Inclusioni di ossido di ferro (Fe3O4):Magnetite.
Presenti nei batteri che si comportano come magneti.Questi
batteri si muovono se sottoposti a un campo
magnetico.(Acquaspirillum Magnetotacticum).I
magnetosomi sono utili nel movimento verso un sito di
attacco.Se coltivati in vitro i batteri contenenti
magnetosomi decompongono il perossido di idrogeno,forse
22
per impedirne l'accumulo.Dai magnetosomi si estrae
Magnetite per supporti magnetici ed informatici.
VESCICOLE GASSOSE
Presenti nei cianobatteri,nei procarioti acquatici,alobatteri e batteri
fotosintetici.Sono cavita' ripiene di gas rivestite di proteine;la loro
funzione e'quella di mantenere a galla i batteri anche in acque
profonde,in modo da consentire ai batteri stessi di rifornirsi di
nutrienti,ossigeno e luce.
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LA SPORA BATTERICA
Forma di resistenza prodotta da alcuni batteri,generalmente gram
positivi(BACILLUS,CLOSTRIDIUM),ma anche da alcuni gram-(COXIELLA
BURNETII).Alcuni sporigeni tollerano PH acido.La spora ha una
straordinaria resistenza ad agenti chimici e fisici e rimane inattiva
in condizioni normali.La sporogenesi avviene in fase stazionaria,quando
la cellula ha esaurito i nutrienti o non e'in condizioni di crescita
ottimali a causa di un danno subletale.Il processo di sporogenesi
richiede i geni SPO per la sintesi di proteine che determinano la
resistenza della spora.
STRUTTURA DELLA SPORA:La spora e' formata da:
1).ESOSPORIO:Rivestimento sottile piu' esterno
2).TUNICA SPORALE:Spesso strato proteico,fornisce resistenza agli
agenti chimici(si divide in esterna e interna)
3).CORTECCIA:Occupa 1/2 del volume della spora,costituita da
peptidoglicano.Conferisce resistenza fisica e disidrata il
protoplasto proteggendo la spora dal calore e dalle
radiazioni.
4).PARETE DEL CORE:Rivestimento del protoplasto
5).CORE:(Protoplasto).Rappresenta il corpo della spora .Contiene ACIDO
DIPICOLINICO che complessato con ioni calcio stabilizza il
DNA.Nel core sono localizzate le SASP(Small Acid Soluble
Proteins);piccole proteine acido-solubili che legano il DNA
proteggendolo dal calore.(la resistenza al calore e' dovuta
principalmente alle SASP).
GERMINAZIONE DELLA SPORA
La germinazione e' il ritorno della spora alla cellula vegetativa.Tale
processo e' preceduto dall'attivazione.Per germinare la spora ha
bisogno di raggiungere una temperatura ottimale(temperatura di
attivazione).La germinazione si verifica quando,raggiunta la
temperatura di attivazione,si ripristinano le condizioni per una
crecita ottimale(abbondanza di nutrienti e riparazione dei
23
danni subletali cellulari).Fino ad allora la spora rimane inattiva,molto
piu'resistente della cellula allo stato vegetativo,ma incapace di
interagire con altre cellule.
MORFOLOGIA DELLA SPORA
A seconda della posizione occopata dalla spora all'interno dello
sporangio e delle sue dimensioni,le spore si classificano in:
1).BATTRIDI:Spora equatoriale o subterminale con diametro uguale a
quello della cellula
2).CLOSTRIDI:Spora equatoriale o subterminale con diametro maggiore
dquello della cellula
3).PLETTRIDI:Spora terminale con diametro maggiore di quello della
cellula (a bacchetta di tamburo)
COLORAZIONE DELLA SPORA (Shaffer-Fulton)
1).STESURA-ESSICCAMENTO-FISSAZIONE del preparato
2).COLORAZIONE con soluzione 5% verde malachite per 30 sec,riscaldando
fino a sviluppo vapori
3).LAVAGGIO con acqua e successiva colorazione con safranina
0,5%(30sec)
4).LAVAGGIO E ASCIUGAMENTO:le spore sono colorate di verde-azzurro e
le forme vegetative di rosa bruno.
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FATTORI CHE CONDIZIONANO LA CRTESCITA MICROBICA
Vi sono dei fattori che condizionano la crescita dei microrganismi:
1).TEMPERATURA
2).OSSIGENO
3).PRESSINE OSMOTICA
4).ATTIVITA' DELL'ACQUA
5),pH
6).NUTRIENTI
7).TEMPO
in base ai quali possiamo verificare il comportamento e le
caratteristiche dei microrganismi.
TEMPERATURA:la riduzione rallenta la crescita.In base ad essa i
microrganismi si dividono in:
PSICROFILI:un tempo si definivano psicrofili tutti i microrganismi
capaci di crescere a 0°C.Ora si definiscono psicrofili
24
organismi che crescono a 0°C che hanno optimum di crescita a
15øC (non crescono a temperatura ambiente).Sono
caratterizzati da membrana ricca di acidi grassi INSATURI
capaci di mantenere la fluidita' a basse temperature.
PSICROTROFI:Crescono a 0°C ma hanno optimum di crescita tra 20 e 30
gradi. Tipici di alimenti surgelati.
MESOFILI:Optimum da 20°a 40° un minimo di 15 e un massimo di
45øC.Comprendono specie patogene per l'uomo e gli animali e
sono i piu' numerosi.
TERMOFILI:Optimum 55-65°C,minimo 45°C,massimo sopra i 100°C.
TERMOFILI ESTREMI:Fino ai 113°C.Sono caratterizzati da membrana ricca di
acidi grassi SATURI ,sistemi di sintesi proteica
ed enzimi termostabili efficaci ad alte
temperature.Si trovano negli abissi oceanici e nelle
sorgenti termali dove l'elevata pressione mantiene l'acqua liquida sopra i
100°C.Ad alte temperature le
strutture cellulari dei termofili e ipertermofili restano stabili.
OSSIGENO
Serve come accettore terminale di elettroni nella respirazione
aerobia.E' utilizzato per la sintesi di steroli e acidi grassi insaturi
negli organismi eucarioti.A seconda della tolleranza all'ossigeno i
batteri si classificano in:
AEROBI OBBLIGATI (STRETTI):Crescono solo in presenza di ossigeno.
ANAEROBI FACOLTATIVI:Non richiedono ossigeno per la crescita ma
crescono meglio in presenza di ossigeno.
ANAEROBI AEROTOLLERANTI:Ignorano l'ossigeno e crescono allo stesso
modo in sua presenza e in sua assenza.
ANAEROBI OBBLIGATI (STRETTI):Non tollerano l'ossigeno e crescono solo
in sua assenza (condizione di anaerobiosi).
MICROAEROFILI:Richiedono un livello di ossigeno inferiore a
quello atmosferico (2-10%).
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GLI ENZIMI CHE REGOLANO IL COMPORTAMENTO DEI BATTERI RISPETTO
ALL'OSSIGENO
1).CATALASI:Inattiva il perossido di idrogeno ottenendo acqua e ossigeno
molecolare (non tossico):2(h2o2)
2(h20)+o2 (aerobi stretti)
2).PEROSSIDASI:Inattiva il perossido di idrogeno tramite un agente
riducente che riduce il perossido in acqua:
h2o2+NADH+H+ 2(H20)+nad+
3).SUPEROSSIDO-DISMUTASI:agisce in collaborazione con la catalasi:
O2-+O2-+2H+
H2O2+O2
4).SUPEROSSIDO DISMUTASI\CATALASI IN COMBINAZIONE
4(O2-)+4H+
2(H20)+3(O2)
5).SUPEROSSIDO-RIDUTTASI:riduce l'anione superossido in perossido:
O2-+(2H+)+cyt c ridotto
H2O2+cyt c ossidato (anaerobi stretti)
6).OSSIDASI:Riduce l'ossigeno in acqua
O2+4h+
2(h20)
ATTIVITA' DELL'ACQUA a.w ((disponibilita' di acqua all'esterno e
all'interno della cellula)
La parete cellulare mantiene la forma e l'integrita' della
cellula,tuttavia la maggior parte dei batteri tende a mantenere nel
citoplasma una concentrazione osmotica interna maggiore di quella
ambientale,in modo da mantenere la membrana citoplasmatica aderente
alla parete cellulare,tramite l'aumento dei SOLUTI COMPATIBILI(soluti
che se pur presenti nella cellula a concentrazioni elevate,non
interferiscono col metabolismo cellulare).La disponibilita' di acqua e'
fondamentale per la crescita dei microrganismi e puo' essere ridotta
da:
1).EFFETTO OSMOTICO:Interazione con molecole di soluto
2).EFFETTO MATRICE:Assorbimento di solidi sulla superficie,che
sequestra l'acqua e inibisce la crescita microbica
(ad esempio l'aumento della percentuale di Agar).
La disponibilita' di acqua e' misurata attraverso la variabile A.w.
l'attivita' dell'acqua di una soluzione e' il rapporto tra:
PRESSIONE DI VAPORE DELLA SOLUZIONE
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------PRESSIONE DI VAPORE DELL'ACQUA PURA
i valori di A.w sono compresi tra 0 e 1
26
LA PRESSIONE DI VAPORE DELLA SOLUZIONE E' INVERSAMENTE
PROPORZIONALE ALLA CONCENTRAZIONE DI SOLUTI:aumentando la
concentrazione di soluti la
pressione della soluzione e' minore della pressione dell'acqua e quindi
A.w<1.
ACQUA DISTILLATA (assenza totale di soluti) A.w=1
TOTALE ASSENZA DI ACQUA ------------------- A.w=0
(un alimento con A.w=0 e' l'olio)
L'attivita' dell'acqua dipende dal numero di molecole presenti in un
volume di soluzione.Per questo motivo a parita' di massa e in uno
stesso volume di solvente,il sale e'molto piu' efficace dello zucchero
nella riduzione dell'A.w poiche' ha peso molecolare piu' basso.Si puo'
affermare che essendo:
A.w= n acqua/(n acqua+n soluto) e sapendo che n=grammi/peso
molecolare
per una stessa quantita' in grammi e in uno stesso volume di solvente
vi sono piu' moli di sale che di zucchero in quanto il sale ha peso
molecolare piu' basso e quindi risulta molto piu' efficace nella
riduzione dell'A.w di quanto non lo sia lo zucchero.
Se consideriamo ad esempio due bicchieri contenenti ciascuno 100ml di
solvente e se in uno mettiamo 5 grammi di sale e nell'altro 5 grammi di
zucchero,osserviamo che all'interno dei due bicchieri l'A.w e'
diversa,poiche' diverso e' il peso molecolare dei due soluti e diverse
sono le moli nella stessa quantita' espressa in grammi.
L'ATTIVITA' DELL'ACQUA E' INFERIORE NEL CONTENITORE COL SALE
La maggior parte dei batteri di interesse alimentare cresce bene a
valori di attivita' dell'acqua uguali o inferiori a 0,98. Per questo la
disidratazione e l'aggiunta di elevate quantita' di zucchero e sale
sono efficaci metodi di conservazione dei prodotti alimentari.
ELEVATA A.w:>0,97
alimenti deperibili a temperatura ambiente
INTERMEDIA A.w:TRA 0,85 e 0,60
alimenti stabili a temperatura
ambiente per poco tempo
BASSA A.w:<0,60
alimenti stabili a temperatura
ambiente per lunghi periodi
pH:Logaritmo negativo della concentrazione di ioni idrogeno.
pH= -Log[H+] o anche Log 1/[H+]
La scala del pH varia da 0 a 14:ad ogni unita' di pH corrisponde una
variazione di 10 volte della concentrazione idrogenionica.
Ogni specie microbica ha un pH ottimale e un intervallo di pH per la
crescita.In base al pH i microrganismi si dividono in:
27
1).ACIDOFILI:optimum tra 0 e 5,5
2).NEUTROFILI:optimum tra 5,5 e 8.0 (neutralita' a pH 7)
3).ALCALOFILI:optimum tra 8,5 e 11,5 (alcalofili estremi vivono
a pH>10).
N.B.
Variazioni di pH possono danneggiare la membrana e inibire enzimi e
proteine di trasporto.Molti batteri muoiono sotto pH 5.
Il pH nel citoplasma e'prossimo alla neutralita'.I meccanismi di
mantenimento dell'omeostasi del pH sono:
1).Per PICCOLE MODIFICAZIONI DI pH:Sistemi di trasporto antiporto
potassio protoni (nei neutrofili).
Sistemi di trasporto antiporto sodio
protoni.Sistemi tampone interni
(quando diminuisce il pH il
microrganismo scambia protoni
esterni con ioni K+ e Na+ interni).
2).SHOCK ACIDO:Salmonella ed E.coli sintetizzano ATP-sinteasi tramite
cui si ha aumento di ATP o maggire espulsione di
protoni.
Sintesi di ASP (proteine da shock acido) e HSP (proteine da shock
termico).Esse impediscono la denaturazione delle proteine e riassemblano
quelle denaturate.
28
Scala del ph di alcune sostanze
pH
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
ESEMPI
Acido nitrico concentrato
Succo gastrico
Succo di limone
Aceto / Ananas/Mela
Pomodoro
Succo d'arancia/Maionese
Formaggio/Cavolo/Pane
Carne/Pesce/Latte
Acqua distillata/Sangue
Acqua marina
Albume (8/9)
Sapone
Ammoniaca domestica
Soluzione satura di idrato
di calcio
Varechina
Acqua di calce
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FATTORI NUTRITIZI
A seconda dei composti dai quali traggono fonte di Carbonio ed energia
i microrganismi possono essere classificati in:
1).FOTOAUTOTROFI:Traggono energia dalla luce e sintetizzano il carbonio
dalla CO2 (forma inorganica):batteri
fotosintetici,alghe blu e verdi.
2).FOTOETEROTROFI:Traggono energia dalla luce e sintetizzano il
carbonio da composti organici:batteri rossi non
sulfurei fotosintetici.
3).CHEMIOAUTOTROFI:Traggono energia da composti inorganici e
sintetizzano il carbonio da CO2:
solfo-ferro-ammoniobatteri e numerosi tipi di batteri
metanogeni.
4).CHEMIOETEROTROFI:Usano di solito gli stessi composti per ottenere
sia carbonio sia energia entrambe ottenute da
composti organici.
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------LA CURVA DI CRESCITA (Valida solo per microrganismi che si riproducono
per scissione binaria)
La curva di crescita descrive l'andamento della crecita di una
popolazione batterica.L'aumento e la diminuzione delle cellule vitali
30
in funzione del tempo sono espressi su scala logaritmica e non
aritmetica.Ci si riferisce a una coltura in bach (chiusa).La curva e'
riportata su un piano cartesiano,orientato secondo gli assi X e Y.Si
pone sull'asse delle ascisse X il tempo e su quello delle ordinate Y il
logaritmo del numero di cellule
.LA SCALA LOCARITMICA A DIFFERENZA DI QUELLA ARITMETICA METTE IN
EVIDENZA I PUNTI IN CUI FLETTE LA CURVA,CHE CORRISPONDONO AL
MOMENTO IN CUI SI PASSA DA UNA FASE ALL'ALTRA DELLA CURVA DI
CRESCITA.
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------TEMPO DI GENERAZIONE:Tempo che impiega una popolazione batterica in
fase esponenziale a raddoppiare di numero:
G=Tempo Di Generazione (h/generazione)
K=Numero Di Generazioni al tempo t (K=n/t) o (K=1/G)
K al tempo t=(logNt-logNi)/log2*t (moltilpicando per il tempo si
ottiene G)
t=1/K
FASI DELLA CURVA DI CRESCITA
1).FASE lag o FASE DI LATENZA:Il germe organizza la sintesi di enzimi
di induzione(non vi e' ancora crescita).
La durata dipede da:Tempo di generazione del microrganismo
Rapporto volume terreno volume inoculum
Eta'della coltura da cui proviene l'inoculo
Cambio di terreno o crescita Diauxica
2).FASE log o FASE LOGARITMICA:La moltiplicazione avviene con
progressione geometrica e il tempo di
generazione e' minimo.
La durata dipende da:Tempo di generazione del microrganismo
Rapporto volume terreno volume inoculum
Temperatura
Caratteristiche del terreno
3).FASE STAZIONARIA:Equilibrio tra numero di cellule che muoiono e
numero di cellule che si moltiplicano.(vi e' un
rallentamento della crescita microbica)che dipende
da:Esaurimento di nutrienti
Accumulo di metaboliti tossici
Riduzione dello spazio minimo vitale
Modificazioni delle caratteristiche fisiche del
terreno.
IN UNA COLTURA IN BACH NON SI PUO'
INTERVENIRE IN ALCUN MODO A DIFFERENZA DI CIO' CHE AVVIENE IN
COLTURA CONTINUA.
4).FASE DI MORTE:Se il batterio non puo' trasformarsi in spora
31
UNA
muore.Come la crescita avviene con progressione
logaritmica.In alcuni batteri e' dovuta all'azione di
enzimi autolitici.
La MORTE e' l'incapacita' di riprodursi quando il batterio
e'trasferito in un ambiente permissivo.
CHEMOSTATO:Macchina che consente di monitorare la velocita' di crescita
e la densita' microbica di una popolazione batterica in una coltura
continua,dove si puo' intervenire immettendo nutrienti e rimuovendo i
metaboliti tossici accumulati sul fondo.
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------RIPRODUZIONE DEI BATTERI
Generalmente asessule per SCISSIONE BINARIA:
1).Raddoppiamento delle dimensioni della cellula
2).Formazione del setto trasverso a meta'e duplicazione del cromosoma
3).Completamento del setto e formazione della parete trasversa
4).Separazione delle due cellule figlie
Alcuni batteri si riproducono come i lieviti per GEMMAZIONE:
1).Protuberanza in superficie della cellula madre
2).Aumento di volume
3).Distacco
(si forma una cellula piu'piccola che poi si accresce e si stacca dalla
cellula madre)
Altri si riproducono per SEGMENTAZIONE:
Formazione di lunghi filamenti e settaggio dei filamenti in diverse
parti.
32
TERRENI COLTURALI
Insieme di sostanze nutritive che favoriscono la crescita in vitro di
una o piu'specie microbiche.
Gli organismi che crescono sulla superficie o all'interno dei terreni
colturali sono denominati COLTURE.
INGREDIENTI DEI TERRENI COLTURALI:
CARBONIO (glucidi)
AZOTO (proteine-peptidi-aminoacidi)
METALLI E MINERALI ESSENZIALI (Ca,Mg,Fe,P)
TAMPONI (fosfati e acetati)
INDICATORI (rosso fenolo,porpora di bromocresolo)
AGENTI SELETTIVI (agenti antimicrobici e antibiotici specifici)
GELIDIFICANTI (agar o silicati)
33
PREPARAZIONE DEI TERRENI
COLTURALI
1).PREPARAZIONE DELLA
MISCELA
2).AGGIUSTAMENTO DEL pH
3).STERILIZZAZIONE IN
AUTOCLAVE (121øC a 1atm per
15-30 min)
4).EVENTUALE AGGIUNTA DI
INGREDIENTI TERMOLABILI
34
CLASSIFICAZIONE DEI TERRENI COLTURALI:Puo' essere effettuata in base a
tre punti di vista:
1).PUNTO DI VISTA FISICO:Si distinguono in terreni:
SOLIDI (agar 1-2%)
SEMISOLIDI (agar 0,3-0,5%)
LIQUIDI:brodocolture
(assenza di agar)
2).PUNTO DI VISTA DELLA
COMPOSIZIONE CHIMICA:Si distinguono in terreni:
EMPIRICI:non hanno
composizione chimica
definita e condizioni
riproducibili,
composti da miscele
naturali,consentono la
crescita di molti
microrganismi.Contengono
estratti di carne e
lievito (sono stati i
primi terreni
utilizzati in
batteriologia).
