Influenza Aviare
Ludovico Dipineto
Facoltà di Medicina Veterinaria
Università di Napoli Federico II
Influenza aviare
L’influenza aviare (un tempo “Peste aviare”) è
un’infezione e/o malattia virale sostenuta da un virus
influenzale di tipo A, membro della famiglia
Orthomyxoviridae
L’infezione da virus influenzali nei volatili è caratterizzata da una
notevole variabilità nei sintomi: si può passare da una forma
subclinica ad una lieve malattia a carico delle vie respiratorie
superiori, a forme caratterizzate da calo dell’ovodeposizione, fino ad
arrivare ad una forma generalizzata acuta, mortale
Influenza aviare
L’Influenza aviare è stata inserita nella “Lista
A” dell’OIE
Nella “Lista A” sono inserite malattie trasmissibili che hanno la
potenzialità a diffondere in modo molto grave e rapido, senza il
rispetto dei confini nazionali; che hanno gravi conseguenze socioeconomiche o sulla salute pubblica; e che sono di importanza
preminente nel commercio di animali e prodotti di origine animale
Eziologia
Famiglia
Orthomyxoviridae
Genere
Influenzavirus A e B, C
Specie
Influenzavirus tipo A e
B e tipo C (Ag NP e M)
Nelle specie aviari sono stati isolati solo virus
influenzali di tipo A
Classificazione
in base al tipo di Emoagglutinina
(H) e di Neuraminidasi (N)
Subtipi
H1, H2, H3, …, H16
N1, N2, N3, …, N9
Classificazione
in base alla Patogenicità
virus ad alta patogenicità
virus a bassa patogenicità
Criteri adottati dall’OIE per classificare un virus
influenzale “ad alta patogenicità”
1.
Ogni virus influenzale che determina la morte di 6, 7 o 8/8 polli sensibili,
di età compresa fra 4 e 8 settimane, entro 10 giorni dall’infezione
intravenosa con 0,2 ml. di una sospensione virale 1:10 di liquido
allantoideo, privo di batteri
2.
Se il virus uccide da 1 a 5 polli, ma non appartiene al subtipo H5 o H7, è
richiesta l’esecuzione del seguente test: crescita del virus in colture
cellulari (ad es. cellule primarie, quali cellule di embrione di pollo, o linee
cellulari, quali MDCK) con effetto citopatico o formazione di placche in
assenza di tripsina. Se non si verifica crescita, il virus non viene
considerato ad alta patogenicità
3.
Per tutti i virus H5 e H7 a bassa patogenicità e per tutti gli altri virus
influenzali, se si verifica crescita in colture cellulari in assenza di tripsina,
si determina la sequenza aminoacidica del sito di “cleavage”
dell’emoagglutinina. Se essa è simile a quella dei virus ad alta
patogenicità, il virus viene considerato ad alta patogenicità
Definizione adottata dall’UE nella Direttiva 92/40/CEE (recepita
in Italia con D.P.R. n 656 del 15/11/96) per l’Influenza aviare
“ad alta patogenicità”
Per “Influenza aviare” si intende un’infezione dei volatili
causata da un virus influenzale di tipo A che possiede un
indice di patogenicità intravenosa in polli di 6 settimane
superiore a 1,2 o un’infezione con virus influenzali di tipo A
del subtipo H5 o H7 per i quali il sequenziamento nucleotidico
dimostra la presenza di aminoacidi basici multipli nel sito di
“cleavage” dell’emoagglutinina
Nomenclatura
Designazione dell’antigene profondo (tipo A, B, C)
Indicazione dell’ospite, dal quale il virus è stato isolato
(solo nel caso in cui sia diverso dall’uomo)
Paese o Regione in cui è avvenuto l’isolamento
Numero assegnato al ceppo
Anno in cui si è avuto l’isolamento
Designazione del subtipo H e N
A/Turkey/England/199/79 (H5N2)
Morfologia del virus
Simmetria elicoidale
Pleomorfo sferico ( 80-120 nm.) o filamentoso (
80-120 nm., lunghezza variabile)
Envelope con proiezioni superficiali o peplomeri
(lunghezza 10-12 nm.), rappresentate dalle glicoproteine
emoagglutinina (HA o H) e neuraminidasi (NA o N)
Genoma: ssRNA a polarità negativa diviso in 8
segmenti veicolanti 10 geni codificanti per 10 proteine
