Diapositiva 1

Effettori TAL e la tecnologia TALEN per la
modifica sito-specifica del genoma (genome
editing)
Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv) l’agente
patogeno responsabile della macchiettatura bruna
batterica e maculatura ad alone del peperone e pomodoro
Gli Effettori TAL
Gli Effettori TAL (Transcription activator like effectors,
TALE) vengono iniettati nella cellula della pianta ospite
attraverso la via di secrezione “type III” presente in
numerosi batteri patogeni come Xanthomonas spp.; questi
contribuiscono alla malattia o a scatenare la resistenza
mediante il legame al DNA e attivando geni TALE-specifici
della pianta ospite.
Tipi di secrezione delle proteine nei batteri
Apparato di secrezione di “Type III”
del batterio patogeno Xanthomonas
campestris pv. vesicatoria
Apparato di secrezione “type IV” del
batterio patogeno Agrobacterium
tumefaciens che lo utilizza per
effettuare il trasferimento del T-DNA
alla pianta ospite
Caratteristiche strutturali e funzionali dell’effettore
AvrBs3, il fondatore della famiglia TALE, secreto da
Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv)
I TALEs hanno in comune:
1. Un N-terminus necessario per la secrezione “typeIII” (T3S)
2. Un C-terminus contenente segnali per la localizzazione
nucleare (NLS)
3. Un dominio di attivazione acido tipico dei fattori di
trascrizione (AAD)
4. Una regione centrale formata da ripetizioni quasi perfette
di 33-34 amminoacidi ciascuna, che termina con una
ripetizione tronca di 20 aa
Le diverse ripetizione possono presentare delle variazioni,
tuttavia, il maggior polimorfismo è presente nei residui 12 e 13,
denominati “repeat-variable diresidue” (RVD).
I diversi TALEs possono variare nel numero di ripetizioni
(nell’AvrBs3 sono 17,5)
I TALEs attivano geni TALE-specifici della pianta ospite
(chiamati UPA per “upregulated by AvrBs3”) legandosi ad
elementi conservati nel promotore dei geni target.
•AvrBs3 induce più di 20 geni nel peperone
Il legame al DNA è mediato dalla regione ripetuta
Ciascun RVD (“repeatvariable diresidue”) si
lega ad uno specifico
nucleotide.
Tentative model for TALE–DNA association
Pianta suscettibile
Pianta resistente
Sommario
1. Xanthomonas secerne membri della grande famiglia di effettori TAL che
funzionano da attivatori trascrizionali nelle cellule della pianta. Si localizzano nel
nucleo e modulano l’espressione dei geni della pianta.
2. Nelle piante siscettibili, gli effettori TAL attivano l’espressione dei geni per la
suscettibilità per supportare la virulenza batterica. Nelle piante resistenti, gli
effettori TAL inducono l’espressione dei egni di resistenza, che determinano
l’induzione di specifiche reazioni di difesa.
3. Gli effettori TAL contengono NLSs, che mediano l’ingresso nel nucleo della
cellula vegetale, un AD C-terminal necessario per attivare l’espressione dei geni
della pianta, e un dominio ripetuto centrale che si lega direttamente al DNA.
4. La specificità degli effettori TAL è relegata nel dominio centrale nelle ripetizioni
consecutive. Ciascuna ripetizione riconosce una coppia di basi del DNA. Due
amminoacidi variabili alle posizioni 12 e 13 di ciascuna ripetizione determina il
riconoscimento della coppia di basi del DNA. La disposizione consecutiva delle
ripetizioni si lega ad una consecutiva sequenza di DNA sequence.
Applicazione biotecnologica di queste
conoscenze: la tecnologia TALEN (che
consente modificazioni e silenziamenti
gene-specifici)
•Sin dalla scoperta che una rottura specifica della doppia
elica del DNA (double-strand break , DSB) aumenta la
frequenza del riparo mediato dalla ricombinazione
omologa (Rouet P, Smih F, Jasin M: Expression of a site-specific
endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells. Proc
Natl Acad Sci USA 1994, 91:6064-6068) sono stati effettuati
numerosi tentativi per migliorare l’efficacia e la
specificità delle nucleasi.
Nelle cellule il riparo delle DSB generate dalle nucleasi
viene effettuatp mediante:
1. L’unione non-omologa delle estremità (“non-homologous
end-joining (NHEJ)” che unisce le estremità rotte del
DNA con modalità “error-prone” e quindi può causare la
formazione di brevi delezioni o inserzione nel punto di
rottura;
2. La ricombinazione omologa (“HR-based repair”), nella
quale la DSB è precisamente ricostruita usando una
sequenza omologa come stampo.
NHEJ
HR
•I primi risultati importanti sono stati ottenuti con la
tecnologia del zinc-finger nucleases (ZFNs), ovvero
l’unione del domino di legame al DNA dei fattori di
trascrizione zing-finger ed il dominio catalitico di una
nucleasi (FokI).
(Urnov FD, Rebar EJ, Holmes MC, Zhang HS, Gregory PD:
Genome editing with engineered zinc finger nucleases.
Nat Rev Genet 2010, 11:636-646)
•FokI è una nucleasi di tipo IIS isolata inizialmente dal batterio
Flavobacterium okeanokoites.
•FokI è composta da due domini separati un dominio Nterminale per il legame al DNA (DNAbinding domain) e un
dominio C-terminale per il taglio del DNA (DNA-cleavage
domain).
•Il DNA-binding domain riconosce la sequenza non-palindromica
5’-GGATG-3’ mentre il dominio catalitico taglia la doppia elica
del DNA in modo non specifico ad una distanza di 9 e13
nucleotidi a valle del sito di legame
•FokI è attivo solo come dimero. Si ritiene che per formare un
dimero funzionale, due molecole di FokI si legano ciascuna ad un
sito del DNA e poi dimerizzano in modo che I due domini
nucleasici formano una endonucleasi funzionale che taglia la
doppia elica del DNA al sito specifico.
TALE-TF
FokI endonucleasi
TALENs: Transcription Activator-Like Effector Nucleases
are a novel class of sequence-specific nucleases created by
the fusion of transcription activator-like effectors
(TALEs) to the catalytic domain of an endonuclease.
Gene knock-out
Gene knock-out is defined as the functional disruption of
a gene’s activity.
Gene modification
Gene tagging with an Integration Matrix near a TALEN™
recognition site.
(A) DSB-stimulated HR at the TALEN™ cleaving site; (B) The
gene tag to be integrated is in between the regions of homology.
(C) Successful integration of a gene tag with TALEN™
technology.