SINTETICI:Hanno composizione
definita,costante e riproducibile.
Possono essere semplici o
arricchiti,usati per microrganismi
AUTOTROFI e nella ricerca dove si
necessita di condizioni costanti,
definite e riproducibili.
SEMISINTETICI O COMPLESSI:
Possono essere liquidi o solidi,
sono terreni sintetici addizionati
con ingredienti che non hanno
composizione definita e costante.
Usati per microrganismi di cui non
si conoscono i fabbisogni,per gli
ETEROTROFI;che non sono caoaci di
sintetizzare la maggior parte delle
sostanze e per batteri esigenti dal
punto di vista nutrizionale.
(usati anche nella semina dei
miceti)
35
3).PUNTO DI VISTA DELLA FUNZIONE:
a).ISOLAMENTO:per isolare i microrganismi da alimenti,superici e altro
materiale.
b).MANTENIMENTO:per conservare in laboratorio le colture pure.
c).ARRICCHIMENTO:favoriscono la crescita di alcuni microrganismi
aumentando di numero una coltura a bassa carica
microbica (con pochi microrganismi) e ne inibiscono
altri.(sono in genere terreni liquidi)
d).SELETTIVI:favoriscono la crescita di alcuni microrganismi piuttosto
che altri tramite agenti antimicrobici.(sono in genere
terreni solidi)
e).DIFFERENZIALI:Distinguono le diverse specie capaci di crescere su
questi terreni tramite indicatori colorati presenti
nella composizione.
N.B
Se si deve effettuare un isolamento o ricercare una specie microbica
presente in quantita' esigue,puo' essere necessario l'impiego di piu'
terreni consecutivamente,ogniuno dei quali atto a una particolare
funzione utile per raggiungere l'obiettivo finale.
Gli ingredienti che distinguono un terreno sintetico da uno
complesso sono:
1).PEPTONE:idrolizzato di proteine ottenuto da digestione
proteolitica parziale da carne
2).ESTRATTO DI CARNE:ricco di aminoacidi,nucleotidi,peptidi,vitamine
e minerali
3).ESTRATTO DI LIEVITO:fonte di carbonio,azoto e ricco di vitamine B
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
36
TIPI DI TERRENI E LORO UTILIZZO
BG11 sintetico per Cianobatteri
BRODO SELENITE: di arricchimento(per isolare Salmonella e Shighella da
feci)
CARY BLAIR MEDIUM:sintetico (per trasporto di anaerobi e gram-)
BRODO TRIPTONE SOIA(TSB):complesso di mantenimento
AGAR TRIPTONE SOIA (TSA):complesso di mantenimento
AGAR MC CONKAY:complesso,selettivo per E.coli e differenziale per i
V.R.B.A
coliformi lattosio fermentanti(colorati di rosso
dall'idicatore rosso neutro)
AGAR SANGUE (BAP):TSA+5%di sangue bovino,ovino o umano.Distingue le
colonie emolitiche da quelle non emolitiche
AGAR CIOCCOLATO:BAP modificato per riscaldamento dei globuli rossi
(agar choc) che libera nutrienti.(per Neisseria Gonorreae) e anche
per streptococchi.
AGAR CHOC E AGAR SANGUE NON SONO SELETTIVI,CONSENTONO LA
CRESCITA A MOLTI MICRORGANISMI,SONO PRIVI DI AGENTI ANTIMICROBICI E
SI UTILIZZANO PER BATTERI MOLTO ESIGENTI.
AGAR VERDE BRILLANTE (BGA):per isolare Salmonella da campioni
alimentari
AGAR CRISTALVIOLETTO:selettivo per gramMANNITOL SALT AGAR (MSA):selettivo per staphylococchi
BAIRD PARCKER
:differenziale per Staphylococcus aureus.Contiene
tellurito di potassio e tuorlo d'uovo.
S.aureus produce l'enzima LECITINASI che chiarifica il
tuorlo d'uovo e rende la colonia nerastra.Il contrasto
tra il colore arancione del tuorlo e il nero della colonia
fa apparire al microscopio il batterio con un colore
dall'arancione scuro all'oro;da cui il nome
della specie (S.aureus).Tale specie si distingue dagli
altri staphilococchi per la presenza di due particolari
enzimi:COAGULASI+ e TERMONUCLEASI+
TERRENO DI SABOURAND:(Ph 5,6 alta percentuale di zuccheri)selettivo per
lieviti e muffe.
AGAR PPLO:selettivo per micoplasmi,contiene pennicilina.
MRS:selettivo per batteri lattici
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
37
terreni e METODI PER L'ANAEROBIOSI
La coltivazione di anaerobi pone particolari problemi a causa del fatto
che l'ossigeno per loro e' tossico.Per coltivare in anaerobiosi vi sono
varie soluzioni:
1).TERRENI RIDUCENTI: contengono ingredienti che sequestrano
l'ossigeno.(si usano provette con tappo a tenuta)
1).GIARA DA ANAEROBIOSI:Per le piastre petri.Contiene una miscela di
bicarbonato di sodio e boruro di sodio,un
indicatore blu di metilene e pochi ml di
acqua,E' sigillata ermeticamente e ha sotto il
coperchio un catalizzatore al palladio.
Bicarbonato di sodio e boruro di sodio
reagiscono formando CO2 e H2.
l'idrogeno reagisce con l'ossigeno grazie al
catalizzatore al Palladio
producendo acqua.L'ossigeno scompare e si
accumula anidride carbonica e l'indicatore blu
di metilene diventa incolore.
2).CAMERA DA ANAEROBIOSI:E' una camera trasparente riempita di gas
inerte e dotata di filtro.Le operazioni
manuali sono eseguite tramite guanti inseriti
nella parete della camera.
3).INCUBATORI A CO2:Attraverso una regolazione elettronica
dell'atmosfera e' possibile far crescere organismi
a concentrazioni di CO2 maggiori o minori di quella
atmosferica.Usati per i batteri CAPNOFILI che
vivono a concentrazioni elevate di CO2 (2-10%).
: METODI PER LA COLTIVAZIONE DI MICROAEROFILI (vivono a livelli ridotti di
ossigeno)[Campylobacter]
1).GIARA CON CANDELA:la candela si spegne quando si e' ridotto il
livello di ossigeno
2).KIT CON GENERATORI DI GAS:contengono una confezione di generatore
di gas da rompere o inumidire
MICRORGANISMI CHE NON CRESCONO SU TERRENI COLTURALI:
RIKETSIAE,CLAMIDIAE,MYCOBACTERIUM LEPRAE:sono coltivati su
armadilli,che hanno temperatura corporea inferiore rispetto ai
mammiferi domestici.
38
METODI PER LA COLTIVAZIONE IN ATMOSFERA RICCA DI OSSIGENO:
per aumentare la disponibilita' di ossigeno occorre aumentare
l'areazione durante l'incubazione tramite recipenti che incrementano la
superficie di terreno esposta:
1).FIASCA DI FERNBACH
2).FIASCA DI KOLLE
3).BOTTIGLIA DI ROUX
4).AGITATORE APIANO OSCILLANTE
METODI PER LA CONSERVAZIONE DELLE COLTURE BATTERICHE
1).CONSERVAZIONE REFRIGERATA IN BECCO DI CLARINO:Trapianto su
terreno solido di mantenimento usando provette con agar inclinato per
avere a disposizione una maggiore superficie).Il terreno e' conservato in
frigorifero e trapiantato in un nuovo terreno ogni 2-4 mesi.Puo'
causare la perdita di alcune caratteristiche come la capacita' di
produrre un enzima.
2).CONGELAMENTO RAPIDO:previa sospensione in apposito diluente a una
temperatura tra i -50øC e i -95øC
3).LIOFILIZZAZIONE:Sospensione posta in mestruo adeguato,congelamento
rapido da -54øC a -72øC e successiva applicazione del
vuoto tramite sublimazione dell'acqua,a cui fa
seguito la termosaldatura del contenitore.
MESTRUI PER LA LIOFILIZZAZIONE devono contenere:
1).SUPPORTO COLLOIDALE:siero o albumine
2).SOSTANZA CAPACE DI NEUTRALIZZARE:glutammato monosodico (1% in
I GRUPPI CARBOSSILICI(COOH)
presenza di saccarosio,5% in sua
assenza.Tampona anche l'umidita'
residua)
3).SOSTANZA CHE RIDUCA L'UMIDITA':saccarosio al 10% (in totale
RESIDUA ALL'1%
assenza di umidita' i batteri muoiono).
N.B
Il latte magro puo' essere considerato un mestruo completo.
39
LE COLONIE BATTERICHE
Ammassi rotondeggianti eventualmente pigmentati,diventano visibili con
una carica di 10^6 cellule /ml,dopo 18 ore di incubazione.Ogni
batterio genera una sola colonia.
CARATTERISTICHE DELLE COLONIE BATTERICHE:
1).DIMENSIONE
2).COLORE
3).FORMA
4).CONSISTENZA
5).ODORE
[ Sono un parametro fondamentale
[ per l'identificazione e la
[ classificazione dei batteri
[
[
Le colonie si originano da batteri seminati su terreno agarizzato
solido.Ingrediente fondamentale per queste colture e' l'AGAR:
1).E' un agente solidificante (in una percentuale tra 1-2% rende la
superficie sufficientemente umida da consentire la crescita dei batteri
e abbastanza asciutta da mantenere le colonie separate ed evitare la
formazione di aggregati cellulari).
2).Inerte e atossico per i batteri
3).Solidifica a temperatura ambiente (38øC)
4).Fonde a 84øC
5).Ha una struttura a gel che ostacola il movimento dei batteri ma
consente la diffusione delle sostanze nutritive.
MORFOLOGIA DELLE COLONIE BATTERICHE.
Le colonie possono essere di vario tipo:
1).TIPO H:Presentano una pellicola periferica frastagliata,dotati di
flagelli,possiedono l'antigene somatico O
e quello flagellare H.
2).TIPO O:NON presentano una pellicola periferica frastagliata,sono
privi di flagelli e possiedono solo l'antigene somatico O.
3).TIPO S:Presentano una superficie liscia,sono dotati di capsula e
presentano sia l'antigene somatico O sia quello capsulare K.
4).TIPO R:Presentano superficie rugosa,sono privi di capsula e in essi
l'antigene somatico O diventa OMEGA.
40
CONTA MICROBICA
Puo' essere effettata in base alla:
:trmite:a)Misurazione del
1).DETERMINAZIONE DELLA MASSA TOTALE
DELLA POPOLAZIONE MICROBICA
(muffe e lieviti)
a)determinazione del peso secco microbico
b)Determinazione di un
costituente cellulare
(clorofilla)
c)Misurazione della
Densita' ottica tramite
spettrofotometro a una
lunghezza d'onda di 490
nm (la D.O e'
direttamente proporzionale
alla densita' batterica
tra 0,01 e 0,5 mg/ml:in un
intervallo tra 10^7 e 10^9
cellule/ml).
2DETERMINAZIONE DEL NUMERO:tramite: a) FILTRAZIONE(carica
DI CELLULE
microbica bassa)
b) CONTA MICROSCOPICA DIRETTA:
1).Conta di breed (batteri
del latte)
2).Counter-Counter
3).Contacellule di
Petroff-hausser
(si effettua una conta
totale non si
distinguono le cellule
vive da quelle morte)
c)CARICA MICROBICA SU PIASTRA
(CONTA INDIRETTA)
(conta vitale,occorrono 18-24h
per poter contare le colonie)
d)MPN:Most Probable Number
(conta vitale)
41
MISURAZIONE DELLA DENSITA' OTTICA
Innanzi alla provetta,contenente i microrganismi,viene posta una fonte
di luce polarizzata che,attraverso un prisma,fa arrivare i raggi
luminosi trasversalmente alla provetta.Il rapporto tra i raggi che
passano e quelli rifratti dai microrganismi esprime la D.O.I raggi
luminosi che passano vanno a uno spettrofotometro che ne esprime la
quantita' in unita' colorimetriche (se si usa al posto dello
spettrofotometro un colorimetro) o di densita' ottica.La TURBIDOMETRIA
e' il fondamento su cui si basa questo metodo,che tuttavia puo'
generare errori di conteggio,in quanto,un microrganismo puo' riflettere
per la seconda volta una raggio luminoso,che in tal modo,risulta
trapassare la provetta come se in quel preciso punto non ci fosse alcuni
microrganismo.Cio' porterebbe a una sottostima della carica microbica del
campione.Per evitare cio' bisogna quindi effettuare un riscontro visivo e
confrontare i risultati ottenuti dalla lettura dello
spettrofotometro.Cio' e' possibile grazie alla SCALA DI MC-FARLAND.
Essa consiste in una serie di inoculi batterici con carica
predeterminata,con una serie di diluizioni seriali che fanno variare la
torbidita'.La torbidita' diminuisce progressivamente in modo graduale
all'aumentare del fattore di diluizione.Si prende la diluizione che
piu' si avvicina alla torbidita' dell'inoculo originale e si effettua
un confronto visivo.
PERCAUZIONI PER UN CONTEGGIO VEROSIMILE:
1).Sospensione madre deve essere omogenea
2).Lettura sia visiva sia spettrofotometrica
3).Porre attenzione alle colonie pigmentate
DETERMINAZIONE DEL NUMERO DI CELLULE:FILTRAZIONE
Si utilizza per la conta di microrganismi a carica microbica bassa.Si
isola il microrganismo da coltura liquida che viene successivamente
filtrata tramite una retina che isola i microrganismi dal liquido
bloccandoli in superficie e facendo passare il liquido che,attraveso un
imbuto, viene fatto scorrere all'interno di una beuta.Dopo la
filtrazione i microrganismi intrappolati sulla superficie della retina
vengono posti su un terreno agarizato solido.La piastra viene incubata
e dopo 24h si puo' procedere alla conta dei microrganismi.
42
CONTA MICROSCOPICA DIRETTA:CONTACELLULE DI PETROFF-HAUSSER
Si tratta di una struttura che consente di effettuare una conta diretta
al microscopio prendendo in esame un campione sospeso liquido.La camera
di Petroff-Husser non e' necessaria ne' utilizzabile per terreni
solidi.
La camera e' dotata di un vetrino di superficie,inciso con un reticolo
quadrettato di cui e' nota l'area di ogni riquadro.Lo spazio tra
reticolo e vetrino coprioggetto e' noto e si puo' risalire al volume
totale semplicemente moltiplicando tale spazio per il numero di
quadratini in cui ogni riquadro e' suddiviso.Si contano le cellule per
ogni riquadro,si fa la media dei valori ottenuti e la si moltiplica per
il numero di riquadri (quadrati grandi).infine si divide il valore
ottenuto per il volume totale della camera.Per esprimere il risultato
in CFU/ml si moltiplica o si divide per il fattore di conversione
relativo al volume della camera,riportando il valore ottenuto alle
unita' di misura di nostro interesse.
Per la conta dei lieviti si usa la camera di THOMA
che ha dimensioni maggiori
CARICA MICROBICA SU PIASTRA
E' una conta vitale:misura il numero di cellule vitali.Si contano le
colonie da 30 a 300 o da 25 a 250.La determinazione della carica
microbica su piastra si fonda sui seguenti principi:
1).Ogni batterio crescendo si divide e da origine a una sola colonia
2).L'inoculo originale e'omogeneo
3).Non sono seminati aggregati cellulari
LIMITI DELLA CARICA MICROBICA SU PIASTRA (CONTA INDIRETTA)
1).Non tutte le colonie seminate crescono alla stessa velocita' quindi
colonie di piccola dimensione possono sfuggire al conteggio
2).Cellule vicine possono dare vita a una singola colonia
3).E'difficile stimare il fattore di diluizione necessario poiche' e'
difficile prevedere il numero delle cellule vitali
4).Si possono verificare errori della tecnica di analisi:
a)Campionamento
b)Pipettatura
c)Semina
d)Conteggio
e)Insufficiente omogenizzazione
g)Errori di lettura
43
MPN (Most Probable Number)
Si usa in presenza di batteri chemioautotrofi nitrificanti:
1).Per identificazione su terreno differenziale liquido
(il microrganismo non cresce bene su terreno solido)
2).Per patogeni a bassa carica microbica
(non si puo' omettere di dichiarare la patogenicita' di un alimento)
3).Per campioni la cui carica microbica e' talmente bassa da rischiare
la rarefazione dei microrganismi se si usa la filtrazione
Il metodo afferma che esiste il 95% di possibilita' che la carica
microbica rientri nell'intervallo corrispondente (e' il numero piu'
probabile).
Il metodo MPN si fonda sul principio che realizzando diluizioni
successive esistera' almeno una diluizione in cui solo alcune
provette,contenenti diluizioni seriali,daranno luogo a crescita
microbica. Mediante questo metodo,basato su considerazioni
statistiche,si puo’ ricavare il numero piu'probabile di microrganismi
per ml o per grammo.
Generalmente le diluizioni seriali sono effettuate a gruppi di tre
provette contenenti ciascuno la stessa diluizione.Dopo l'incubazione si
controlla dove si e'verificata crescita microbica.Si prendono in
considerazione i tre gruppi contenenti le tre diluizioni a partire da quella
limite (se esiste) cioe'l'ultima diluizione in cui tutte e tre le
provette sono positive(inclusa),si legge sulla tabella il
valore corrispondente e lo si moltiplica per l'inverso della diluizione
piu' bassa.In assenza di limite si considerano le diluizioni
piu'basse poiche'sono piu'significative.
(NEL CASO DEGLI ENTEROBATTERI CHE PRODUCONO GAS la campanella di
Duram si solleva all'interno della provetta).
VANTAGGI E SVANTAGGI DEL METODO MPN
VANTAGGI:
1).Facile da usare su substrati selettivi
2).E' possibile ottenere risultati anche in 4 ore con
l'aggiunta di substrati particolari
3).E' molto sensibile:si possono utilizzare anche 50ml di inoculo
SVANTAGGI:
1).e' molto meno preciso delle conte in piastra
2).E' laborioso e puo' essere molto costoso
(si usa solo quando strettamente necessario)
44
ESAME BATTERIOLOGICO
Insieme di procedure che servono per effettuare la conta di un
microrganismo,nonche' per la classificazione e l'identificazione del
microrganismo stesso.
E' opportuno ricordare che per effettuare la coltivazione e la
successiva conta di un microrganismo non si usa MAI acqua distillata ma
una SOLUZIONE FISIOLOGICA ISOTONICA con la cellula in modo da evitare
la lisi.