virali (NP, PB1, PB2, PA, M1, M2, H, N, NS1, NS2)
Polipeptidi virali
Proteina NP o nucleoproteina avvolge il segmento di RNA formando il
capside a simmetria elicoidale
Proteine PB1, PB2 e PA complesso peptidico ad attività di RNA
polimerasi e quindi responsabile della replicazione e trascrizione virale
Proteine M1 e M2 o di matrice M1 avvolge il nucleocapside - M2
forma dei pori che attraversano l’envelope ed è probabilmente coinvolta nella
fase di svestimento del virus
Proteina H o emoagglutinina responsabile dell’attacco del virione ai
recettori di superficie della cellula e dell’attività emoagglutinante
Proteina N o neuraminidasi responsabile della liberazione di nuove
particelle virali dalla cellula mediante la sua azione sull’acido neuraminico nei
recettori
Proteine NS1 e NS2 presenti nelle cellule infette, a funzione ancora
sconosciuta
Rappresentazione schematica di un Influenzavirus
Da: G. Poli, 2000
Antigeni virali
Proteine NP e M1 antigeni profondi che determinano
la specificità di tipo - attivano l’immunità cellulo-mediata
Proteine H ed N antigeni superficiali che determinano
la specificità di subtipo – le H inducono la formazione di
anticorpi neutralizzanti e quindi protezione dall’infezione,
anche le N sono importanti per la protezione, con limitazione
apparente della diffusione del virus dalle cellule infette
Variabilità antigenica
“Drift” antigenico
(deriva antigenica)
Mutazione puntiforme dei geni
codificanti le glicoproteine HA e NA,
che porta alla comparsa di una
variante antigenica
“Shift” antigenico
(salto antigenico)
Riassortimento genetico tra geni
di due virus influenzali che infettano
la stessa cellula, con l’acquisizione
di nuovi antigeni HA e NA (ma non
solo) in popolazioni con influenza
endemica che porta alla comparsa
di un nuovo subtipo
Variabilità antigenica
Replicazione virale
Adsorbimento del virus ai recettori cellulari (proteina H)
Penetrazione delle particelle virali intere nella cellula per endocitosi
Scissione dell’HA (a opera di un enzima tripsino-simile che agisce a
pH5) in sede endosomiale
Fusione dell’HA2 con la membrana cellulare che forma la vescicola
endosomica
Replicazione virale
Rilascio del nucleocapside nel citoplasma
Migrazione del nucleocapside nel nucleo
Trascrizione del genoma (RNA-polimerasi o trascrittasi virale)
Traduzione in proteine e genoma virale
Maturazione e rilascio delle particelle virali per “budding” o
gemmazione
Composizione chimica
RNA 0,8-1,1%
Proteine 70-75%
Lipidi 20-24%
Carboidrati 5-8%
Resistenza agli agenti fisico-chimici
I virus influenzali aviari vengono distrutti facilmente da agenti fisici
e chimici, quali detergenti, formalina,
-propiolattone, agenti
ossidanti, acidi diluiti, etere, sodio-desossicolato, idrossilamina, sodio
dodecil-fosfato e ioni ammonio, calore, valori estremi di pH,
condizioni non isotoniche e in mezzi secchi
L’infettività dei virus influenzali nelle feci si conserva per 30-35
giorni a 4°C e per 7 giorni a 20°C (particelle virali infettanti possono
essere reisolate dalle feci per 105 giorni dopo lo svuotamento del
capannone); nell’acqua si conserva per 4 giorni a 22°C e oltre 30
giorni a 0°C; nel materiale organico resiste 11 giorni a temperatura
ambiente
Corso di Patologia Aviare – Anno Accademico 2006/07
Dr. Ludovico Dipineto
Basi molecolari della patogenicità
Proteina H
Precursore glicoproteico H0
“Cleavage” in H1 ed H2
Mediazione proteasi cellula
ospite
(tripsina)
Nessuna mediazione
Particelle virali infettanti
Particelle virali non infettanti
Virus altamente patogeni
“Cleavage” da parte di proteasi
presenti in una grande varietà di
cellule e tessuti
Virus scarsamente
patogeni
“Cleavage” da parte di proteasi che
riconoscono 1 sola arginina, ad es.
