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Crisotilo

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CRISOTILO E FIBRE DI LANA DI ROCCIA INDUCONO
ABBERRAZIONI CROMOSOMICHE E DANNI AL DNA
NELLE CELLULE FIBROBLASTICHE V79 DEI POLMONI
Davide Cavaliere
Chrysotile and rock wool fibers induce chromosome aberrations and DNA damage in V79 lung fibroblast cells. Yan Cui et al.
CRISOTILO
• ININFIAMMABILITA’
• RESISTENZA ALLA TRAZIONE
• BASSA DENSITA’
• ISOLANTE
UTILIZZO NEI SETTORI:
•
•
•
•
TESSILE
CHIMICO
MECCANICO
EDILE
Mg3Si2O5(OH)4
•
CINA
•
RUSSIA
•
BRASILE
•
INDIA
MATERIALI SOSTITUTIVI:
LANA DI ROCCIA
LANA DI VETRO
FIBRE CERAMICHE
PATOLOGIE AMIANTO-CORRELATE
 FIBROSI POLMONARE ( Asbestosi )
 MESOTELIOMA
• Pleurico
• Peritoneale
 CARCINOMA POLMONARE
107,000 decessi all’ anno a causa di queste malattie
CRISOTILO
VS
LANA DI
ROCCIA
SCOPO DEL LAVORO
Sostituti artificiali dell’ amianto ( come la lana di roccia ) possono essere genotossici come il
crisotilo, visto che la genotossicità è generalmente un prerequisito per lo sviluppo della neoplasia,
è stata studiata la relazione tra esposizione al crisotilo e fibre di lana di roccia che può causare
abberrazioni cromosomiche
MATERIALI:
FIBRE DI CRISOTILO:
Mangnai (Cina)
MANGNAI
MIANYANG
FIBRE DI LANA DI ROCCIA:
Università di scienze e
tecnologia di Mianyang
(Cina)
PREPARAZIONE DELLE FIBRE ULTRAFINI
Macinate ulteriormente in un mulino a biglie
orizzontale sospese in etanolo
Fibre macinate
con un mortaio
di ceramica
Ridotte a 2-3 mm
Risultato: polvere 0,2g
Messe in incubazione a
150°C per 2h
Particelle < 10μm
messe nel forno
essiccatore
Filtrate attraverso
un 400 mesh
screen
COLTURA CELLULARE
cellule fibroblastiche V79
del polmone di criceto
cinese
• Monostrato dentro una
fiasca di coltura di 25 cm2 a
37°C
• 5% CO2
• atmosfera umidificata
A 80-90% di confluenza le cellule
sono state staccate con 0,25% di
tripsina e portate ad una densità
di 0,5-1 x 106 cellule/ml
TEST DEI MICRONUCLEI
Le cellule in fase di crescita
sono state inserite in piastre di
coltura ed incubate a 37°C
con 5% di CO2 per 24h
Dopo l’ adesione cellulare il terreno di coltura è
stato sostituito con un terreno contenente
sospensioni di fibre
• 50 μg/ml
• 100 μg/ml
• 200 μg/ml
Controlli:
Negativo: Terreno di coltura normale
Positivo: Terreno di coltura con 200 μg/ml di ciclofosfamide

Le piastre di coltura sono state incubate per altre 24h

Lavaggio con PBS

Fissaggio con metanolo ed acido acetico 3:1 per 30
minuti a 4°C

Usata la colorazione di Giemsa per 5 minuti
Sono state analizzate 1x103 cellule per vetrino ( 3 – 4 vetrini per trattamento )e
contato il numero dei micronuclei
CONDIZIONI PER I MICRONUCLEI:
 Dimensione < 1/3 del nucleo
principale
 Dentro il citoplasma
%MN =
 Ben distinti dal nucleo
 Intensità di colorazione ≥ del nucleo
Cellule con MN
Cellule conteggiate
x 100
TEST DELLA COMETA
Le cellule sono state incubate con una sospensione di fibre
Concentrazione:
• 50 μg/ml
• 100 μg/m
• 200 μg/ml
Controllo negativo: terreno senza fibre
Durata :
Controllo positivo: terreno con 0,1 mM K2Cr2O7
1°strato: agarosio con 1% di acqua distillata
2° strato: sospensione cellulare con 100μl di agarosio (0,5% PBS)
Lasciate solidificare in ghiaccio per 5 minuti
• 12 h
• 24 h
• 48 h
Il preparato è stato inserito in una soluzione lisante fredda
(2,5M NaCl, 100mM Na2EDTA, 10mM Tris (pH10),1% sarcosinato di sodio)
Vetrini posti in una vaschetta
elettroforetica orizzontale




4°C
30 minuti
300 mA
25 V
Colorazione con bromuro di etidio
Analisi con mcroscopio a fluorescenza
3 lavaggi per 5 minuti
ciascuno con Tris buffer
(pH7,5)
ANALISI STATISTICHE
Sono state selezionate casualmente 100 cellule
SPSS 20.0 per analisi
statistiche
Analisi della varianza (ANOVA) per comparare i
risultati dell’ elettroforesi e le frequenze dei
micronuclei
Test LSD (least significant difference) per valutare le differenze tra i gruppi
Limiti di significatività statistica fissati a p < 0,05
RISULTATI
Frequenze di micronuclei dopo 24h di
esposizione
• Nessuna differenza significativa tra
concentrazione 50 μg/ml e controllo negativo
• Differenze significative tra 100 - 200 μg/ml e
controllo negativo
Significativo aumento di
OTM per crisotilo e lana di
roccia
Migrazione DNA
proporzionale sia alla dose
che alla durata dell’
esposizione
CONCLUSIONE
• FIBRE DI CRISOTILO E DI LANA DI ROCCIA CAUSANO ABBERRAZIONI CROMOSOMICHE
IN MODO DOSE-DIPENDENTE
• ENTRAMBI AUMENTANO I DANNI AL DNA IN MODO TEMPO-DOSE-DIPENDENTE CON
CRISOTILO PEGGIORE RISPETTO ALLA LANA DI ROCCIA
La valutazione sulla mutagenicità da sola non basta per spiegare la causa del
mesotelioma, sono necessarie ulteriori prove per stabilire le cause di questa malattia
E’ consigliabile fare ulteriori analisi epidemiologiche per determinare
la pericolosità di fibre di crisotilo e fibre di lana di roccia
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