FASI DELL'ESAME BATTERIOLOGICO:
1).CAMPIONAMENTO:si preleva il campione da analizzare
2).PREPARAZIONE DELL'INOCULO
3)SEMINA
4)INCUBAZIONE:a temperatura ottimale di crescita E SUCCESSIVO
CONTEGGIO
5)ISOLAMENTO E IDENTIFICAZIONE
SEMINA PER INCORPORAMENTO O INCLUSIONE
Si preleva 1 ml di campione che viene depositato su una piastra
sterile,viene aggiunto del terreno sterile contenente agar fuso a
temperatura superiore ai 45øC,viene poi mescolato con l'inoculo.Si
mette ad incubare per 18-24h la piastra col coperchio rovesciato,per
evitare il ricondenzarsi di acqua;che non consente di tenere ferme le
colonie e impedisce il successivo conteggio.Si contano infine le
colonie che appaiono sia in superficie sia all'interno del terreno di
coltura solidificato.(si incubano due piastre per ogni diluizione).
SEMINA PER SPATOLAMENTO O SUPERFICIALE (STRISCIO)
Si prelevano 0,1 ml di campione che viene depositato su una piastra
petri contenente terreno agarizzato solido.Successivamente il campione
viene distribuito uniformemente sulla superficie della piastra con un'ansa
sterile.Si pone la piastra ad incubare per 18-24h col coperchio capovolto
per impedire che la condensa di acqua ricada sul terreno deformando le
colonie e consentendo loro il movimento,impedendo il successivo conteggio.
Dopo l'incubazione le colonie sono localizzate esclusivamente sulla
superficie della piastra e non all'interno,come invece accade nella semina
per incorporamento.
45
DILUIZIONE DI UN CAMPIONE LIQUIDO
In entrambi i casi il campione deve essere diluito prima del
piastramento in modo da ottenere un numero compreso tra le 25-250 o le
30-300 colonie che consenta il conteggio.Essendo molto difficile
prevedere il numero di cellule vitali si effettua piu' di una
diluizione seriale (1/10).Per ogni ml di campione si pongono 9 ml di
diluente.Per ottenere una stima piu' precisa si seminano DUE PIASTRE
PER OGNI PROVETTA CONTENENTE UNA DILUIZIONE,facendo la media
aritmetica. Il risultato va poi moltiplicato per l'inverso del fattore
di diluizione e il tutto va diviso per il volume .In tal modo si
ottengono le CFU/ml
ES:(20+40)/2=30*10^3
(30*10^3/0,1)=3*10^5
Il risultato va espresso con un numero da 1 a 9 che moltiplica una
potenza del dieci:
ottenendo 300000 CFU/ml SI hanno 3*10^5 CFU/ml
DILUIZIONE DI UN CAMPIONE SOLIDO PRIMA DEL PIASTRAMENTO
Se si esamina un campione solido bisogna eseguire una diluizione
iniziale 1/10.Si prende un grammo di campione e lo si mescola con 9 ml
di diluente,tramite una apparecchiatura specifica (STOMACHER),che ha la
funzione di omogenizzare la soluzione,la quale subisce un cambiamento di
stato da solida a liquida.Successivamente si procede con le normali
procedure di diluizione seriale (come nel caso di un campione liquido).
ES:Per 250g di formaggio si hanno 25g di formaggio e 225ml di
diluente (soluzione fisiologica isotonica).
CONTA DI MICRORGANISMI SU SUPERFICI
Per la conta di microrganismi su un'area conosciuta e delimitata si
procede passando una spugna o altro materiale campionando la superficie
da analizzare.Si usa lo stomacher e si procede con le diluizioni seriali.Si fa
la media aritmetica delle colonie contate nella prima e nella seconda
piastra dell'ultima diluizione e si moltiplica per
l'inverso del fattore di diluizione.Il valore ottenuto viene poi
moltiplicato per il rapporto tra volume iniziale della sospensione e
area campionata.Infine si divide per il volume di sospensione per
riportare il valore ottenuto in proporzione al millilitro.
ES:
Per una superficie di 5 centimetri quadrati e una sospensione di 10 ml
e con una media di 54,5 CFU si ha:
54,5*(10ml/5cm2)/0,1ml=1,1*10^5 CFU/cm2
IL RISULTATO VIENE ESPRESSO IN CFU/cm2.
46
ESAME BATTERIOLOGICO:ISOLAMENTO E IDENTIFICAZIONE DEI
MICRORGANISMI
FASI:
1).Isolamento in coltura pura
2).Identificazione fentipica (visiva e olfattiva)
3).Identificazione con prove biochimiche
4).Sierotipizzazione e reazioni anticorpo (se necessario)
5).Identificazione genotipica (biologia molecolare)
N.B
Se non si conosce il microrganismo isolato per identificarlo ed
eventualmente classificarlo,bisogna seguire tutte le fasi dell'esame
batteriologico.
Per verificare la presenza di una particolare specie basta affidarsi
all'analisi delle prove biochimiche e utilizzare l'analisi genotipica
per conferma.
TASSONOMIA MICROBICA
E' la scienza che studia la classificazione dei microrganismi.
La denominazione e' binomiale e in latino.Si divide in:
1).TASSONOMIA CLASSICA:Raggruppa i microrganismi in base a
caratteristiche fenotipiche
2).TASSONOMIA NUMERICA:Raggruppa i microrganismi in funzione delle
caratteristiche di tipo evolutivo.Vengono
calcolati i COEFFICIENTI DI SIMILARITA'
che consentono di raggruppare i microrganismi in
DENDROGRAMMI definiti come MATRICI DI
SIMILARITA'.
In microbiologia si prende come riferimento tassonomico il
Bergey's Manual
47
STERILIZZAZIONE:Processo che
tramite trattamento termico
garantisce l'uccisione di tutti i
microrganismi.
(121øC e 1atm per 15-30 min)
PASTORIZZAZIONE:Processo che
tramite trattamento termico
(60øC). garantisce l'uccisione dei
microrganismi patogeni.
TYNDALLIZZAZIONE:Processo di
riscaldamento discontinuo
utilizzato per l'eliminazione delle
spore.Tramite riscaldamento di1
min per 5 volte.Il trattamento
termico e' sufficiente a portare la
spora alla temperatura ottimale
per la germinazione .Una volta
passata allo stato vegetativo si
elimina il microrganismo
procedendo con la successiva
sterilizzazione.
48
MICOLOGIA:studio dei miceti.
EUMICETI:Organismi eucarioti privi di clorofilla,dotati di
caratteristiche peculiari.
I miceti si dividono in:
1).MICETI FIAMENTOSI (muffe):multicellulari aerobi
2).LIEVITI:colonie lisce unicellulari sferiche-ovoidali che hanno
piccoli filamenti.Sono anaerobi facoltativi.
I miceti possono essere:
1)MONOMORFI:crescono soltanto come muffe o come lieviti.
2)DIMORFI:possono crescere come lieviti e come muffe a seconda della
temperatura.I patogeni per i vegetali vivono come lieviti
nell'ambiente e come muffe sui vegetali.I patogeni per l'uomo
e gli animali vivono come muffe a temperatura ambiente e a
37-40øC si trasformano in lieviti.
I dimorfi sono caratterizzati da Y-M-Shift
(cambiamento lievito-muffa).
I miceti sono acidofili,crescono bene a Ph 5 e tollerano pressioni
osmotiche (sono osmotolleranti).Metabolizzano la LIGNINA (glucide
complesso),richiedono meno azoto rispetto ai batteri e prediligono
substrati a bassa umidita'.
MORFOLOGIA DEI MICETI
Miceti filamentosi (muffe) costituite da: 1).TALLO:corpo centrale
2).IFE:elementi cilindrici
filamentosi:Formano
una massa ramificata
detta MICELIO.
Il micelio delle muffe puo' essere:
1).VEGETATIVO:Aderisce al substrato da cui assorbe il nutrimento
2).AEREO O RIPRODUTTIVO:Si eleva al di sopra del substrato e da origine
alle spore.
LIEVITI:singole cellule sferiche-ovali,si dividono in due cellule
identiche per scissione binaria (Saccaromyces),gli altri si
riproducono per gemmazione mediante BLASTOSPORE*(a separazione
avvenuta ricostituiscono lo strato unicellulare).
Alcuni lieviti producono PSEUDOIFE:gemmazioni che non si separano ma
rimangono contigue,con parete cellulare contigua (Candida spp).
49
RIPRODUZIONE ASESSUATA mediante:
TALLOSPORE:Formate direttamente dal tallo
CLAMIDIOSPORE:Formate per trasformazione del tallo o ifa per
ispessimento di un segmento del tallo
ARTROSPORE:Formate per disarticolazione di un segmento ifale
BLASTOSPORE:*
ALEURIOSPORE:Detti anche Dermatofiti,formate per trasformazione della
cellula apicale in struttura espansa ed autonoma all'estremita' di un'ifa
settata.
CONIDI:Spore libere non contenute in alcun involucro,generate dal
CONIDIOFORO (IFA).Si appoggiano ad esso tramite lo Sterigma a
volte doppio (primario e secondario).
SPORANGIOSPORE:Contenute nello sporangio,generate dallo
SPORANGIOFORO
(IFA) e collegate ad esso tramite una cellula detta
columella
RIPRODUZIONE SESSUATA
Richiede la fusione di nuclei compatibili.
SPECIE OMOTALLICHE:producono gameti compatibili sullo stesso micelio.
SPECIE ETEROTALLICHE:scambio tra miceli diversi ma sessualmente
compatibili.
Le spore sessuate si riproducono mediante:
1).PLASMOGAMIA:Divisione del citoplasma
2).CARIOGAMIA:Divisione del nucleo
3).MEIOSI:Divisione dei cromosomi
Le spore sessuate sono:
ASCOSPORE:Caratteristiche degli Ascomiceti,sono formate nella
sporocisti e si liberano dopo la lisi dell'involucro(CISCO).
BASIDIOSPORE:Caratteristiche dei Basidiomiceti,generate dal BASIDIO
tramite fusione nucleare e sono rette da uno Sterigma.
(anche asessuate)
ZIGOSPORE:Caratteristiche degli Zigomiceti,sono originate da due ife
che fondono i nuclei dando vita a una spora rotondeggiante.
DEUTEROMICETI (funghi imperfetti):Si riproducono solo per via
asessuata.Sono miceti patogeni.
50
MICOTOSSINE:Tossine dei miceti:Sono composti a basso peso
molecolare prodotti dai miceti patogeni:
1)ASPERGILLUS
2)PENICILLIUM
3)FUSARIUM
DIFFERENZE TRA MICETI E BATTERI
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------MICETI
BATTERI
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Eucarioti
Procarioti
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Membrana
Membrana
contenente
non contiene
ergosterolo
steroli
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Parete contenente
Parete costituita
Chitina
da Peptidoglicano
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Eterotrofi
Eterotrofi
Non fotosintetici
fotoautotrofi
Ph acido
chemioautotrofi
neutrofili
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------LIEVITI:aerobi
aerobi,anaerobi
MUFFE:anaerobi facoltativi
anaerobi facoltativi
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Riproduzione mediante
Endospore non
spore
riproduttive
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Sensibili a polienici
Sensibili ad
antibiotici(Penicillina)
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
51
SCAMBIO DI MATERIALE GENETICO TRA BATTERI
TRASFORMAZIONE
Processo nel quale un frammento di DNA batterico,proveniente da una
cellula che ha subito lisi,viene trasferito all'interno di un'altra
cellula batterica ,tramite le nucleasi extracellullari che rompono i
legami a idrogeno tra le basi azotate del doppio filamento di dna
estraneo e trasportano un singolo filamento del dna stesso all'interno
del citoplasma,dove il dna estraneo viene protetto dall'attacco delle
nuceasi intracellulari:(enzimi di restrizione che regolano
l'espressione dei geni all'interno della
cellula).Successivamente,tramite delle proteine (FATTORI DI
COMPETENZA),il dna estraneo e' condotto vicino al cromosoma.Al momento
della replicazione del cromosoma le proteine REC-A provvedono
all'inglobamento del frammento di dna estraneo nella sequenza omologa
del cromosoma.Il dna estraneo,una volta inglobato,diviene parte
integrante del cromosoma e potra' replicarsi ed esprimere i suoi geni nella
succesiva replicazione del cromosoma.
N.B:Perche' vi sia trascrizione e' necessario che il DNA estraneo
provenga dalla stessa specie.
CONIUGAZIONE
Processo di scambio di materiale genetico che presuppone il contatto
cellulula-cellula.La cellula donatrice si stacca attraverso i pili
sessuali prodotti dal suo plasmide coniugativo,che funziona da vettore
di clonaggio.Il plasmide viene duplicato e trasferito alla cellula
ricevente,che procede a un eventuale inglobamento del plasmide stesso
all'interno del proprio cromosoma (in tal caso il plasmide e' definito
EPISOMA).Tramite tale inglobamento la cellula ricevente acquisisce
nuove proprieta' nella successiva generazione,in cui,durante la
replicazione del cromosoma,avviene anche quella del plasmide ricevuto
precedentemente dalla cellula donatrice,cio' comporta la
manifestazione delle caratteristiche codificate dai geni del plasmide
stesso (ad esempio antibiotico-resistenza).
N.B:Cellule con plasmide integrato nel cromosoma sono dette Hfr.
TRASDUZIONE
Processo di scambio del materiale genetico mediato dai virus.In tal
caso il virus viene trasferito alla cellula batterica.Piu' precisamente
il virus trasferisce il suo acido nucleico (DNA o RNA) all'interno del
batterio assieme a particolari enzimi specifici per la sua sintesi
proteica (non presenti nella cellula ospite).Una volta all'interno il
virus da vita al CICLO LISOGENO,in cui vive in simbiosi con la cellula
ospite utilizzando le strutture di quest'ultima per
replicarsi.Terminata la replicazione ha inizio il CICLO LITICO,nel
quale le particelle virali lisano la cellula ospite e si riversano
all'esterno,pronti per attaccare una nuova cellula che ,in caso di
52
attacco completato da parte del virus,acquisira' nuove proprieta'
derivanti dalla cellula precedentemente infettata dal virus
stesso.Nella maggior parte dei casi la cellula ospite riconosce il
virus come corpo estraneo e gli impedisce di terminare il ciclo
litico.Il virus,in tal caso,torna alla forma circolare iniziale e il
piu' delle volte non ha conseguenze dannose per la cellula ospite.Puo'
tuttavia accadere che circolarizzandosi si porti dietro una parte del
cromosoma.In caso di attacco a una nuova cellula il virus causa
ricombinazione genetica.
La trasduzione puo'essere:
GENERALIZZATA:qualunque frammento di dna dell'ospite puo' sostituire il
genoma del virus.(una cellula infettata da un Fago Lambda va in lisi
cellulare,si liberano i virioni maturi e particelle trasducenti o difettive
[particelle virali contenenti dna cellulare].Le particelle difettive che
infetteranno una nuova cellula provocheranno
RICOMBINAZIONE GENETICA).
SPECIALIZZATA:
si verifica in virus temperati e interessa il
trasferimento di una specifica regione del
cromosoma,vicina al sito di attacco del virus.(Una
cellula viene infettata da un Fago Lambda il cui dna viene
inglobato nel cromosoma [dna cellulare].L'induzione con
raggi ultravioletti provoca la separazione del dna virale
da quello cellulare.Durante la scissione,nel dna virale
possono essere inseriti alcuni geni batterici.In tal caso
i virioni prodotti conterranno anche i geni della
cellula.I fagi difettivi possono infettare altre cellule
e causare Ricombinazione Genetica
POTENZIALI DI RIDUZIONE
Il potenziale di riduzione e'la tendenza di una sostanza a ridursi.E'
misurato elettricamente in unita' di VOLT e in riferimento
all'idrogeno.Per convenzione i potenziali di riduzione sono espressi
come semireazioni di riduzione.Si riferiscono a PH 7 poiche' nella
maggior parte delle cellule il citoplasma e ' prossimo alla
neutralita'.
53
LA TORRE DEGLI ELETTRONI
Per rappresentare il trasferimento di elettroni nei sistemi biologici
si utilizza la torre degli elettroni.In essa le coppie redox sono
sistemate a partire dai riducenti piu' forti (potenziale redox
negativo),in alto,fino agli ossidanti piu' forti (potenziale redox
positivo),in basso.Piu'in basso cadono gli elettroni prima di essere
ctturati,piu' e' alta la differenza di potenziale tra DONATORE (in
alto) e ACCETTORE(in basso),e allo stesso tempo,maggiore e' la
quantita' di energia che viene rilasciata.
La sostanza ridotta nella coppia redox posta in cima alla torre ha la
massima tendenza a cedere elettroni (a ossidarsi) ed e' caratterizzata
dal massimo potere riducente.La sostanza ossidata della coppia redox
posta sul fondo della torre ha la massima tendenza ad acquistare
elettroni (a ridursi) ed e' caratterizzata dal massimo potere
ossidante.
CO2/glucosio (-0,43)24e- :il glucosio ha la massima tendenza a cedere
elettroni (max tendenza riducente)
1/2 O2/H2O (+0,82)2e- :l'ossigeno ha la massima tendenza ad
acquistare elettroni
(max tendenza ossidante)
Potenziale redox positivo=AEROBIOSI
Potenziale redox negativo=ANAEROBIOSI
RESPIRAZIONE AEROBICA
Processo che porta alla formazione di energia tramite la sintesi di
ATP,dovuta alla forza proton-motrice,generata durante tale processo in
seguito alla riduzione dell'ossigeno (usato come accettore terminale di
elettroni) in acqua.La glicolisi rappresenta la prima fase della respirazione
alla quale segue il ciclo di Krebs,che,partendo dai
prodotti della glicolisi,genera come prodotti di scarto anidride
carbonica e acqua.La respirazione infatti consiste nella completa
ossidazione del glucosio,che porta alla riduzione dell'ossigeno in H2O.
In questo processo si generano complessivamente 38 molecole di ATP per
ogni molecola di glucosio,tramite FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA:
[ Si formano 38 molecole
GLUCOSIO+OSSIGENO=ANIDRIDE CARBONICA+ACQUA[ di ATP:2 dalla
[ 36 dal ciclo di Krebs
[ (che si ripete 3 volte)
il Glucosio si ossida ad Anidride carbonica
l'Ossigeno si riduce in Acqua
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RESPIRAZIONE ANAEROBICA (parlarne è una forzatura dal punto di vista biochimico)
Tipo di respirazione in cui al posto dell'ossigeno si usano come
accettori terminali composti inorganici
(Nitrati,Nitriti,Carbonati,Solfati).Si produce una quantita' di energia
minore rispetto a quella prodotta nella via aerobica e diminuiscono
altresi'le molecole di ATP generate per ogni molecola di glucosio.
FERMENTAZIONE
Processo che porta alla formazione di ATP tramite FOSFORILAZIONE A
LIVELLO DEL SUBSTRATO,nella quale un gruppo fosfato ad alta energia
viene trasferito ad ADP,a partire da un composto organico fosforilato,per
produrre ATP.Tale processo avviene in assenza di accettori terminali di
elettroni (come l'ossigeno),cio' comporta che il GLUCOSIO(ad esempio),non
viene completamente ossidato,il che suggerisce una resa energetica di gran
lunga inferiore rispetto alla respirazione.