enzimi tripsina-like
Infezione sistemica fatale
Infezione solo nel tratto respiratorio
ed intestinale
Replicazione in una grande varietà di
colture cellulari
Con o senza aggiunta di tripsina
Replicazione solo in alcune colture
cellulari
A meno che non si aggiunga tripsina
Virus altamente patogeni
Possiedono più aminoacidi basici nel sito di “cleavage”
Ad es. in alcuni H7 le sequenze aminoacidiche sono:
-PEIPKKKKR*GLF-, -PETPKRKRKR*GLF-,
-PEIPKKREKR*GLF-, -PETPKRRRR*GLF-
Virus scarsamente patogeni
Possiedono 1 solo aminoacido basico nel sito di “cleavage”
Ad es. in alcuni H7 le sequenze aminoacidiche sono:
-PEIPKGR*GLF-, -PENPKGR*GLF-
Incidenza e Distribuzione
I virus influenzali sono diffusi in tutto il mondo in
molte specie di uccelli domestici e selvatici
L’incidenza e la distribuzione dei virus influenzali sono
difficilmente determinabili e condizionati da:
Distribuzione delle specie domestiche e selvatiche
Ubicazione degli allevamenti
Vie migratorie
Stagione
Sistemi di segnalazione della malattia
Sistemi di monitoraggio e procedure impiegate
Spettro d’ospite
Volatili domestici: tacchini,
quaglie, fagiani, anatre, oche
polli,
faraone,
Uccelli selvatici: anatre, oche, gabbiani, storni,
etc.
Uccelli da gabbia: parrocchetto, pappagallino
ondulato, etc.
Tacchino più sensibile – Palmipedi più resistenti
Patogenesi
Virus altamente patogeni
Infezione
Rapidissima diffusione del virus a tutti i tessuti
Elevata viremia
Morte
Trasmissione
Via orizzontale
Contatto diretto
Da animale malato ad
animale sano
Contatto indiretto
Materiale contaminato
(mangime, acqua, attrezzature,
etc.) Uomo - Aerosol
Diffusione
Fonti primarie di infezione per i polli
Altre specie di volatili domestici
Uccelli esotici in cattività
Uccelli selvatici
Altri animali
Il principale serbatoio di virus influenzali è
rappresentato dagli uccelli selvatici, in particolare
uccelli acquatici (Famiglia Anatidae, Ordine
Anseriformes)
1. Questo serbatoio può servire come fonte di virus per
altre specie, compreso l’uomo, altri mammiferi ed uccelli
2. L’elevata percentuale di infezione in questi volatili può
fornire l’opportunità per il mantenimento e la comparsa
di nuovi stipiti, con elevata patogenicità potenziale,
attraverso il processo di mutazione e/o riassortimento
genetico
Epidemie di Influenza aviare in Italia
H5N2: HPAI (1997-1998)
H7N1: LPAI (1999-2001)
H7N1: HPAI (1999-2000)
H7N3: LPAI (2002-2003)
Marzo 2013
CINA
Aprile 2013
CINA
Notifica del primo caso
umano di infezione da
influenza virus tipo A ceppo
H7N9
Notifica di infezione da
influenza virus tipo A ceppo
H7N9 a bassa patogenicità in
piccioni e pollame
Autorità per la salute
pubblica
Autorità per i servizi
veterinari
H7N9 è tipico dei volatili
Analisi molecolari hanno mostrato analogie genetiche tra il ceppo
isolato dall’uomo ed il ceppo isolato dai volatili in Cina
La fonte di infezione dell’uomo non è stata ad oggi identificata
Attualmente il ceppo H7N9 non è stato isolato negli uccelli selvatici in Cina
I virus influenzali sono altamente specie-specifici ma hanno, in rare
occasioni, effettuato il salto di specie infettando l’uomo
L’Influenza Aviare non deve essere confusa con l’influenza stagionale:
una malattia comune nell’uomo sostenuta dai virus H1 ed H3
La trasmissione dell’Influenza Aviare all’uomo avviene quando c’è uno stretto
