CRISOTILO E FIBRE DI LANA DI ROCCIA INDUCONO ABBERRAZIONI CROMOSOMICHE E DANNI AL DNA NELLE CELLULE FIBROBLASTICHE V79 DEI POLMONI Davide Cavaliere Chrysotile and rock wool fibers induce chromosome aberrations and DNA damage in V79 lung fibroblast cells. Yan Cui et al. CRISOTILO • ININFIAMMABILITA’ • RESISTENZA ALLA TRAZIONE • BASSA DENSITA’ • ISOLANTE UTILIZZO NEI SETTORI: • • • • TESSILE CHIMICO MECCANICO EDILE Mg3Si2O5(OH)4 • CINA • RUSSIA • BRASILE • INDIA MATERIALI SOSTITUTIVI: LANA DI ROCCIA LANA DI VETRO FIBRE CERAMICHE PATOLOGIE AMIANTO-CORRELATE FIBROSI POLMONARE ( Asbestosi ) MESOTELIOMA • Pleurico • Peritoneale CARCINOMA POLMONARE 107,000 decessi all’ anno a causa di queste malattie CRISOTILO VS LANA DI ROCCIA SCOPO DEL LAVORO Sostituti artificiali dell’ amianto ( come la lana di roccia ) possono essere genotossici come il crisotilo, visto che la genotossicità è generalmente un prerequisito per lo sviluppo della neoplasia, è stata studiata la relazione tra esposizione al crisotilo e fibre di lana di roccia che può causare abberrazioni cromosomiche MATERIALI: FIBRE DI CRISOTILO: Mangnai (Cina) MANGNAI MIANYANG FIBRE DI LANA DI ROCCIA: Università di scienze e tecnologia di Mianyang (Cina) PREPARAZIONE DELLE FIBRE ULTRAFINI Macinate ulteriormente in un mulino a biglie orizzontale sospese in etanolo Fibre macinate con un mortaio di ceramica Ridotte a 2-3 mm Risultato: polvere 0,2g Messe in incubazione a 150°C per 2h Particelle < 10μm messe nel forno essiccatore Filtrate attraverso un 400 mesh screen COLTURA CELLULARE cellule fibroblastiche V79 del polmone di criceto cinese • Monostrato dentro una fiasca di coltura di 25 cm2 a 37°C • 5% CO2 • atmosfera umidificata A 80-90% di confluenza le cellule sono state staccate con 0,25% di tripsina e portate ad una densità di 0,5-1 x 106 cellule/ml TEST DEI MICRONUCLEI Le cellule in fase di crescita sono state inserite in piastre di coltura ed incubate a 37°C con 5% di CO2 per 24h Dopo l’ adesione cellulare il terreno di coltura è stato sostituito con un terreno contenente sospensioni di fibre • 50 μg/ml • 100 μg/ml • 200 μg/ml Controlli: Negativo: Terreno di coltura normale Positivo: Terreno di coltura con 200 μg/ml di ciclofosfamide Le piastre di coltura sono state incubate per altre 24h Lavaggio con PBS Fissaggio con metanolo ed acido acetico 3:1 per 30 minuti a 4°C Usata la colorazione di Giemsa per 5 minuti Sono state analizzate 1x103 cellule per vetrino ( 3 – 4 vetrini per trattamento )e contato il numero dei micronuclei CONDIZIONI PER I MICRONUCLEI: Dimensione < 1/3 del nucleo principale Dentro il citoplasma %MN = Ben distinti dal nucleo Intensità di colorazione ≥ del nucleo Cellule con MN Cellule conteggiate x 100 TEST DELLA COMETA Le cellule sono state incubate con una sospensione di fibre Concentrazione: • 50 μg/ml • 100 μg/m • 200 μg/ml Controllo negativo: terreno senza fibre Durata : Controllo positivo: terreno con 0,1 mM K2Cr2O7 1°strato: agarosio con 1% di acqua distillata 2° strato: sospensione cellulare con 100μl di agarosio (0,5% PBS) Lasciate solidificare in ghiaccio per 5 minuti • 12 h • 24 h • 48 h Il preparato è stato inserito in una soluzione lisante fredda (2,5M NaCl, 100mM Na2EDTA, 10mM Tris (pH10),1% sarcosinato di sodio) Vetrini posti in una vaschetta elettroforetica orizzontale 4°C 30 minuti 300 mA 25 V Colorazione con bromuro di etidio Analisi con mcroscopio a fluorescenza 3 lavaggi per 5 minuti ciascuno con Tris buffer (pH7,5) ANALISI STATISTICHE Sono state selezionate casualmente 100 cellule SPSS 20.0 per analisi statistiche Analisi della varianza (ANOVA) per comparare i risultati dell’ elettroforesi e le frequenze dei micronuclei Test LSD (least significant difference) per valutare le differenze tra i gruppi Limiti di significatività statistica fissati a p < 0,05 RISULTATI Frequenze di micronuclei dopo 24h di esposizione • Nessuna differenza significativa tra concentrazione 50 μg/ml e controllo negativo • Differenze significative tra 100 - 200 μg/ml e controllo negativo Significativo aumento di OTM per crisotilo e lana di roccia Migrazione DNA proporzionale sia alla dose che alla durata dell’ esposizione CONCLUSIONE • FIBRE DI CRISOTILO E DI LANA DI ROCCIA CAUSANO ABBERRAZIONI CROMOSOMICHE IN MODO DOSE-DIPENDENTE • ENTRAMBI AUMENTANO I DANNI AL DNA IN MODO TEMPO-DOSE-DIPENDENTE CON CRISOTILO PEGGIORE RISPETTO ALLA LANA DI ROCCIA La valutazione sulla mutagenicità da sola non basta per spiegare la causa del mesotelioma, sono necessarie ulteriori prove per stabilire le cause di questa malattia E’ consigliabile fare ulteriori analisi epidemiologiche per determinare la pericolosità di fibre di crisotilo e fibre di lana di roccia