Nella fermentazione infatti,si producono solo due molecole di ATP per
ogni molecola di glucosio.
GLICOLISI COME ESEMPIO DI FERMENTAZIONE
La Glicolisi e' il processo mediante il quale una molecola di Glucosio
viene scissa in due molecole di Piruvato.Essa si compone di tre fasi:
1).FASE PREPARATORIA:In questa fase si preparano le reazioni di
ossidoriduzione.Il primo passaggio e'la fosforilazione del glucosio a
glucosio-6P,a cui segue la trasformazione del glucosio-6P nella sua
forma isomerica (fruttosio-6P)tramite l'enzima ISOMERASI.A tal punto
avviene una seconda fosforilazione che trasforma il fruttosio-6P in
fruttosio 1-6 difofato,che viene scisso dall'enzima ALDOLASI in
gliceraldeide3-fosfato e nella sua forma isomerica.Questa prima fase
non coinvolge reazioni redox (trasporto di elettroni) ma comporta un
dispendio iniziale di due molecole di ATP.
2):FASE DI OSSIDAZIONE:Nella fase ossidativa si ha la produzione di
Piruvato (2 molecole provenienti da ogniuna delle molecole di acido
1-3 fosfoglicerico).Si sintetizzano 4 molecole di ATP (due per ogni
molecola di piruvato).Si ha un guadagno netto di due molecole di ATP
dato che due sono state consumate nella fase preparatoria.
3).FASE DI RIDUZIONE E PRODUZIONE DEI PRODOTTI DI FERMENTAZIONE:
Durante la formazione delle due molecole di acido 1-3 fosfoglicerico
2NAD+ si riducono a NADH.Se non e'presente il NAD+ l'ossidazione del
glucosio si blocca,quindi il NADH deve essere continuamente riossidato
(accetta gli elettroni e li cede),per permettere di proseguire
l'ossidazione del glucosio.La riossidazione del NADH a NAD+ avviene
tramite la riduzione del piruvato nei prodotti di fermentazione:
a)LATTATO:nei batteri lattici
] Entrambi piu'
b)ETANOLO:(con produzione di CO2) nei lieviti] energetici del
] Piruvato
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REAZIONI DELLA GLICOLISI
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GENERAZIONE DELLA FORZA PROTON-MOTRICE
La forza proton-motrice,utilizzata per la produzione di ATP mediante
ATP-ASI,per il movimento flagellare e per alcuni processi di trasporto
attivo,si genera durante l'ultima fase della respirazione.Quando
l'ossigeno viene ridotto in acqua tramite la reazione di
riduzione,dovuta al trasferimento di elettroni.L'acqua,per completare
la reazione,requisisce ioni H+ dal citoplasma facendoli reagire con
l'ossigeno preso dall'esterno.Gli ioni H+ vengono portati all'esterno
tramite proteine integrali di membrana,ma l'acqua che si forma e' in
realta' l'insieme dei suoi due ioni costituenti (H+ e OH-).In
conseguenza della cattura di protoni dal citoplasma,all'esterno della
membrana si accumulano ioni H+ che rendono l'ambiente esterno acido e
carico positivamente.Si contrappone un accumulo di ioni OH- all'interno
del citoplasma,dove si ha una carica negativa e un PH alcalino.
I VIRUS
Organismi acellulari che si riproducono solo sfruttando le strutture
della cellula ospite.Costituiti da una TESTA contenente l'acido
nucleico (DNA o RNA),da un CAPSIDE contenente proteine e costituto da
unita' dette CAPSOMERI.Il virus e' inoltre costituito da un COLLO e da
una PIASTRA BASALE da cui si dipartono i filamenti laterali detti FIBRE
CAUDALI,le quali hanno funzione di ancoraggio ai tessuti della cellula
ospite.
57
I virus si dividono in: 1):):VIRULENTI (attaccano la cellula
esclusivamente per via LITICA). [il virus
entra nella cellula e la distrugge
provocandone la lisi]
2):TEMPERATI (Attaccano la cellula per via
LISOGENA e si riproducono sfruttando le
strutture della cellula ospite.
Successivanente col ciclo LITICO provocano
la lisi della cellula liberando i VIRIONI
(particelle del virus maturo)
CICLO LISOGENO:Il virus e' in simbiosi con la cellula.Il virus inietta
il DNA tramite le fibre caudali che si attaccano sulla
superficie esterna della cellula e trasferiscono il DNA
attraverso la corporatura.
CICLO LITICO:Attacco diretto che provoca la lisi della cellula ospite.
I MICRORGANISMI COME ALTERANTI DEGLI ALIMENTI
Nella maggior parte dei casi i microrganismi sono alteranti degli
alimenti.A seconda dei fattori che ne condizionano la crescita,essi
possono esercitare sull'alimento un maggiore o minore effetto
alterante.Da questo punto di vista la
temperatura e il pH di crescita di un particolare microrganismo
possono creare numerose problematiche nel campo dell'industria
alimentare.Variando il pH si riduce la carica microbica di un
alimento,ma in particolari casi,non e' possibile ridurre il Ph sotto un
certo valore.La maggior parte dei microrganismi sono neutrofili e
vivono bene a pH prossimo alla neutralita'.Ridurre il pH e'un sistema
piuttosto usato per ridurre la carica microbica,ma se si riduce troppo
il pH,l'alimento varia anche il sapore,il che puo' rendere quest'ultimo
immangiabile e quindi inadatto alla commercializzazione.Per risolvere
questi problemi si aggiungono additivi particolari
(ad sempio batteriocine).
Altro problema e'quello legato alla temperatura,che puo' inibire
particolari specie microbiche e favorire la crescita di altre.Ad
esempio,un pesce tropicale,comtenente microrganismi MESOFILI ,si
conserva meglio in frigorifero di un pesce pescato in Norvegia,dove il
clima e' piuttosto freddo.In quest'ultimo sono infatti presenti
microrganismi PSICROTROFI e PSICROFILI,capaci di sopravvivere a basse
58
temperature,cosa che ne favorisce lo sviluppo in quel particolare
ambiente (il frigorifero appunto);ne scaturisce la maggiore alterazione
dell'alimento.
Castagna Luciano
Bibliografia
BROCK: biologia dei microrganismi
59
BIOLOGIA
MOLECOLARE DEI
MICRORGANISMI
LUCIANO CASTAGNA
60
BIOLOGIA MOLECOLARE DEI MICRORGANISMI
BIOLOGIA MOLECOLARE
La biologia molecolare e' la scienza che si occupa dello studio della
struttura e della funzione delle diverse classi di macromolecole
presenti nella cellula vivente.
LA GENETICA
La genetica e' la scienza che studia i meccanismi attraverso
i quali,i caratteri vengono espressi da un organismo e trasferiti da
un organismo all'altro.La genetica ci fornisce le tecniche per
generare nuovi organismi potenzialmente utili per l'uomo e assieme
alla biologia molecolare,ci consente di capire ,non soltanto come
funziona un organismo vivente,ma ci permette altresi' di riconoscere
quali funzioni siano alterate in un organismo malato. La genetica e la
biologia molecolare hanno consentito,negli ultimi anni,progressi
eclatanti nei diversi campi a cui sono state applicate,come
l'agricoltura (OGM) l'industria e la medicina.E'proprio in campo
medico-diagnostico che queste due discipline hanno consentito i
maggiori progressi. Tuttora gli scenziati possono sviluppare metodi per
controllare importanti malattie infettive ed improntare cure su base
genetica per quelle malattie,derivate da disturbi metabolici,(una
parte delle quali dovuta all'azione dei microrganismi),una volta
considerate incurabili.
I GENI
I geni sono i depositari dell'informazione genetica,sono frammenti di
DNA che codificano la sequenza di una o piu'proteine tramite
l'ausilio di una macromolecola:l'RNA.
LE MACROMOLECOLE COINVOLTE NEL FLUSSO DELL'INFORMAZIONE
GENETICA
1)PROTEINE:Catene di aminoacidi che costituiscono le unita' funzionali
della cellula
2)DNA:costitito da unita'dette NUCLEOTIDI,formate ciascuna da uno
zucchero a 5 atomi di carbonio (deossiribosio),da una base azotata e
da un gruppo fosfato.Le informazioni sono contenute nella
sequenza di basi del DNA che sono unite tra loro da legami a
idrogeno secondo il principio di complementarieta' delle basi:
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BASE PIRIMIDINICA(timina-citosina)si appaia con BASE PURINICA
(adenina-guanina).
SECONDO IL PRINCIPIO DI COMPLEMENTARIETA'L'ADENINA SI LEGA
ALLA TIMINA E LA GUANINA ALLA CITOSINA.
Le purine hanno un doppio anello(un esoso e un pentoso legati tra loro) Le
pirimidine hanno un singolo anello(un eterociclo a 6 termini)
3)RNA:costituito da una singola catena di nucleotidi,e' presente un
ossigeno in piu'rispetto al DNA,il DEOSSIRIBOSIO e'sostituito dal
RIBOSIO,l'URACILE sostituisce la timina.
LE TAPPE DEL FLUSSO DELL'INFORMAZIONE GENETICA
I processi molecolari che sono alla base del flusso dell'informazione
genetica possono essere suddivisi in tre stadi:
1)REPLICAZIONE:La molecola di DNA,contenente le informazioni genetiche,
si duplica producendo due doppie eliche.La doppia elic originale si divide nei
suoi due filamenti complementari tramite la rottura dei legami a idrogeno
formatisi tra le basi azotate.Successivamente ognuno dei due filamenti che
costituivano la doppia elica originaria si duplica,generando il proprio
filamento complementare,che,una volta sintetizzato,da origine a
una doppia elica.A partire dai due filamenti provenienti
dal dna originario,si generano dunque due doppie eliche.
Ogni filamento genera il suo complementare rispettando
la complementarieta' delle basi,vengono poi riformati
i legami a idrogeno che tengono unito il filamento
parentale a quello neosintetizzato:
62
(DUPLICAZIONE SEMICONSERVATIVA).
2)TRASCRIZIONE:E'il processo di trasferimento dell'informazione dal DNA
all'RNA,nel quale un singolo filamento di DNA,contenente l'informazione
genetica,viene trascritto in rna
messaggero;la molecola che ha il compito di veicolare
l'informazione proveniente dal dna ai ribosomi,gli
organuli adibiti alla sintesi delle proteine: le unita'
funzionali che esplicano determinate funzioni
all'interno della cellula.Il dna infatti,non ha ruolo
diretto nella sintesi proteica ma esplica tale funzione
attraverso l'mRNA che porta il messaggio genetico dal
dna ai ribosomi.Alcune regioni di dna non codificano
proteine e sono adibite a trasferire l'informazione per
la sintesi di altri tipi di rna:
1).RNA RIBOSOMIALE (r-RNA):presente nei
ribosomi,partecipa alla sintesi
proteica
2):RNA TRANSFER (t-RNA):utilizzato nel processo di
traduzione e specifico per uno o piu'
codoni,nonche' per un particolare
aminoacido.
3).SMALL-RNA (s-RNA):specifico degli eucarioti
3):TRADUZIONE:E' il processo che porta alla trasformazione del
dell'm-RNA a proteina.La sequenza del DNA specifica un
particolare rna messaggero,la cui sequenza di basi,dovuta alla
struttura del DNA,dal quale ha copiato il messaggio,determina la
sequenza di aminoacidi di ogni proteina.Nei procarioti vi
e' quindi una corrispondenza lineare tra la sequenza di basi di un gene,
che codifica una proteina e la sequenza di aminoacidi del polipeptide
che genera quella determinata proteina.Si parla per questo motivo di
COLINEARITA' GENE-PROTEINA.Questo concetto sta a significare che la
sequenza di basi di un gene e la sequenza di aminoacidi della proteina
codificata da quel gene hanno stessa fase di lettura (sono
paralleli).Per codificare un singolo aminoacido sono necessarie tre
basi.Ogniuna di queste triplette costituisce un CODONE.Ogni codone
sull'm-RNA corrisponde a un aminoacido della catena polipeptidica della
proteina,formata a partire da quello specifico RNA
messaggero.Negli eucarioti questa colinearita' viene a
mancare a causa del fatto che non tutti i geni dell'rna
messaggero degli eucarioti codificano proteine.
L'informazione contenuta nella sequenza di basi di un acido nucleico
puo' codificare quella di un altro acido nucleico (passaggio da DNA a
m-rna) o di una proteina (passaggio da m-RNA a proteina):il
trasferimento dell'informazione da acido nucleico a proteina e'
UNIDIREZIONALE.La sequenza di una proteina non specifica quella di un
acido nucleico.
63
DOGMA CENTRALE DELLA BIOLOGIA MOLECOLARE
Il trasferimento dell'informazione da acido nucleico ad acido nucleico
o da acido nucleico a proteina e' a senso unco.Cio' e' valido per tutte
le forme di vita del nostro pianeta:Il trasferimento unidirezionale
costituisce il dogma centrale della biologia molecolare.
GENETICA DEI PROCARIOTI E DEGLI EUCARIOTI
Il genoma procariotico e' costituito da un'unica molecola di DNA
circolare,covalentemente chiusa e non racchiusa in una
membrana nucleare.Il Dna non e' contenuto in un nucleo (struttura
assente nei procarioti)
Il genoma eucariotico e' formato da molecole lineari di DNA che
costituiscono i cromosomi localizzati nel nucleo.Nei procarioti non vi
e' una membrana che separa il cromosoma dal citoplasma;il materiale
genetico (DNA) e' parte integrante del citoplasma stesso.
Negli eucarioti vi e' una separazione tra i processi di trascrizione e
traduzione(i cromosomi si trovano nel nucleo e i ribosomi nel
citoplasma esterno ad esso).Negli eucarioti i geni codificanti proteine
(ESONI) vengono trascritti nel linguaggio dell'm-RNA,successivamente
alla rimozione degli INTRONI (sequenze non codificanti):Esoni ed
Introni danno origine al TRASCRITTO PRIMARIO,dal quale vengono
successivamente rimossi gli introni durante la trascrizione del DNA in
m-RNA.Tale processo,che precede la traduzione,avviene nel
nucleo.Successivamente l'm-RNA viene trasferito attraverso piccoli fori
sulla parete esterna del nucleo (Pori Nucleari) e portato a livello del
citoplasma,dove i ribosomi provvedono alla sintesi delle
proteine,servendosi della copia del messaggio genetico del DNA,portata
dall'm-RNA.
STRUTTURA DEL DNA:LA DOPPIA ELICA
La struttura base del DNA e'il nucleotide.Esso e' costituito da uno
zucchero a 5 atomi di carbonio (DEOSSIRIBOSIO) a cui si lega una fra le
quattro basi azotate (Adenina,Guanina,Citosina,Timina)e un gruppo
fosfato PO4--- che conferisce al dna carica negativa.Il DNA e' composto
di due catene di nucleotidi legate tra loro dai legami a idrogeno che
si formano tra le basi azotate (i nucleotidi sono legati tramite legami
fosfodiestere).Gli zuccheri di ogni nucleitide sono legati dai gruppi
fosfato ad alta energia,che formano legami dal carbonio 3 di uno
zucchero al carbonio 5 dello zucchero adiacente.I due filamenti che
costituiscono la doppia elica sono disposti in modo antiparallelo:Il
filamento a sinistra si volge in direzione 5 primo-3 primo dall'alto
verso il basso,quello di destra si volge in direzione 5 primo-3 primo
ma dal basso verso l'alto.I filamenti sono avvolti l'uno attorno
all'altro a formare una doppia elica nella quale si distinguono:
64
SOLCO MAGGIORE (in corrispondenza del quale interagisce la maggior
parte delle proteine) e il
SOLCO MINORE.All'estremita' 5 primo di ogni
molecola e' presente un gruppo fosfato,mentre all'estremita' 3 primo
e'presente un gruppo ossidrile.
LE STRUTTURE ANSA-STELO E IL RIPIEGAMENTO DEL DNA
Il dna puo' subire delle variazioni che riguardano la morfologia e
l'appaiamento delle basi azotate.A seconda della lunghezza,il dna puo'
essere ripiegato a formare strutture non lineari,diverse da quelle che
si avrebbero con un normale appaiamento delle basi azotate,che segua il
principio di complementarieta'.Le molecole piu' lunghe di DNA sono
facilmente flessibili,al contrario quelle di lunghezza inferiore
65
risultano essere molto piu' rigide.In alcuni casi brevi segmenti di dna
possono venire ripiegati dalle proteine con le quali interagiscono,in
altri il dna presenta una struttura intrinseca di tipo ricurvo,generata
dal ripetersi di 5-6 adenine sulla stessa elica,intervallate da 4-5
basi.In tal caso il dna viene denominato DNA CURVO (Bent).La curvatura
del dna appare spesso coinvolta nei meccanismi di regolazione
dell'espressione genica.Molte proteine interagiscono con particolari
regioni di DNA contenenti sequenze ripetute in senso inverso.
Le sequenze invertite ripetute conferiscono alla sequenza di dna una
doppia simmetria e se vicine tra loro,possono generare strutture
cruciformi dette ANSA-STELO.Esse si formano tramite appaiamento di basi
complementari localizzate sullo stesso filamento di acido nucleico.
STRUTTURE GENERATE PER APPAIAMENTO DI BASI COMPLEMENTARI
Sono di tre tipi:
1).ANSA-STELO (STEEM-LOOP):strutture generate per appaiamento di basi
complementari sullo stesso filamento.Si formano poiche'
le basi non complementari non si appaiano.L'ansa presente
all'estremita' di ogni filamento si forma a causa del
fatto che un tratto del filamento non contiene basi
complementari.La complementarieta' viene ristabilita in
corrispondenza dello stelo,dove si verifica un
appaiamento di basi di tipo normale tra i filamenti
antiparalleli.
2).STRUTTURA:puo' generare da dna lineare a singolo filamento con
CIRCOLARE estremita' complementari dette (ESTREMITA' COESIVE).Il dna
assume forma circolare in seguito all'appaiamento delle
estremita' stesse secondo il principio di
complementarieta' delle basi.
3).STRUTTURE A:strutture simili a quelle ansa-stelo ma quasi
FORCINA completamente prive dell'ansa.Si formano da sequenze che
non si appaiano,presenti alle estremita' della molecola
di dna a singolo filamento.(In una molecola di dna a
doppio filamento le strutture a forcina sono trasformate
in strutture ansa-stelo).
DENATURAZIONE E RINATURAZIONE DEL DNA
Le coppie di basi del dna sono tenute assieme da numerosi legami a
idrogeno,il cui numero molto elevato compensa il fatto che si tratti di
interazioni piuttosto deboli,se considerate singolarmente.I legami a
idrogeno sono direttamente proporzionali al numero di paia di basi che
costituiscono la doppia elica di dna.L'adenina e la timina sono legate
assieme da due legami a idrogeno,mentre la guanina e la citosina sono
legate da tre legami.Pertanto una molecola di dna contenente un maggior
numero di legami tra guanina e citosina risultera' piu' resistente al processo
di DENATURAZIONE,nel quale si ha scissione della doppia elica tramite
rottura dei legami a idrogeno previo aumento della
temperatura.Finche' il dna isolato dalla cellula e' mantenuto a
temperatura ambiente e a una concentrazione salina isotonica,i legami a
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idrogeno rimangono stabili e non si verifica denaturazione(melting).