contatto con uccelli infetti o con ambienti fortemente contaminati
Periodo di incubazione
Infezione naturale
da poche ore a 3 giorni
(fino a 14 giorni per un allevamento)
Morbilità e Mortalità
Molto variabili
nel caso di virus ad alta patogenicità
fino al 100%
Sintomatologia
Le infezioni con questi virus possono essere inapparenti o
risultare in una malattia che può variare da sindromi lievi,
transitorie e/o tali da produrre il 100% di morbilità e
mortalità
I sintomi della malattia sono estremamente variabili in
relazione a: ceppo di virus, ospite (specie - età - stato
immunitario), infezioni concomitanti, condizioni ambientali
I sintomi possono riflettere le alterazioni prodotte a carico
respiratorio, enterico, riproduttore e nervoso
Sintomatologia
Morte improvvisa senza la comparsa di alcun sintomo
evidente
oppure
Debolezza, pallore, inappetenza, calo dell’ovodeposizione,
tendenza ad accalcarsi, penne arruffate, sintomi respiratori
lievi o gravi, quali tosse, starnuti, rantoli, eccessiva
lacrimazione, sinusite, edema della testa e collo, cianosi
delle aree cutanee prive di penne (cresta e bargigli),
disordini nervosi e diarrea
Lesioni anatomo-patologiche
LPAI
Edema della mucosa tracheale, con
congestione
e
occasionalmente
emorragie (presenza di essudato da
sieroso a caseoso, con occasionale
occlusione delle vie respiratorie e
conseguente asfissia); aerosacculite
fibrinosa
o
fibrino-purulenta
(accompagnata da infezioni batteriche
secondarie);
gonfiore
dei
seni
infraorbitali, con scolo nasale da
mucoso
a
muco-purulento;
broncopolmonite
fibrino-purulenta
dovuta a patogeni secondari, quali
P.multocida ed E.coli
Lesioni anatomo-patologiche
LPAI
Peritonite catarrale o fibrinosa ed
“ovaro-peritonite”; enterite catarrale o
fibrinosa (ciechi o intestino); ovidutto
edematoso, con essudato catarrale o
fibrinoso, prima di andare incontro
all’involuzione, riduzione nella % di
deposizione del calcio nel guscio, uova
deformi e fragili con perdita della
pigmentazione; regressione dell’ovario,
che inizia con emorragie nei follicoli più
grandi fino alla colliquazione; reni gonfi,
con presenza di urati ai visceri;
pancreas indurito, con screziature
pallide ed emorragie
Lesioni anatomo-patologiche
HPAI
Lesioni edematose, emorragiche e
necrotiche agli organi e alla pelle;
quando la malattia è iperacuta, non si
osservano lesioni macroscopiche; in
altri casi le lesioni consistono in
gonfiore della testa, faccia, collo e
zampe, per edema sottocutaneo
accompagnato
da
emorragie
petecchiali o ecchimotiche; edema
periorbitale;
emorragie,
focolai
necrotici e cianosi delle zone prive di
penne, soprattutto cresta e bargigli
Lesioni anatomo-patologiche
HPAI
Le lesioni a carico degli organi sono
rappresentate da emorragie sulle
sierose o mucose e focolai di necrosi
nel parenchima, soprattutto a livello
di epicardio, muscoli pettorali, mucosa
del proventricolo e ventriglio; focolai
di necrosi al pancreas, milza e cuore,
occasionalmente al fegato ed ai reni;
polmonite interstiziale focale o diffusa
con edema oppure congestione o
emorragie; atrofia di timo e borsa di
Fabrizio
Immunità
Immunità umorale
Comparsa degli anticorpi nel siero entro 7-10
gg. dall’infezione
Diagnosi
Campioni
Animali vivi: tamponi cloacali
e tamponi tracheali
Animali
morti:
feci
o
contenuto intestinale, cervello,
trachea, polmoni, fegato, milza