Quando avviene denaturazione i legami a idrogeno tra le basi
tendono a rompersi,ma i legami covalenti che sono presenti all'interno
di ciascun filamento e che tengono uniti tra loro i
nucleotidi,rimangono stabili.In seguito alla rottura dei legami a
idrogeno i due filamenti si separano.Il fenomeno della denaturazione
e'misurabile sperimentalmente poiche' a parita' di sequenza
nucleotidica,i DNA a singolo e doppio filamento differiscono tra loro
per l'assorbimento di luce ultravioletta.Il dna con elevato numero di
legami G-C si denatura a temperature piu' elevate rispetto a un DNA
contenente un maggior numero di legami A-T.Se il dna riscaldato viene
fatto rafferddare si possono riformare i legami a idrogeno tra le basi.
Il ricostituirsi dei legami a idrogeno previo raffreddamento
rappresenta la RINATURAZIONE del dna.
SUPERAVVOLGIMENTO DEL DNA
Tutte le cellule,siano esse procariotiche o eucariotiche,hanno un DNA
di lunghezza nettamente superiore al loro daimetro.Il problema riguarda
anche i virus,il cui dna ha dimensioni considerevoli rispetto alla
porzione dove esso e' contenuto (testa).
Il superavvolgimento del dna consente di
compattare l'acido nucleico permettendone l'inglobamento all'interno
della cellula.Il superavvolgimento e' lo stato in cui il dna,posto
sotto torsione,viene ulteriormente attorcigliato,in modo da ridurne le
dimensioni e da renderle paragonabili a quelle della porzione spaziale
intracellulare in cui il dna stesso e' contenuto.Il dna puo' essere
superavvolto sia in senso positivo che in senso negayivo.Nel primo caso
il dna si attorciglia attorno al proprio asse nella stessa direzione
della doppia elica,nel secondo caso invece,il dna si torce attorno al
proprio asse in direzione opposta a quella della doppia elica.
Nei procarioti,pur essendo presenti delle proteine associate al
dna,quet'ultimo viene considerato NUDO.Il superavvolgimento avviene
tramite il legame covalentemente chiuso del filamemto di dna,per
appaiamento delle estremita' coesive che si legano formando una
struttura circolare,caratterizzata da dimensioni molto ridotte rispetto
alla forma rilassata.
Negli eucarioti ci sono delle particolari proteine
(gli ISTONI),che legano il dna dando origine assieme al dna stesso,a
una complessa struttura detta NUCLEOSOMA .La formazione del nucleo
soma provoca nel dna superavvolgimenti negativi.Gli istoni sono proteine
cariche positivamente che neutralizzano le cariche negative del
dna,provenienti dai gruppi fosfato.I nucleosomi possono aggregarsi e
costituire un materiale fibroso detto CROMATINA,che puo' essere
ulteriormente compattata.
LE TOPOISOMERASI
Il superavvolgimento del dna nei procarioti avviene tramite un enzima
(DNA-GIRASI),in grado di introdurre superavvolgimenti negativi.Tale
enzima e' la TOPOISOMERASI II.Tramite l'azione delle topoisomerasi il
dna puo' trovarsi sia nello stato rilassato sia in quello di
67
superavvolgimento.Nel primo caso avviene la duplicazione del dna,nel
secondo il dna viene compattato all'interno della cellula.Il livello di
superavvolgimento influenza l'espressione genica:(alcuni geni vengono
espressi meglio con dna superavvolto,altri nella fase di
rilassamento).Intervenendo sul grado di superavvolgimento le
topoisomerasi
possono regolare il processo di replicazione aumentandone o
diminuendone la velocita'. Ci sono essenzialmente due tipi di
topoisomerasi che si ritrovano sia nei procarioti sia negli eucarioti:
1).TOPOISOMERASI 1:Enzima in grado di rimuovere il superavvolgimento
del dna introducendo un taglio all'interno di un
singolo filamento della doppia elica di dna e
provocando la rotazione di un filamento attorno
all'altro.Nei procarioti il cromosoma batterico e'
diviso in domini di superavvolgimento per evitare
che una singola rottura provochi il rilassamento
dell'intero cromosoma.Un taglio in uno di questi
domini non implica il rilassamento del dna in altri
domini.Alcuni procarioti contengono un enzima
chiamato GIRASI INVERSA che introduce
superavvolgimenti positivi del dna.Parte del dna di
questi microrganismi pare rilassata grazie
all'equilibrio tra l'attivita' di proteine simili
agli istoni e l'azione della girasi inversa.Il
superavvolgimento positivo ottenuto dalla girasi
inversa avrebbe la funzione di proteggere il dna
dalla denaturazione.
Negli eucarioti,nonostante
l'azione della topoisomerasi 1 il dna lineare del
cromosoma non si rilassa a causa dell'azione delle
proteine legate al dna (ISTONI).
2).TOPOISOMERASI 2:(DNA-GIRASI)introduce superavvolgimenti
negativi.Viene inibita da alcuni antibiotici
quali:l'acido nalidixico,ciprofloxacina e la
novobiocina
CROMOSOMA
Il cromosoma e' il componente genetico che contiene i geni
indispensabili per le tappe del metabolismo cellulare.La presenza del
cromosoma e'indispensabile per lo svolgimento delle attivita'
metaboliche che avvengono all'interno della cellula.La distruzione del
cromosoma comporta la morte della cellula.I geni contenuti nel
68
cromosoma sono detti HOUSEKEEPING e rappresentano i geni del
metabolismo di base della cellula,cioe' quei geni che sono sempre
richiesti dalla cellula per la prosecuzione delle attivita' che ne
garantiscono l'avanzamento del ciclo vitale.Le specie
Rhodobacter,halobacterium,e il genere brucella e borrelia burgdorferi
hanno piu' di un cromosoma.
ELEMENTI GENETICI EXTRACROMOSOMICI:
1).MITOCONDRI:Presenti nelle cellule eucariotiche,hanno un proprio
genoma costituito da dna extracromosomico,che assieme
all'rna ribosomiale,consente la sintesi di alcune
proteine e l'autoreplicazione.Sono la sede dei processi
respiratori e della produzione di energia sotto forma di
ATP.
2).CLOROPLASTI:Presenti negli eucarioti,sono gli organuli adibiti alla
fotosintesi.
3).ELEMENTI TRASPONIBILI:Presenti nei procarioti e negli eucarioti.Sono
frammenti di dna in grado di muoversi da un sito all'altro all'interno del
genoma.Non hanno replicazione autonoma ma si replicano come parte di
altre molecole di dna. Si dividono in:
a).SEQUENZE DI INSERZIONE:costituiscono il tipo piu' semplice
di elementi trasponibili.Contengono
esclusivamente l'informazione genetica
necessaria per la propria trasposizione.
b).TRASPOSONI:Sono di dimensioni maggiori e contengono altri geni oltre a
quelli necessari per la propria trasposizione.
N.B
Mitocondri e cloroplasti nonostante abbiano molti geni e un sistema di
traduzione che ,nel caso dei mitocondri,consente la replicazione del
dna in modo autonomo,non possono esistere indipendentemente dal
cromosoma.Esso infatti contiene i geni necessari alla sintesi della
maggior parte delle proteine.
REPLICAZIONE DEL DNA:meccanismi di processamento
Come gia' precedentemente affermato la replicazione del dna e' la prima
tappa del flusso dell'informazione genetica.Se la doppia elica si apre
viene sintetizzato un filamento complementare a ogiuno dei filamenti
parentali.La molecola di dna che e' stata copiata prende il nome di
STAMPO.
69
STAMPI E INNESCHI
Il precursore di ogiuno dei nuovi nucleotidi della catena e' il
NUCLEOSIDE 5 PRIMO TRIFOSFATO dal quale vengono rimossi i due fosfati
terminali,mentre quello piu'interno viene legato covalentemente allo
zucchero deossiribosio ad esso adiacente.In tal modo si ha l'aggiunta di un
nuovo nucleotide alla catena.Si richiede la presenza di un gruppo ossidrile
libero che leghi il deossiribosio al fosfato della catena adiacente. La DNAPOLIMERASI e' l'enzima che si occupa della sintesi del
dna. Essa catalizza la reazione di addizione tra due nucleotidi legando
il fosfato in posizione 5 primo all'ossidrile in posizione 3 primo.Non
esiste nessuna DNA-POLIMERASI in grado di iniziare da sola la sintesi
di una nuova catena nucleotidica.Tutte le dna polimerasi sanno solo
aggiungere un nucleotide a un gruppo ossidrile preesistente in
posizione 3 primo.Per iniziare la sintesi di una nuova catena di dna
e'necessaria la presenza di un INNESCO,sintetizzato da particolari
enzimi che polimerizzano l'RNA chiamati PRIMASI.L'innesco e' una breve
sequenza di rna,alla quale la DNA-POLIMERASI puo' attaccare il primo
nucleotide della catena (e anche i successivi) procedendo in direzione
5 primo-3 primo.Dopo l'aggiunta del primo nucleotide la sintesi della
catena in fase di formazione,procede come DNA e non piu' come
RNA.L'innesco a rna verra' successivamente rimosso.
INIZIO DELLA SINTESI DEL DNA
Nei procarioti il cromosoma e' circolare ed esiste un solo sito
cromosomico (ORIGINE DI REPLICAZIONE) costituita da circa 300 basi
riconosciute da proteine specifiche.A livello dell'origine di
replicazione la doppia elica di dna si apre e la duplicazione inizia su
entrambi i filamenti.Mano a mano che la duplicazione procede la FORCA
DI REPLICAZIONE,cioe' il sito in corrispondenza del quale avviene la
replicazione,si sposta lungo il dna.Nei procarioti si creano due forche
di replicazione che procedono a sintetizzare il dna circolare in senso
opposto l'una all'altra.Cio'porta alla formazione di una struttura TETA
che e' dovuta al parallelismo dei due siti di replicazione orientati in
senso opposto.
Ogni cromosoma eucariotico ha piu' di un'origine di replicazione
poiche' il dna e' piu' lungo e anche perche' le dna-polimerasi
eucariotiche non sono in grado di replicare il dna cosi' velocemente
come quelle procariotiche.
LA FORCA DI REPLICAZIONE
A livello della forca di replicazione il dna si srotola per azione di
alcune proteine chiamate ELICASI,che idrolizzano l'ATP mentre si
spostano lungo l'elica di dna rompendo i legami a idrogeno tra le
basi.Si forma coseguenzialmente una piccola regione di dna a singolo
filamento che viene subito complessata da una particolare proteina(LA
PROTEINA AFFINE AL DNA A SINGOLA ELICA) che stabilizza il dna impedendo
la formazione di legami a idrogeno sullo stesso filamento (i quali
potrebbero generarsi dall'interazione di basi complementari di due
nucleotidi consecutivi).
70
FILAMENTO GUIDA E FILAMENTO COPIA
Le elicasi dunque generano due filamenti di dna che sono differenti in
relazione alla sintesi del nuovo filamento complemenatare.Le due forche
di replicazione hanno versi opposti,lo stesso vale per i due
filamenti.Nel filamento che cresce dal 5 primo fosfato al 3 primo
ossidrile,detto FILAMENTO GUIDA la sintesi del dna procede in modo
continuo,poiche'tale filamento cresce nella stessa direzione della forca
di replicazione,sulla quale dunque e' sempre disponibile un gruppo 3 primo
ossidrile da utilizzare per aggiungere un nucleitide.Il filamento guida segue
la normale direzione della sintesi del dna e ha lo stesso verso della DNAPOLIMERASI (dal 5 primo fosfato al 3 primo
ossidrile).Nel filamento opposto detto FILAMENTO COPIA la sintesi del
dna avviene in modo discontinuo poiche' non e' disponibile sulla forca
di replicazione un gruppo ossidrile libero per aggiungere un
nucleotide. Cio' accade perche' il filamento copia cresce in direzione 3
primo 5 primo,opposta a quella delle DNA-POLIMERASI,che procedono in
direzione 5 primo 3 primo.I gruppi ossidrili necessari per l'aggancio
alla catena di nuovi nucleotidi,sono presenti,ma situati lontano dalla
forca di replicazione all'estremita' opposta.La discontinuita' con la
quale avviene la sintesi del dna,rende necessaria la sintesi di piccoli
inneschi a rna da parte delle primasi.In tal modo si forniscono gruppi
ossidrili liberi in posizione 3 primo,necessari per l'aggancio del primo
nucleotide.Terminata la sintesi degli inneschi le primasi vengono
sostituite dalla DNA-POLIMERASI 1 che continua la sintesi del dna
aggiungendo nucleotidi finche' non raggiunge quello precedentemente
sintetizzato.A questo punto viene sosttituita dalla DNA-POLIMERASI 3
che continua la sintesi del dna.La DNA POLIMERASI 1 grazie alla sua
attivita' di ESONUCLEASI 5 primo-3 primo rimuove gli inneschi che
incontra avanzando.Una volta sostituito l'innesco eliminato con dna,la
polimerasi viene rilasciata e il taglio fatto all'inizio dalle elicasi
viene saldato attraverso l'ultimo legame prodotto dall'enzima
DNA-LIGASI.Questo enzima e' in grado di sigillare ogni legame tra le
estremita' 5primo fosfato e 3 primo ossidrile ed e' coinvolto assieme
alla dna-polimerasi 1 nei meccanismi di riparazione del dna.
FRAMMENTO DI OKAZAKI:Frammento di dna sintetizzato
sul
filamento copia dalla dna-polimerasi1,lungo circa
mille basi.Ogniuno di questi frammenti ha bisogno
di un innesco a rna.
Dall'origine si dipartono due forche di replicazione che procedono in
direzioni opposte,vengono sintetizzati due filamenti guida e due
filamenti copia.
IL REPLISOMA:Complesso contenente proteine,elicasi,primasi e due
dna-polimerasi3.
71
PROOFREADING:Attivita' secondaria della dna-polimerasi1,consiste
nell'attivita' di ENDONUCLEASI 3 primo - 5 primo che permette la
rimozione del nucleotide inserito erroneamente nella catena e la
successiva sostituzione col nucleotide corretto.(e' l'opposto
dell'esonucleasi 5 primo 3 primo che rimuove gli inneschi).
N.B
ESONUCLEASI:agisce alle estremita' del filamento
ENDONUCLEASI:agisce all'interno del filamento
TERMINAZIONE DELLA REPLICAZIONE
A replicazione ultimata le due molecole circolari rimangono legate e
sono successivamente separate da una topoisomerasi.Alla fine della
replicazione del dna e' necessario che ogni cellula figlia derivata
dalla suddivisione cellulare abbia una copia del cromosoma.Il processo
che porta alla formazione di due cellule figlie
(divisione cellulare) e' chiamato MITOSI,tramite cui si ha la divisione
del patrimonio genetico,possibile grazie al fatto che la duplicazione
del cromosoma avviene prima della separazione delle due cellule.
ELEMENTI GENETICI LINEARI
Nel caso di cromosomi linari si pone un problema che concerne il
processo di replicazione del dna,che non si pone invece nel caso di
cromosomi circolari.Nei cromosomi lineari esiste infatti piu' di un
origine di replicazione ed e' necessario che si mantenga una
corrispondenza con l'estremita 5 primo.Se non accadesse nulla a ogni
replicazione la molecola di dna risulterebbe piu' corta della
precedente in quanto i
diversi punti di origine della replicazione non cominciano la sintesi
del dna dall'estremita' 5 primo.(la sintesi del dna avviene comunque in
direzione 5 primo- 3 primo).Per risolvere questo problema nei
procarioti con dna lineare si utilizzano al posto degli inneschi a rna
degli inneschi proteici che si legano tenacemente all'estremita' 5
primo e fungono da punto di partenza per la replicazione.Negli
eucarioti vi sono particolari enzimi detti TELOMERASI che allungano il
filamento di dna attaccando delle sequenze dette telomeri
all'estremita 3 primo.I telomeri non vengono replicati e
vengono poi rimossi al termine della replicazione in modo tale da
mantenere inalterata la lunghezza del filamento originale.
LA TRASCRIZIONE DEL DNA
La trascizione del messaggio genetico da DNA a RNA viene realizzata
dall'enzima RNA-POLIMERASI che catalizza la reazione per la formazione
di ribonucleotidi in serie.La funzione principale di questo enzima e'
formare i legami tra i nucleotidi della catena di rna.Per sintetizzare
l'rna,la rna-polimerasi richiede la presenza di un singolo filamento di
dna da utilizzare come stampo.Diversamente dalla dna-polimerasi
l'rna-polimerasi puo' iniziare da sola la sintesi della catena di
nucleotidi dell' rna.Il nucleotide iniziale della catena conserva i tre
72
gruppi fosfato in quanto non e' richiesto dalla rna-polimerasi un
innesco,indispensabile invece nela caso della sintesi di una nuova
catena di dna da parte della dna-polimerasi.
L'rna polimerasi inoltre
NON HA CAPACITA' DI CORREGGERE GLI ERRORI.Un errore di trascrizione
non comporta danni permanenti in quanto un rna messaggero mal tradotto
produrrebbe una proteina anomala,il cui ciclo vitale tuttavia e'
limitato nel tempo (20 min in E.coli).Si deduce che l'rna polimerasi
non ha bisogno di tale capacita'.
Nei batteri e negli archea e' presente una singola rna-polimerasi.Nel
nucleo degli eucarioti ne sono presenti tre.
Nei batteri l'rna-polimerasi e'costituita da subunita' che
interagiscono tra loro per formare l'enzima attivo detto OLEOZIMA.In
E.coli vi sono 4 subunita':
E.COLI
RNA POLIMERASI:
[subunita'alfa/beta/beta primo]:costituiscono il core dell'enzima e
procedono da soli alla sintesi
dell'rna.
[subunita' sigma]:puo' essere facilmente staccata dalle altre subunita'
proteiche e ha il compito di riconoscere il PROMOTORE
sul dna (sito idoneo per l'inizio della
trascrizione).
La trascrizione si arresta in corrispondenza dei terminatori della
trascrizione.
73
FASI DELLA SINTESI DELL'RNA
La sintesi dell'rna avviene in corrispondenza di specifiche sequenze di
dna:il sito d'inizio (promotore) e quello di terminazione.Si compone di
4 fasi:
1).il fattore sigma permette all'rna-polimerasi di riconoscere il
promotore,ossia il sito d'inizio della trascrizione.
2).il fattore sigma viene rilasciato durante la fase di
ELONGAZIONE,dove si inizia la trascrizione.
3).CRESCITA DELLA CATENA DI RNA:la rna polimerasi si muove lungo la
catena di dna provocando la temporanea
apertura della doppia elica e la
trascrizione di uno dei due
filamenti.
4).RILASCIO DELL'RNA E DELLA RNA-POLIMERASI:quando il sito di
terminazione viene
raggiunto la trascrizione
si arresta e vengono
rilasciati sia
l'rna-polimerasi sia l'rna
messaggero.
I PROMOTORI:Sono specifiche sequenze di dna in corrispondenza delle
quali si legano le rna-polimerasi per dare inizio alla
sintesi dell'rna.
RUOLI DELLE RNA-POLIMERASI NEGLI EUCARIOTI
RNA-POLIMERASI 1:sintetizza la maggior parte degli
rna ribosomiali (r-RNA).
RNA-POLIMERASI 2:sintetizza tutti gli rna messaggeri (m-RNA).
RNA-POLIMERASI 3:sintetizza tutti gli rna transfer (t-RNA) e un tipo di
r-RNA.
I TERMINATORI DELLA TRASCRIZIONE
La terminazione della sintesi dell'rna avviene in corrispondenza di
specifiche sequenze di dna.Nei batteri la sequenza di terminazione
classica e' costituita da una sequenza invertita ripetuta con un
segmento centrale di basi non ripetute.Quando una sequenza di questo
tipo viene tradotta l'rna puo' formare una struttura ansa-stelo per
appaiamento di basi complementari sullo stesso filamento.Questo evento
puo' provocare l'arresto della trascrizione.Sono stati scopeti altri tipi di
terminatori che richiedono la presenza della PROTEINA RHO,la quale si
lega tenacemente all'rna e puo' provocare il distacco dell'rna-polimerasi e
dello stesso rna dal dna,terminando cosi' la trascrizione.
74
UNITA' DI TRASCRIZIONE E GLI RNA RIBOSOMIALI
Nei procarioti sono presenti tre tipi di rna
ribosomiali:r-RNA16S.r-RNA5S ed r-RNA23S.Nel genoma ci sono regioni di
raggruppamento (CLUSTER) contenenti ogniuna un gene per ogniuno di
questi rna ribosomiali.Le unita' di trascrizione degli rna ribosomiali
sono detti:OPERONI DI r-RNA.
Nello spazio compreso tra i geni per rna16S
ed rna23S sono contenuti uno o piu' geni per un t-RNA.I geni che
codificano proteine esprimono la loro informazione attraverso l'rna
messaggero.Esso e' rapidamente degradato dalle nucleasi intracellulari
e viene percio' definito INSTABILE.Gli rna ribosomiali e gli rna
transfer non vengono degradati e vengono percio' definiti STABILI.
RNA POLICISTRONICI E MONOCISTRONICI
Nei procarioti un singolo rna messaggero spesso contiene piu' di una
regione codificante,in esso infatti sono codificati piu' geni che
costituiscono un OPERONE.L'rna che codifica un gruppo di geni
protrascritti e' detto POLICISTRONICO.Negli eucarioti gli m-RNA sono
quasi sempre MONOCISTRONICI;vi e' corrispondenza tra un m-RNA e la
proteina specifica da esso sintetizzata.
IL PROCESSAMENTO DELL'RNA
Si definisce processamento dell'rna la conversione di un rna precursore
ad rna maturo.
Nei procarioti l'rna messaggero e',funzionale gia' cosi' come viene
ottenuto dal processo di trascrizione e il processamento non e'
necessario.
Negli eucarioti l'rna messaggero ottenuto dalla
trascrizione,e' costituito da zone codificanti (ESONI) e da zone non
codificanti (INTRONI).E' necessario dunque un processamento dell'rna
messaggero che permetta la rimozione degli introni (inutili ai fini
della traduzione),prima dell'ultima fase del flusso dell'informazione
genetica:LA TRADUZIONE che consiste nella trasformazione dell'm-RNA in
proteina.La fase di processamento durante la quale gli introni vengono
rimossi e gli esoni vengono saldati tra loro e' definita SPLICING
(giunzione).Tale processo e' eseguito da una struttura articolata detta
SPLICEOSOMA e costituisce la prima tappa del processamento dell'm-RNA
eucariotico.
Vi sono altre due tappe del processamento dell'rna
messaggero negli eucarioti.Entrambe avvengono nel nucleo prima che
l'm-RNA maturo sia trasportato nel citoplasma:
1).CAPPING (incappucciamento):avviene prima della fine della
trascrizione e consiste nell'aggiunta di guanine metilate
(G+CH3) all'estremita' 5 primo fosfato.
2).TAILING (poliadenizzazione):avviene in coincidenza con la
terminazione della trascrizione e consiste in un
accorciamento (trimming) dell'estremita' 3 primo e
nell'aggiunta di una coda di adenine ripetute.
75
Tali processi servono a rendere funzionale l'rna al processo di
traduzione e fanno in modo che l'rna mantenga la lunghezza origianaria
evitando cosi' i problemi dovuti alla linearita' del cromosoma.
I RIBOZIMI
Gli rna catalitici detti RIBOZIMI sono coinvolti in molti processi
cellulari.Sono presenti nei procarioti.La
maggior parte dei ribozimi e' costituita da introni SELF-SPLICING,in
grado di autorimuoversi e di giuntare tra loro i due esoni
adiacenti.Gli introni self-splicing si differenziano dagli altri enzimi
proteici poiche' possono catalizzare la propria reazione una sola
volta.Vi e' un ribozima particolare (RNASI P) CHE PUO' AGIRE IN MANIERA
RIPETUTA UTILIZZANDO SUBSTRATI DIVERSI POICHE' NON SI AUTODIGERISCE
DURANTE LA REAZIONE.
Nella cellula il ribozima rnasi p ha la funzione di modificare i
trascritti primari che codificano per gli rna transfer.
IL CODICE GENETICO
La degenerazione del codice consiste nel fatto che non sempre c'e'
corrispondenza tra aminoacido e codone.Nella cellula un codone e' letto
dall'appaiamento di basi con un t-RNA a livello di una sequenza di tre basi
detta ANTICODONE.Le molecole di t-RNA in alcuni casi possono
formare appaiamenti classici solo con le prime due basi del codone
sopportando in terza posizione anche un'altra base.Questo fenomeno di
appaiamento erroneo con la terza base del codone costituisce una
MUTAZIONE PUNTIFORME
N.B
Non necessariamente una mutazione puntiforme provoca una mutazione del
codice genetico.Se c'e' un errore di trascrizione dell'm-RNA,questo errore
verra' tradotto nella proteina ad esso corrispondente.Tuttavia
si ha una mutazione solo nel caso in cui la tripletta non codifichi lo
stesso aminoacido.Anche con la terza base sbagliata infatti e' possibile
esclusivamente in relazione alla terza base.
NEL CASO DELLA METIONINA E DEL TRIPTOFANO L'ALTERAZIONE DELLA
TERZA BASE PROVOCA MUTAZIONE POICHE' QUESTI DUE AMINOACIDI SONO
CODIFICATI DA
UNA SOLA TRIPLETTA.CIO' COMPORTA CHE CON LA TERZA BASE SBAGLIATA
SI CODIFICA UN AMINOACIDO DIVERSO.
Nel caso in cui invece l'alterazione riguardi almeno 2 basi si avra'
sicuramente una mutazione.
CODONE DI INIZIO :AUG (codifica l'aminoacido N-formilmetionina)
CODONI DI STOP:UAA-UGA-UAG (non codificano alcun aminoacido e
costituiscono i segnali di terminazione
della traduzione di un gene che codifica
una specifica proteina).
76
FASI DI LETTURA
Per convenzione la fase di lettura corretta e' chiamata FASE 0 e
rappresenta la fase di lettura che una volta tradotta,fornisce la
proteina specifica di quel gene.Le altre fasi di lettura possibili
(+1 e -1) non codificano la stessa sequenza di aminoacidi di quella
specifica proteina.
FASI DI LETTURA APERTE (open-reading-frame)
Per essere tradotto un m-RNA deve contenere una fase di lettura aperta
che consiste in un codone d'inizio (generalmente AUG),seguito da
numerosi codoni e da un codone di stop.
IL CONCETTO DI CODICE GENETICO UNIVERSALE
Studiando il batterio E.coli e il suo sistema di sintesi delle proteine
si comprese l'universalita' del codice genetico.Introducendo nel
sistema di sintesi proteica di E.coli una sequenza di m-RNA prelevata
da un mammifero,che codificava la sintesi dell'immunoglobulina,nel
batterio si osservava la sintesi di tale proteina.Cio' rese manifesto
il fatto che il codice genetico e' universale e cioe' utilizzato da
tutti gli esseri viventi.
Si scopri' in seguito che alcuni organelli e
alcune cellule usano un codice genetico leggermente modificato rispetto a
quello universale:tutti questi codici genetici alternativi utilizzano come
codoni quelli che in genere sono codoni di stop.Agli inizi si pensava che i
diversi codoni degenerati,che codificavano lo stesso
aminoacido,venissero utilizzati con la stessa frequenza;in seguito ci
si rese conto del contrario.L'utilizzazione dei codoni e' preferenziale
e variabile da organismo a organismo.
GLI RNA TRANSFER
L'rna transfer contiene l'anticodone che si lega al codone sull'rna
messaggero.Ogni t-RNA ha specificita' non solo per un particolare
codone sull'm-RNA ma anche per uno specifico aminoacido.Il t-RNA e il
suo specifico aminoacido vengono trasportati assieme da un enzima che
fa in modo che ogni t-RNA riceva l'aminoacido corretto.Questi enzimi in
grado di attivare gli aminoacidi sono detti AMINOACIL-TRA-SINTETASI.
STRUTTURA DEL t-RNA
Le molecole di rna transfer contengono alcune basi diverse da quelle
presenti normalmente nell'rna.Queste BASI ATIPICHE sono modificate per
metilazione (aggiunta di un gruppo metile CH3)dopo la trascrizione.La
77
modifica delle basi del t-RNA e' necessaria a rendere funzionale il
t-RNA al processo di traduzione.
Una delle regioni variabili della molecola di t-RNA e' l'ansa
dell'anticodone,in cui e' presente l'anticodone che si lega al codone
sull'm-RNA.L'ansa dell'anticodone e' costituita da tre nucleotidi
coinvolti nel processo di riconoscimento e appaiamento con il
codone.All'estremita' accettrice (3 primo ) di tutti i t-rna e'
presente una sequenza di tre nucleotidi non appaiati la cui sequenza e'
CCA (citosina-citosina-adenina).L'aminoacido si lega al ribosio
dell'adenina terminale e da questa regione viene poi trasferito a
livello della catena polipeptidica nascente sul ribosoma.La reazione
specifica tra un aminoacido e il suo t-RNA catalizzata
dall'aminoacil-t RNA-sintetasi e' costituita da due fasi:
1).ATTIVAZIONE:aminoacido+ATP=Aminoacil-AMP+P
[attivato]
[aminoacido]
2).CARICAMENTO:L'aminoacido caricato viene poi trasferito al t-RNA
per formare un t-RNA carico
Aminoacil-AMP+t-RNA=Aminoacil-t rna+AMP
Una volta avvenute l'attivazione e il caricamento
l'aminoacil-tRNA viene trasportato da delle proteine verso i ribosomi.
78
CAMBIAMENTI PECULIARI DEL t-RNA
1).BASI ATIPICHE:Sono presenti nel t-RNA.
Pseudouridina,metil-guanosina,dimetil-guanosina,iosina
metil-iosina.
2).OSCILLAZIONE DELLA TERZA BASE:puo' verificarsi nelle immediate
vicinanze dell'anticodone sul t-RNA.A
causa di un errore di trascizione
avviene la demetilazione
dell'uracile,al posto del quale dunque
possiamo trovare una timina.Tale
errore non ha conseguenze dal punto
di vista chimico e dei legami tra
m-RNA e t-RNA,non si verifica quindi
alcuna alterazione della proteina
codificata da quel particolare rna
messaggero. E' L'UNICO CASO IN CUI
POSSIAMO TROVARE UNA TIMINA NEL T-RNA.
TRADUZIONE:IL PROCESSO DI SINTESI PROTEICA
I ribosomi costituiscono il sito presso il quale avviene la sintesi
delle proteine.Nei procarioti i ribosomi sono formati da due subunita'
(30s e 50s),ogniuna delle quali costituita da rna ribosomiali e
proteine ribosomiali.
RIBOSOMA PROCARIOTICO si compone di subunita':
1).30s (contiene r-RNA 16s e circa 21 proteine).
2).50s (contiene r-RNA 5s,r-RNA 23s e circa 34 proteine).
L'energia necessaria al processo di sintesi proteica e' fornita da GTP
(guanosintrifosfato).
FASI DELLA SINTESI PROTEICA
1).INIZIO:Nei procarioti si forma un complesso d'inizio costituito da
una subunita' 30s,dall'm-RNA e dal t-RNA per la
formil-metionina.E' richiesta la presenza di GTP e dei
fattori d'inizio.Al complesso d'inizio viene aggiunta una
subunita' 50s per formare un ribosoma 70s attivo.Il codone
d'inizio sull'rna messaggero e' preceduto dalla sequenza
SHINE-DALGARNO,coinvolta nel legame tra l'estremita' 5 primo
dell'm-rna e l'estremita' 3 primo della subunita' 16s del
ribosoma.Le due estremita' sono complementari.
Negli eucarioti
i ribosomi riconoscono l'm-RNA dal 5 primo CAP e iniziano la
traduzione utilizzando il primo codone possibile.
2).ELONGAZIONE:L'rna messaggero e' legato alla subunita' 30s del
ribosoma.Altri siti di legame sono il SITO A (accettore)
e SITO P (peptidico).Il sito accettore e' la zona dove
79
si lega inizialmente il t-RNA caricato del suo
aminoacido specifico.Il sito peptidico e' la zona dove
il peptide nascente e'legato al t-RNA.Il t-RNA che
trattiene il peptide deve muoversi dal sito accettore al
sito peptidico,lasciando libero il primo spazio per un
altro t-RNA caricato del suo aminoacido.La traslocazione
dal sito A al sito P richiede una molecola di GTP per
ogni t-RNA traslocato.Durante la traslocazione ci si
deve spostare di un codone per volta.
3).TERMINAZIONE E RILASCIO:La traslocazione spinge il t-RNA ormai vuoto
verso il sito E (exit) dove il t-RNA viene rilasciato dal ribosoma.La
terminazione della sintesi delle proteine avviene quando
si raggiunge un codone che non codifica un aminoacido.In
presenza di un codone di stop nessun t-RNA puo' legarsi e la traduzione si
blocca.
Particolari proteine (FATTORI DI RILASCIO)
riconoscono i segnali di terminazione e tagliano il peptide determinando il
rilascio della proteina completa.Successivamente il ribosoma si dissocia e
le due subunita' sono libere e disponibili per sintetizzare nuovi
complessi d'inizio.
EFFETTO DEGLI ANTIBIOTICI SULLA SINTESI PROTEICA
Numerosi antibiotici inibiscono la sintesi proteica interagendo col
ribosoma:
ANTIBIOTICI INIBITORI: a)streptomicina (inibisce l'inizio)
DELLA SINTESI PROTEICA b)puromicina (
)
cloramfenicolo( inibiscono )
cicloesimide ( la fase di )
tetraciclina ( elongazione)
RIPIEGAMENTO DELLE PROTEINE
Per ripiegarsi in modo giusto alcune proteine richiedono l'assistenza
di altre proteine chiamate CHAPERON MOLECOLARI.Una delle principali
attivita' che svolgono i chaperon e' quella di impedire l'aggregazione
non corretta delle proteine.Un tipo particolare di chaperon molecolare
e'la CHAPERONINA.
MECCANISMO D'AZIONE DI UNA CHAPERONINA
La proteina non ripiegata o ripiegata in modo scorretto entra
all'interno del chaperon molecolare ,dove viene ripiegata e poi
rilasciata.L'energia per il ripiegamento viene fornita dall'ATP.
80
SECREZIONE DELLE PROTEINE
Nei procarioti gli enzimi periplasmatici ed extracellulari sono
eliminati dalla cellula e sono definiti PROTEINE DI SECREZIONE.
Negli eucarioti molte delle proteine che devono essere trasportate
attraverso la membrana sono sintetizzate con una sequenza addizionale di
15-20 aminoacidi detta SEQUENZA SEGNALE.La sequenza segnale serve ad
indicare ad altre proteine che quella particolare proteina deve essere
esportata e ha inoltre la funzione di impedire che la proteina in questione si
ripieghi completamente prima dell'esportazione.Il ruolo
principale nella selezione delle proteine che devono essere secrete e'
svolto dalle SRP (particelle di riconoscimento del segnale),presenti in
tutte le cellule.La SRP riconosce la proteina dotata di sequenza
segnale e la rilascia in un complesso proteico di membrana,in
corrispondenza del quale,in seguito al passaggio attraverso un poro,la
proteina viene secreta.
N.B
I procarioti a volte utilizzano un codone d'inizio diverso da AUG come
ad esempio GUG.
REGOLAZIONE DELL'ESPRESSIONE GENICA
GLI ENZIMI COSTITUTIVI
Sono enzimi fondamentali richiesti in tutte le condizioni nutrizionali
e sintetizzati continuamente dalla cellula.
Nella cellula esistono due principali strategie di regolazione:
1).CONTROLO DELL'ATTIVITA' DI UN ENZIMA PREESISTENTE:avviene a
livello post-traduzionale.
2).CONTROLLO DELLA QUANTITA' SINTETITTATA (presenza o assenza di un
enzima):avviene a livello della trascrizione (quando si produce
l'm-RNA) o di traduzione (se l'm-RNA viene o no tradotto in proteina).
L'INIBIZIONE DA FEEDBACK
Uno dei meccanismi principali di controllo dell'attivita' enzimatica
e' L'INIBIZIONE DA FEEDBACK o RETROAZIONE.In tale processo non appena
nella cellula viene sintetizzato il prodotto finale di una via
biosintetica,la sua ulteriore sintesi viene autoinibita.Non appena il
prodotto finale si esaurisce la sintesi di quest'ultimo puo'riprendere
ENZIMI ALLOSTERICI,possiedono due siti di legame:
1).SITO ATTIVO:dove si lega il substrato
2).SITO ALLOSTERICO:dove l'inibitore si lega in modo reversibile o
irreversibile modificando la conformazione
dell'enzima di modo
che il substrato non riesce piu' a legarsi
efficacemente al sito attivo.L'enzima perde cosi'
la sua attivita' catalitica.
81
Alcune vie biosintetiche sono regolate da ISOENZIMI,enzimi che
catalizzano la stessa reazione ma sono soggetti a sistemi di
regolazione diversi.A differenza del sistema di inibizione da
feedback,dove gli inibitori bloccano completamente l'attivita'
catalitica degli enzimi,in questo caso l'attivita' enzimatica iniziale
diminuisce gradualmente.
LA MODIFICAZIONE DEGLI ENZIMI
Gli enzimi possono essere regolati per addizione o delezione di piccole
molecole organiche.Come per le proteine allosteriche il legame
covalente del gruppo modificante provoca un cambiamento della struttura
della proteina e puo' alterare la sua attivita' catalitica.La
rimozione del gruppo modificante ripristina l'enzima nella sua forma
attiva.Le piu' interessanti modificazioni sono quelle indotte da un
legame con un AMP,un ADP,l'aggiunta di un gruppo fosfato e la
metilazione.Uno degli esempi di enzima allosterico regolato da aggiunta
di AMP e'costituito dalla GLUTAMINA-SINTETASI (GS):
Quando le cellule sono cresciute in un terreno ricco di azoto,la GS
viene modificata tramite l'aggiunta di AMP (adenilazione) per mezzo di
un legame covalente.Possono essere aggiunte fino a 12 AMP:una per ogni
subunita' costitutiva della glutamina-sintetasi.Le subunita' adenilate
sono inattive.Quando il tereno diventa povero di azoto i gruppi AMP
sono rimossi e gli enzimi ripristinano la loro forma attiva.Si produce
alla fine ADP.
INTERAZIONE DELLE PROTEINE CON GLI ACIDI NUCLEICI;possono
essere:
ASPECIFICHE:se la proteina si lega ovunque lungo la molecola di DNA.
SPECIFICHE:se la proteina ha una interazione con una specifica
sequenza del DNA.
STRUTTURE DELLE PROTEINE CHE SI LEGANO AL DNA
1).ELICA-GIRO-ELICA (elix-turn-elix):E'costituita da una sequenza di
aminoacidi in grado di formare una struttura ad alfa elica (elica di
riconoscimento che interagisce con il DNA),unita a una sequenza di tre
aminoacidi,il primo dei quali e'la GLICINA,che ha la funzione di girare
la proteina e curvarla in modo da farle assumere una struttura a
gomito.L'altra estremita' del gomito e' collegata a una seconda elica
che stabilizza la prima interagendo idrofobicamente e formando il
DIMERO.Proteine con questa struttura (legami a idrogeno tra le basi del
DNA e la proteina) si legano al dna per regolare la trascrizione.
2).DITO DI ZINCO (zinc-finger):Si trova frequentemente negli
eucarioti,piu' precisamente nelle proteine regolatrici (che alterano il
funzionamento dei geni).E' una particolare substruttura della proteina
che lega uno ione zinco (Zn++).Gli aminoacidi che costituiscono il dito
formano un'alfa-elica che si lega in corrispondenza del solco maggiore
del dna.
82
3).CERNIERA DI LEUCINE (leucine-zipper):Non interagisce col dna ma
serve a tenere unite le altre due alfa-eliche di modo che queste ultime
si trovino nella posizione corretta
IL CONTROLLO NEGATIVO DELLA TRASCRIZIONE
E' un tipo di controllo il cui meccanismo regolativo determina
l'arresto della trascrizione.I meccanismi per il controllo della
sintesi di un enzima sono ampliamente influenzati dall'ambiente in cui
il microrganismo cresce.
I processi di REPRESSIONE E INDUZIONE sono le
forme piu' semplici di controllo dell'espressione genica a livello della
trascrizione.
REPRESSIONE:mediata da un repressore,l'enzima specifico per un prodotto
finale non viene sintetizzato se questo e' gia' presente
nella cellula (FEEDBACK).
INDUZIONE:mediata da un induttore,si ha la sintesi di un particolare
enzima solo quando e' presente il suo substrato.
Entrambi questi meccanismi permettono all'organismo di non sprecare
energia per la sintesi di enzimi non necessari,fintantoche' non sono
necessari.
EFFETTORI si dividono in:REPRESSORE (reprime la sintesi di un enzima).
INDUTTORE (favorisce la sintesi di un enzima).
PROMOTORE:Sito lungo il dna dove si lega l'rna-polimerasi per dare
inizio alla trascrizione.
OPERONE:Gruppo di geni posto sotto il controllo dello stesso
promotore,che ne regola l'espressione.
REGIONE OPERATORE:Regione del dna che contiene l'operone.
PROCESSO DI REPRESSIONE ENZIMATICA
La trascrizione dell'operone puo' avvenire solo se il repressore non e' in
grado di legare l'operatore.Dopo che il COREPRESSORE (piccola
molecola) si e' legato al suo repressore,quest'ultimo puo' legarsi
all'operone bloccando la trascrizione dell'm-RNA,di conseguenza la
proteina codificata da quell'rna messaggero non verra' prodotta.
83
PROCESSO DI INDUZIONE DI UN ENZIMA
Costituisce l'opposto del processo di repressione.
In assenza di un INDUTTORE un repressore si lega all'operatore
e blocca l'azione della rna-polimerasi,impedendo cosi'
la trascrizione dell'm-RNA e la successiva sintesi della
proteina da esso codificata.
Nel processo di induzione una molecola di INDUTTORE si lega al
repressore e lo inattiva in modo che esso non possa piu' legarsi
all'operatore.La trascrizione mediata dall'rna-polimerasi avanza e si
forma l'rna messaggero di quell'operone.
IL CONTROLLO POSITIVO DELLA TRASCRIZIONE
Nel controllo positivo della trascrizione una proteina regolatrice
promuove il legame dell'rna-polimerasi,facilitando quindi un aumento
della sintesi dell'rna messaggero.
IL REGULONE MALTOSIO
La sintesi degli enzimi per l'utilizzo del maltosio e' controllata a
livello della trascrizione da una proteina attivatrice che controlla
piu' di un operone.Il regulone e' il complesso di diversi operoni che si
trovano sotto il controllo primario della stessa proteina.
CONTROLLO POSITIVO DELL'INDUZIONE DI UN ENZIMA
In assenza dell'induttore ne' la proteina attivatrice ne'
l'rna-polimerasi possono legarsi al DNA.In questo processo una molecola
di induttore si lega alla proteina attivatrice,la quale a sua volta puo'
quindi legarsi al DNA.Cio' permette all'rna-polimerasi di legarsi
al promotore e iniziare la trascrizione.Nel caso del regulone maltosio
l'attivatore sara'la proteina attivatrice del maltosio e l'induttore
sara'lo zucchero maltosio.(il lattosio nel caso dell'operone-LAC).
I MECCANISMI DI REGOLAZIONE CHE RISPONDONO A SEGNALI AMBIENTALI
SONO DEFINITI SITEMI DI CONTROLLO GLOBALE.Tra questi troviamo:la
repressione da catabolita.
LA REPRESSIONE DA CATABOLITA
E' stata anche definita EFFETTO GLUCOSIO poiche' questa e' stata la
prima molecola per la quale si e' osservato tale fenomeno.La repressione
da catabolita permette all'organismo di utilizzare inizialmente le fonti
di carbonio e di energia piu' facili da metabolizzare.Una conseguenza di
tale processo e'la CRESCITA DIAUXICA.In essa si osserva una fase
stazionaria che segue a una fase esponenziale e subito dopo una fase di
latenza nella quale il microrganismo sintetizza gli enzimi per il nuovo
metabolita.Alla fase di latenza segue una nuova fase esponenziale in cui
il tempo di generazione e' minimo.Nella repressione da catabolita l'AMP
sintetizzata dall'enzima adenilato ciclasi a partire da ATP si lega
84
all'attivatore proteico del catabolita (CAP)che si lega successivamente
al DNA a cui si lega alla fine la l'rna-polimerasi che da inizio alla
trascrizione.Fasi della repressione da catabolita sono:
1).SINTESI DELL'AMP A PARTIRE DA ATP PER MEZZO DELLA ADENILATOCICLASI:
adenilato ciclasi
ATP----------------------AMP CICLICO
2).L'ATTIVATORE PROTEICO DEL CATABOLITA SI LEGA ALL'AMP CICLICO:
CAP + AMP CICLICO
3).IL COMPLESSO FORMATO DA CAP E AMP SI LEGA AL DNA:
si lega al
(CAP+AMP)-------------- DNA
+
4).RNA-POLIMERASI SI LEGA AL DNA:
si lega al
RNA-POLIMERASI------------ DNA
+
L'OPERONE LAC:puo' essere controllato sia positivamente che
necativamente,le condizioni necessarie affinche' avvenga
la trascrizione sono:
1).Il livello di AMP-ciclico deve essere sufficiente a permettere alla
proteina CAP di legarsi al DNA (fase3).CONTROLLO POSITIVO.
2).Deve essere presente un induttore che blocchi il repressore non
permettendogli di legarsi all'operatore.CONTROLLO NEGATIVO.
85
L'ATTENUAZIONE
Nell'attenuazione della trascrizione (operone triptofano) il controllo
avviene dopo l'inizio della sintesi dell'rna ma prima che questa sia
completata.
FATTORI SIGMA ALTERNATIVI
I geni che sono indotti in seguito a brusco innalzamento termico (heat
shock) hanno promotori con una sequenza diversa e per
riconoscerli,l'rna-polimerasi ha bisogno di un fattore sigma diverso.La
risposta allo shock termico e' regolata dalla quantita' di questo
FATTORE SIGMA ALTERNATIVO.In E.coli una particolare chaperonina,la
proteina DNA-k viene utilizzata in risposta allo shock termico.Questa
proteina agevola il ripiegamento di altre proteine proteggendole dalla
denaturazione e consente la crescita a ogni temperatura tra i 15 e i
45øC.
QUORUM SENSING:E' una risposta globale che porta all'espressione di un
gran numero di geni,quando la densita' della popolazione diventa
sufficientemente elevata.
ACIDI NUCLEICI ANTISENSO possono appaiarsi a un m-RNA e costituendo una
doppia elica,possono impedire la traduzione.Sono meccanismi di
regolazione dell'espressione genica.Il filamento antisenso procede in
direzione opposta a quella dell'm-RNA a cui si lega.Cio' non permette
all'm-RNA di procedere alla traduzione.
86
TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE
Utilizzando la tecnologia del dna ricombinante i genetisti possono creare
nuovi genotipi,impresa impossibile con l'utilizzo delle tecniche
genetiche tradizionali.
GLI ENZIMI DI RESTRIZIONE SONO UTILIZZATI PER PRODURRE DNA
RICOMBINANTE
Questi enzimi tagliano il dna all'interno o vicino a delle sequenze di
riconoscimento in modo asimmetrico lasciando le estremita' coesive.I
filamenti sono complementari e possono quindi appaiarsi tra loro e
ricongiungersi per azione delle DNA-LIGASI.Queste estremita' possono
altresi'unirsi con altri segmenti di dna di provenienza differente,che
siano state tagliate con lo stesso enzima di restrizione e che abbiano
quindi le stesse estremita' coesive.Questa proprieta' rende possibile un
numero di ricombinazioni del materiale genetico, praticamente illimitato
dato che la capacita' di ricombinazione dei frammenti e' indipendente
dalla loro origine.
CLONAZIONE DEL DNA
Se una cellula batterica contenente un plasmide ricombinante,si sviluppa
e si divide,formando colonie di milioni di cellule,ogni cellula
conterra'lo stesso plasmide ricombinante con lo stesso inserto di
dna. Questo processo attraverso il quale si ottengono numerosi frammenti
di dna identici,a partire una singola molecola di dna e' definita CLONAZIONE
DEL DNA:
TRASCRITTASI INVERSA E c-DNA
Il c-DNA e' un dna a singolo filamento ottenuto per retrotrascrizione
dall'enzima trascrittasi inversa.Questo enzima caratteristico dei
retrovirus,catalizza la formazione del c-DNA a singolo filamento a
partire da un rna messaggero maturo. Per retrotrascrizione un filamento
di rna messaggero fa da stampo per la sintesi di dna.Utilizzando la
trascrittasi inversa si ottiene il c-dna. Questo tipo di dna complementare
all'rna messaggero utilizzato come stampo e' diverso dal dna genomico.Esso
infatti non esiste in natura ed e' costituito dalla somma delle sequenze
codificanti (ESONI).Il c-dna a singolo filamento viene poi trasformato in dna
a doppio filamento utilizzando la
dna-polimerasi.Nei virus a rna la trascrittasi inversa sintetizza il dna da uno
stampo di rna messaggero.Il dna a doppio filamento viene
inglobato nella cellula ospite per la produzione dei virioni durante
l'endocitosi.Successivamente i virioni vengono rilasciati all'esterno
previa lisi cellulare in seguito al ciclo litico.
87
PCR (REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI)
E' la tecnica che consente di amplificare un frammento di dna in tempi
relativamente brevi (in poche ore si possono ottenere milioni di copie
di un singolo frammento di dna).La procedura si attua aggiungendo un
corto innesco (PRIMER) specifico per ciascuna delle estremita' della
sequenza selezionata.Si separano i due filamenti della doppia elica ed
esponendoli a una DNA-POLIMERASI resistente al calore (la taq
polimerasi).Se il dna viene riscaldato i ponti a idrogeno che legano le
due eliche si rompono e le due eliche si separano,la struttura
tridimenzionale viene persa e la molecola di dna si dice
denaturata.Nella PCR entrambi i filamenti vengono copiati
simultaneamente e la procedura e' ripetuta piu' volte.
La taq-polimerasi si ottiene dal batterio THERMUS ACQUATICUS che vive
nelle sorgenti calde quindi non viene denaturata da temperature
utilizzate per il dna.E' un termofilo estremo e resiste a temperature
superiori ai 113øC.
L'ELETTROFORESI
Puo' essre utilizzata per separare frammenti di dna.Durante un
elettroforesi il campo elettrico generato,separa le molecole sia per
carica sia per massa e per lunghezza.Le molecole piu' piccole si muovono
piu' velocemente di quelle piu' grandi.Una miscela di frammenti di dna
di lunghezze differenti puo' facilmente essere separata sulla base delle
dimensioni.Il gel di agarosio viene suddiviso in sezioni e i frammenti
separati e purificati vengono eluiti dal gel.Questo procedimento di
separazione e' importante nello studio e nell'applicazione del dna
ricombinante.
L'IBRIDAZIONE DNA-DNA
Per localizzare frammenti di dna da modificare o ricombinare si utilizza
la tecnica dell'ibridazione DNA-DNA.
Raffreddando lentamente il DNA riscaldato si riformano i legami a
idrogeno tra le basi complementari,tale processo permette la formazione
di molercole ibride provenienti da fonti diverse.In sintesi
l'ibridazione e' il processo che porta alla costruzione artificiale di
una doppia elica di dna (o di rna) per appaiamento di due diversi
frammenti provenienti dai due filamenti a singola elica,di provenienza
differente,che contengono basi complementari tra loro.E' una tecnica
molto usata anche per lo studio delle similitudini del corredo genetico
e per l'identificazione di una determinata specie e delle somigianze che
essa puo' avere con un'altra dal punto di vista genotipico ed evolutivo.I
nuovi dna che i genetisti ottengono con questa tecnica sono utilizzati
per studiare possibili mutazioni e ottenere altresi'un nuovo
individuo,generato da due progenitori che trasmettono nel suo genoma
l'informazione genetica.
88
SONDE DI ACIDO NUCLEICO
Una sonda di acido nucleico puo' essere preparata incorporando un
isotopo radioattivo in un corto segmento di DNA o RNA a singolo
filamento,che sia complementare alla sequenza nucleotidica di
interesse.Per identificare il gene che codifica per un enzima
specifico,se la sequenza nucleotidica di quel gene e' nota,il
ricercatore puo' preparare un corto filamento di DNA,marcato con
radioattivo,complementare alla sequenza di dna necessaria alla
produzione dell'enzima.La sonda marcata puo' essere individuata su
lastra fotografica.In alternativa la sonda puo' essere marcata con
colorante fluorescente.Puo'essere utilizzata per cercare segmenti di DNA
o RNA che contengano una sequenza nucleotidica complementare.
MOLECOLE DI RNA MARCATE SONO UTILIZZATE ABITUALMENTE PER
TROVARE
FRAMMENTI DI DNA CORRISPONDENTI O VICEVERSA
La sonda puo' essere una molecola di m-RNA.un frammento di dna generato
da enzimi di restrizione,c-DNA sintetizzati dalla trascrittasi inversa o
sequenze nucleotidiche sintetizzate in laboratorio.
89
EREDITA' E GENI
I geni contengono i caratteri ereditari.All'espressione
di un particolare gene consegue la manifestazione fenotipica di uno o
piu' caratteri codificati dal gene stesso.
AMBIENTE ED EVOLUZIONE
Si definisce evoluzione ogni cosa che cambia in un organismo,il quale
acquisisce nuove caratteristiche che non aveva precedentemente.
L'evoluzione e' la conseguenza diretta di ogni mutazione,la quale
puo' risultare favorevole alla sopravvivenza del microrganismo in un
particolare ambiente;in tal caso viene conservata poiche' l'organismo
sopravviva.Essa tuttavia puo' essere anche negativa,se non conferisce
al microrganismo caratteristiche utili alla sua sopravvivenza,nel
determinato ambiente in cui esso vive;in tal caso la selezione elimina
tale mutazione.
L'evoluzione dunque e' strettamente dipendente dall'ambiente e si
adatta ad esso.L'ambiente stesso seleziona le caratteristiche
necessarie a un organismo per sopravvivere.Gli organismi che non
possiedono tali caratteristiche sono eliminati da quell'ambiente
tramite la SELEZIONE NATURALE.Ad esempio:i microrganismi si
differenziarono in procarioti ed eucarioti.Questi ultimi sono molto piu'
evoluti,ma derivano dai procarioti con i quali si ipotizza fossero in
simbiosi.La differenziazione tra procarioti ed eucarioti e' frutto
di una evoluzione.Le giraffe hanno sviluppato un lungo collo che ha
permesso loro di raggiungere le cime degli alberi e nutrirsi.Questa
caratteristica,comune allo stato attuale,non era in un primo tempo
presente in tutti gli esemplari di questa specie.Per adattarsi
all'ambiente alcuni esemplari mutati conservarono la mutazione
in modo da poter sopravvivere,altri che non possedevano questa
peculiare caratteristica,poiche' non avevano subito una
mutazione del loro DNA,non riuscirono a nutrirsi e in breve
tempo si estinsero.Quest'ultimo e' un esempio eclatante di come
l'ambiente sia legato all'evoluzione e di quanto quest'ultima sia da
esso condizionata.
Castagna Luciano
Bibliografia
BROCK:biologia dei microrganismi
90
Batteriologia
speciale
Luciano Castagna
Marrancone Mattia
9/04/2008
Principali batteri di interesse alimentare
91
92
PRINCIPALI BATTERI DI INTERESSE
ALIMENTARE
CAMPILOBACTER
Microaerofilo
Asporigeno
Spiraliforme
Mobile per flagelli lofotrichi
Ossidasi positivo
Mesofilo
Neutrofilo
Alta A.w:0,98
Si trova nel tratto intestinale
degli animali da carne,soprattutto
pollame.
Coltivato su terreno complesso e
isolato tramite utilizzo di Giara
Con Candela.
Specie patogene:c.jejuni
c.fetus
c.coli
responsabili di campilobatteriosi ,mastiti e aborto.
93
BRUCELLA
Gram negativo
Aerobio obbligato
Asporigeno
Morfologia coccoidale o
bastoncellare
Immobile
Catalasi positivo
Psicrotrofo
Neutrofilo
a.w=0.90
Agente infettivo presente nel
latte (enterico)Coltivato su agar
sangue isolato tramite atmosfera
controllata per mezzo di
incubatori a CO2:(CO2 al 510%).Necessita di terreni
addizionati di sangue bovino o
equino (5-10%) per lo sviluppo.
Specie patogene:b.melitensis
Provoca brucellosi
94
LEGIONELLA
Gram negativo
Aerobio obbligato
Asporigeno
Morfologia bastoncellare
Mobile per flagelli
Bassi livelli di catalasi e ossidasi
Mesofilo
Neutrofilo
A.w elevata
Si trova nelle vie aeree.Agente
infettivo presente nelle acque
naturali e artificiali. Esigente dal
punto di vista
nutrizionale:Coltivato su terreno
complesso
arricchito con sali di ferro.
Richiede
atmosfera con 2,5% di CO2.
Specie patogene:l.pneumophila
l.micdadei
provocano legionellosi.
95
PSEUDOMONAS
Gram negativo
Aerobio obbligato
Asporigeno
Morfologia bastoncellare
Mobile per flagelli polari
Respiratorio
Catalasi e ossidasi positivo
Psicrotrofo
Neutrofilo
A.w elevata:0,94
Enterico,presente nelle vie
aeree,acqua non potabile,suolo e
feci. Coltivabile sui comuni terreni
di coltura:(agar
standard,terreno complesso).
Specie patogene:p.aeruginosa
Provoca disturbi intestinali e
polmonite.
96
AEROMONAS (Vibrionaceae)
Gram negativo
Anaerobio facoltativo
Asporigeno
Morfologia bastoncellare
Mobile per flagelli polari
Catalasi e ossidasi positivo
Mesofilo
Neutrofilo
A.w elevata:0.95
Enterico,presente nelle acque e
nel suolo:Coltivabile sui comuni
terreni di coltura.
SPECIE
PATOGENE:A.HYDROPHILA:
PROVOCA DIARREA,SETTICEMIE E
TOSSICOINFEZIONI ALIMENTARE.
NEI PESCI PUO’ PORTARE AD
ALCUNE PATOLOGIE.
97
PLESIOMONAS (Vibrionaceae)
Gram negativo
Anaerobio facoltativo
Asporigeno
Morfologia bastoncellare
Mobile per flagelli polari
Ossidasi positivo
Mesofilo
Neutrofilo
SPECIE PATOGENA:P.shigelloides
Enterico presente in acqua
contaminata,molluschi e
crostacei. Coltivabile sui comuni
terreni colturali.
98
VIBRIO (Vibrionaceae)
Gram negativo
Anaerobio facoltativo
Alotollerante:concentrazione di
NaCl 2-4%
Asporigeno
Morfologia bastoncellare
Mobile per flagelli polari o
peritrichi a
seconda della specie
Fermentativo
Ossidasi negativo
Mesofilo
Neutrofilo
A.w intermedia:0.86
Enterico,presente nelle acque
contaminate e
nel pesce crudo.Cresce sui comuni
terreni
colturali.Per l'isolamento si
usano terreni
selettivi a Ph alcalino
specie patogene:v.colerae
v.paraemoliticus
99
RICKETSIAE
Gram negativi
Aerobi obbligati
Asporigeno
Morfologia coccoidale
o bastoncellare
Repiratori (ossidano Glutammato e
Glutamina)
Immobili
Temperatura,Ph e A.w dipedono
dall'organismo ospite.
BATTERI
INTRACELLULARI OBBLIGATI
Coltivati su armadilli,che hanno
temperatura corporea inferiore ai
mammiferi domestici
100
CLAMIDIaE
Gram negativi
Aerobi obbligati
Asporigeni
Morfologia coccoidale
Respiratori
Immobili
Temperatura,Ph e A.w dipendono
dall'organismo ospite.
BATTERI INTRACELLULARI
OBBLIGATI
Coltivati su armadilli,che hanno
temperatura corporea inferiore
ai mammiferi domestici.
101
SHIGELLA (Enterobacteriaceae)
Gram negativo
Anaerobio facoltativo
Asporigeno
Morfologia coccobacillare o
bastoncellare
Immobile
Catalasi e ossidasi negativo
Mesofilo
Neutrofilo
Enterico,provoca contaminazione
fecale di
acqua e cibo. Isolabile da feci
tramite utilizzo di brodo selenite.
102
YERSINIA (Enterobacteriaceae)
Gram negativo
Anaerobio facoltativo
Asporigeno
Morfologia bastoncellare
Mobile per flagelli peritrichi
Catalasi positivo
Ossidasi negativo
Glucosio fermentante
Psicrotrofo(resiste in regime di
refrigerazione)
Neutrofilo
A.w elevata:0,95
SPECIE PATOGENA:Y.pestis
Enterico presente nel latte
crudo non pastorizzato.
Specie patogene:y.pestis
y.enterocolitica
causano peste bubbonica e diarrea
cronica.
103
ESHERICHIA (Enterobacteriaceae)
Gram negativo
Anaerobio facoltativo
Asporigeno
Morfologia bastoncellare
Mobile per flagelli peritrichi
Catalasi positivo
Ossidasi negativo
Lattosio fermentante
Mesofilo
Neutrofilo
A.w elevata:0,93
SPECIE PATOGENE:E.coli enteroemorragico
Enterotossigeno
(verocitotossico):resiste a pH 4.6
enteropatogeno
Presente nel tratto intestinale degli animali a
sangue caldo.Coltivato su Agar Mc
conkay selettivo per E.coli e differenziale
rispetto agli altri coliformi,o su VRBA
104
SALMONELLA
(Enterobacteriaceae)
Gram negativo
Anaerobio facoltativo
Asporigeno
Morfologia bastoncellare
Alcuni ceppi mobili per flagelli peritrichi
Catalasi positivo
Ossidasi negativo
Mannitolo fermentante
xilosio fermentante
LATTOSIO NONFERMENTANTE(tranne alcuni
ceppi)
Mesofilo
Neutrofilo
A.w elevata:0,93
SPECIE PATOGENE:S.tiphy
S.paratiphy
S.tiphimurium
Enterico,colpisce soprattutto i polli ed e'
trasmissibile all'uomo attraverso le
uova. Differenziabile dagli altri coliformi
tramite Agar Mc conkay (non ferementa il
lattosio).Isolabile da feci tramite Brodo
Selenite e da campioni alimentari tramite
BGA (agar verde brillante),che contiene
gli stessi indicatori del MC Conkay e
differenzia ceppi lattosio fermentanti
da quelli lattosio non fermentanti.
105
ENTEROBACTER
(Enterobacteriaceae)
Gram negativo
Anaerobio facoltativo
Asporigeno
Morfologia bastoncellare
Immobile
Ossidasi negativo
(produce Butandiolo)
Mesofilo
Neutrofilo
A.w elevata:0,93
Enterico,presente in acque e
fogne. Coltivabile sui normali
terreni colturali
Specie patogene:e.aerogenes
Causa mastite nei bovini e
numerose affezioni nell’uomo.
106
LISTERIA
Gram positivo
Anaerobio facoltativo
Asporigeno
Morfologia coccobacillare
(forma catene di 3-5 cellule)
Mobile per flagelli peritrichi
Catalasi e ossidasi positivo
Fermentativo (produce acido lattico)
Mesofilo (alcuni ceppi sono psicrotrofi)
E resistono a temperature di
refrigerazione
Neutrofilo ma tollera ambiente acido e alte
concentrazioni di sale.
A.w. elevata:0,93-0,99
Resiste a nitrati e nitriti
SPECIE PATOGENE:L monocitogenes
(causa aborto)
Si trova all'interno della cellula,nel
latte non pastorizzato,acqua,carne
cruda,terreno,formaggi molli e verdura
cruda. Coltivato su agar nutritivo o Agar
sangue con CO2 al 10%.
L. monocytogenes produce biofilm ed e'
isolabile tramite ALOA(terreno selettivo)
107
STREPTOCOCCUS
Gram positivo
Anaerobio obbligato o
facoltativo
Asporigeno
Morfologia coccoidale disposta in
catene
Immobile
Catalasi negativo
Fermentativo
(produce acido lattico)
Mesofilo
Neutrofilo
A.w elevata
SPECIE PATOGENE:
S.mutans (carie)
S.pneumoniae (polmonite) S.sanguis
(placca)
Presente nel siero del latte e di
altri prodotti fermentati.
Coltivabile sui comuni terreni di
coltura.
108
ENTEROCOCCUS
Gram positivo
Anaerobio facoltativo
Asporigeno
Morfologia coccoidale
Immobile
Catalasi e ossidasi negativo
(idrolizza l'esculina)
ESCULINA+H2O=ESCULENTINA+F
e++=annerimento
Alcalofilo:pH 9,6
Temperatura 10-45øC
Alotollerante:concentrazione di
NaCl 6,5%
A.w elevata:0,92
Si trova nel tratto intestinale,nel
suolo e
nelle acque superficiali.
Coltivati su agar sangue.
Specie patogene:e.faecalis
e.faecium
e.durans
causano endocarditi ed infezioni
urinarie nell’uomo.
109
STAPHILOCOCCUS
Gram positivo
Aerobio obbligato o Anaerobio facoltativo
Asporigeno
Morfologia coccoidale disposta a grappolo
Immobile
Respiratorio
Catalasi positivo
Alcune specie
sono alotolleranti (NaCl al 10%)
Temperatura 18-40øC
pH ottimale Neutro
A.w elevata:0,90
Inibito da vangomicina
SPECIE PATOGENE:S.aureus (coagulasi e
termonucleasi positivo)
S.epidermis
Si trova in pelle,vie respiratorie,carne
panna,uova e pollame.Coltivati su terreno
selettivo:Mannitol Salt Agar (MSA),che
consente la crescita solo agli
staphilococchi.Coltivati anche su terreno
differenziale:Baird Parcker,che consente di
differenziare S.aureus.(e' anche selettivo)
110
MYCOBACTERIUM
Gram positivo
Aerobio obbligato
Asporigeno
Morfologia bastoncellare
Immobile
Catalasi positivo/Ossidasi
negativo
Mesofilo
pH neutro
SPECIE PATOGENE:M.tuberculosis
M.leprae
M.ulcerans
Si trova nelle vie aeree e nelle
goccioline del secreto
bronchiale.Coltivato in terreno
di Sabourand,selettivo per lieviti e
muffe.Per isolare M.tuberculosis
si utilizza un preparato a becco di
clarino.
111
BACILLUS
Gram positivo
Aerobio o Anaerobio facoltativo
Sporigeno
Morfologia bastoncellare
Immobile
Respiratorio
Catalasi e Ossidasi positivo
Mesofilo
pH da 4.9 a 9.3
A.w elevata
SPECIE PATOGENE:B.antracis
(capsulato)
B.cereus
Si trova su terreno,intestino e vie
respiratorie. Coltivato su agar
nutritivo.
112
CLOSTRIDIUM
Gram positivo
Anaerobio Stretto (C.botulinum)
Sporigeno
Morfologia bastoncellare
Immobile o mobile per ciglia peritriche
Fermentativo
Catalasi negativo
Mesofilo
Neutrofilo
Inibito all'8% di NaCl e dai nitriti
Produce tossine (C.botulinum)
SPECIE PATOGENE:C.botulinum
C.tetani
C.perfringens (capsulato)
Si trova nel terreno e
nell'intestino.Coltivato e
manipolato tramite terreni
per anaerobi:CDC (Anaerobe Blood Agar)
Cary Blair Medium:per il
trasporto di
anaerobi
Giara da anaerobiosi
Camera da anaerobiosi
113
Lactobacillus (lab)
Gram positivo
Anaerobio facoltativo
Asporigeno
Morfologia bastoncellare
Immobile
Catalasi e ossidasi negativo
Fermentativo
(produce acido lattico)
Mesofilo
Resistente a pH acido
(acidofilo):Ph 4
A.w elevata:0,92
Tollera, come tutti i batteri
lattici, condizioni avverse a molti
altri microrganismi.
SPECIE PATOGENE:L.acidofilus
L.casei
Si trova nella mucosa
genitale,latte e derivati. Coltivato
su terreni
selettivi(MRS)
114
BATTERI SPORIGENI
PARTICOLARI
1).Coxiella Burnetii:Gram
negativo
2).Aliciclobacillus
Acidoterrestris:Ph<4
(nelle conserve di
pomodoro e nel the in
bottiglia)
3).Bacillus
Termoacidurans:ph<4,2
(frutta e succhi di frutta)
115
BATTERI LATTICI
Sono gram positivi,asporgeni,con morfologia coccacea o
bastocellare,microaerofili o anaerobi facoltativi.Generalmente immobili
anche se alcune specie sono mobili per la presenza di flagelli
peritrichi.Catalasi e ossidasi negativi.Fermentano il glucosio con
produzione di acido lattico.Isolati su MRS selettivo per i LAB.
Si dividono in:
1).OMOFERMENTANTI OBBLIGATI (termobatteri):producono solo lattato.
2).ETEROFERMENTANTI FACOLTATIVI (LB plantarium e LB casei):possono
produrre lattato e acetato.
3).ETEROFERMENTANTI OBBLIGATI (LB brevis e LB fermentum):producono
obbligatoriamente sia lattato sia
acetato in due vie metaboliche differenti
e contemporanee.
Caratteristiche dei batteri lattici sono:
1).Elevata concentrazione di glucidi e vitamine
2).Bassi tenori di ossigeno
3).Tolleranza a zuccheri,sale e pH acido (pH ottimale=4)
4).Temperatura di crescita tra 4 e 45øC (L.termophilus da 30øC a 63øC)
Nutrienti necessari:CARBONIO (glucidi)
AZOTO ORGANICO (aminoacidi e peptidi)
SALI MINERALI (fosfati,solfati,Ca,Mg,K)
FATTORI DI CRESCITA (vitamine B)
116
CLASSIFICAZIONE DEI LAB
I lab si dividono in:LACTOCOCCUS omofermentanti (catene di cocchi)
LEUCONOSTOC eterofermentanti (cocchi)
PEDIOCOCCUS omofermentanti (cocchi)
LACTOBACILLUS omo/eterofermentanti (bacilli)
STREPTOBACILLUS omofermentanti (bacilli)
N.B
I batteri lattici ETEROFERMENTANTI producono sia Lattato sia Acetato
quelli OMOFERMENTANTI producono solo Lattato.
BATTERIOCINE:Peptidi o proteine che esercitano azione antagonista nei
confronti di determinate specie microbiche (provocano
lisi).Sono potenzialmente utilizzabili come additivi
alimentari e sono prodotte dai batteri lattici.
STARTER (colture microbiche di avviamento):Colture di microrganismi
che,aggiunte al prodtto alimentare in una fase del processo
produttivo,promuovono e guidano lo sviluppo di fermentazioni
e trasformazioni caratteristiche del prodotto.
117
PRINCIPALI MICRORGANISMI PATOGENI PER L'UOMO
MYCOBACTERIUM
TUBERCULOSIS
Tubercolosi
LISTERIA
MONOCYTOGENES
Listeriosi (aborto)
CLOSTRIDIUM BOTULINUM
Botulismo.(tossina botulunica)
Usata in chirugia estetica.
Provoca paralisi dei muscoli e
distenzione cutanea,nella regione
perioculare,Inibitore della sudorazione se
iniettata nella regione ascellare.
CLOSTRIDIUM TETANI
Tetano
CLOSTRIDIUM
PERFRINGENS
Gangrena gassosa e tossicoinfezioni
alimentari (capsulato)
BACILLUS ANTRACIS
Carbonchio ematico
STREPTOCOCCUS MUTANS
Carie dentaria
STREPTOCOCCUS
PNEUMONIAE
STREPTOCOCCUS SANGUIS
Polmoniti,setticemie meningiti (capsulato)
KLEBSIELLA PNEUMONIAE
Polmonite
HAEMOPHILUS
INFLUENZAE
Meningite
TREPONEMA PALLIDUM
Sifilide
BORRELIA BURGDORFERI
Malattia di Lyme
(provoca rush cutaneo,disturbi neurologici e
disturbi cardiaci)
NEISSERIA GONORREAE
ESHERICHIA COLI
GONORREA
Colite (infiammazione del colon)
SALMONELLA THIPHI
SALMONELLA PARATHIPHI
SALMONELLA THIPHIMURIUM
TIFO/SALMONELLOSI
PARATIFO/SALMONELLOSI
SALMONELLOSI
Placca dentaria
118
I diversi ceppi di
salmonella causano
Salmonellosi,
caratterizzata da
infiammazione
dell'apparato digerente
oltre che
aborti,setticemie,mening
oencefaliti,mastiti e
broncopolmoniti.
119
Antibiotico-resistenza delle principali specie batteriche
Specie batterica
campylobacter
Brucella
resistenza
Penicillina,ampicillina
-
Legionella
-
Pseudomonas
Molti antibiotici,per
definire la sensibilità
si ricorre a un
antibiogramma
Escherichia
-
Salmonella
-
yersinia
-
enterobacter
-
shigella
aeromonas
-
120
sensibilità
Cefalotina,
acido Nalidixico
Tetracicline,
Streptomicina
Eritromicina
Tetracicline
Imipenem
Ciprofloxacina
Carbenicillina
Ticarcillina
Imipenem
Gentamicina
Tobramicina
Sisomicina
Amikacina
Netilmicina
Cloramfenicolo
kanamicina
Gentamicina
Trobamicina
Amikacina
Netilmicina
Ciprofloxacina
Ofloxacina
Pefloxacina
enoxacina
Ampicillina
Amoxicillina
Cefalotina
Kanamicina
Streptomicina
Gentamicina
Apramicina
Amikacina
Tetracicline
sulfametazolo
Streptomicina
Cloramfenicolo
tetracicline
Carbenicillina
Betalammine,aminoglicosidi
Ureidopenicilline
Cefalosporine
Aminoglicosidi
Cloramfenicolo
tetraciclina
plesiomonas
Vibrio
Cefalosporine
Polimixine
Tetracicline (la
sensibilità a questi
antibiotici è
incostante e dei ceppi
possono sviluppare
una resistenza)
Tetraciclina
(pochissime eccezioni)
rikcettsiae
-
chlamydiae
Streptomicina
Gentamicina
Vancomicina
micostatina
streptococcus
-
enterococcus
staphylococcus
Penicillina
Meticillina
Nafcillina
Oxacillina
Cefalosporine
Tetracicline
Eritromicina
Lincomicina
Kanamicina
Gentamicina(variabile)
Polimixine
Acido nalidixico
-
Aminoglicosidi
Acido nalidixico
Nitrofurantoina
Cloramfenicolo
Cefalosporine
Polimixine
tetracicline
Tetracicline
Cloramfenicolo
Gentamicina
Acido nalidixico
Cloramfenicolo
tetracicline
Cloramfenicolo
Tetracicline
Rifamicina
Sulfamidici
Tilosina
Acido nalidixico
Penicillina
Betalattamine
Cefalosporina
In alternativa :
macrolidi e lincosamidi
bacillus
clostridium
Alcuni perfringens
resistono na
penicilllina
listeria
-
121
Vancomicina
teicoplanina
B.antracis (penicillina)
Altre specie(tetracicline
Cloramfenicolo
Macrolidi
Sulfamidici)
Cloramfenicolo
Eritromicina
Metronidazolo
Vancomicina
C.difficile
Teicoplanina
Ampicillina
Cloramfenicolo
Eritromicina
Penicillina
Gentamicina
A livello terapeutico (associazione
tra penicillina\streptomicina
Penicillina\sulfamidici)
mycobacterium
-
Batteri lattici
-
Rifampicina
Streptomicina
Tiacetozone
dapsone
-
Castagna Luciano
Marrancone Mattia
Bibliografia
Microbiologia veterinaria
122