ed altri organi eventualmente
colpiti
Diagnosi
Isolamento del virus
Uova embrionate
Inoculazione nella cavità allantoidea di uova
embrionate SPF di pollo di 9-11 gg. d’età
Morte dell’embrione, con lesioni
emorragiche
HA attività emoagglutinante
Colture cellulari
Pochissimi tipi di colture primarie e linee
continue (CEF e MDCK)
Diagnosi
Identificazione del virus
Inibizione dell’Emoagglutinazione
con antisieri specifici
Inibizione della Neuraminidasi
con antisieri specifici
Test di patogenicità in vivo
Indice di Patogenicità Intravenosa (IPIV)
Sequenziamento nucleotidico della proteina HA
Diagnosi
Test di patogenicità
Indice di Patogenicità Intravenosa
(IPIV)
Polli SPF di 6 settimane
IPIV = 0,0 3,0
Diagnosi sierologica
Inibizione dell’Emoagglutinazione
(DPR n 656: 4 HAU + 1:16; 8 HAU +1:8)
Immunodiffusione doppia
Fissazione del complemento
Virus neutralizzazione
Inibizione della neuraminidasi
Emolisi radiale singola
ELISA (con mAb)
Presenza di inibitori aspecifici (periodato di potassio)
Sieri di specie diverse dal pollo, compreso il tacchino, determinano
agglutinazione aspecifica (adsorbimento con eritrociti di pollo)
Diagnosi Differenziale
Malattia di Newcastle
Infezioni da Metapneumovirus ed altri Paramyxovirus aviari
Laringotracheite infettiva
Bronchite infettiva
Colera aviare (forma acuta)
Clamidiosi
Micoplasmosi
Altre infezioni batteriche
Prevenzione e Controllo
Obiettivo prioritario
prevenire l’introduzione del virus
ostacolare la diffusione del virus
Prevenzione e Controllo
Profilassi diretta
Biosicurezza
Biosicurezza
Requisiti strutturali
Reti antipassero su tutte le aperture (portoni, etc.) del capannone
Strumenti per la disinfezione di automezzi, locali ed attrezzature
Aree di stoccaggio materiali (lettiera, etc.) protette
All’entrata del capannone presenza di una zona filtro dotata di
spogliatoio, lavandini e detergenti
Aree perimetrali esterne al capannone pulite, prive di ristagni di acqua,
con erba falciata
Celle di congelazione all’esterno dell’area di allevamento per lo
stoccaggio di animali morti
La lettiera e la pollina opportunamente stoccate presso l’allevamento,
quando sottoposte a processo di maturazione, etc.
Biosicurezza
Requisiti igienico-sanitari e manageriali
Divieto di ingresso agli estranei
Vestiario pulito per il personale ad ogni intervento
Accesso solo ad automezzi
previamente disinfettati
legati
all’attività
di
allevamento
e
Registrazione di tutti i movimenti da e per l’azienda del personale,
animali, attrezzature automezzi
Programma di derattizzazione e lotta agli insetti nocivi
Divieto al personale di detenere volatili propri
Trasporto uova in contenitori monouso o previamente disinfettati
Carico mangime dall’esterno dell’area di allevamento, etc.
Misure di Polizia Veterinaria
“Council Directive 92/40/EEC of 19 May 1992 introducing
Community measures for the control of Avian Influenza”
Istituisce misure comunitarie di lotta contro l’Influenza
aviare, indicando i limiti di patogenicità (misurata come IPIV
e sequenza nucleotidica del sito di “cleavage”
dell’emoagglutinina) per far scattare le restrizioni, i metodi
standardizzati di diagnosi virologica e sierologica, i laboratori
di referenza, etc.
Misure di Polizia Veterinaria
Regolamento di Polizia Veterinaria
D.P.R. 8 febbraio 1954 n 320
O.M. 19 luglio 1991
“Profilassi dell’influenza aviare e della pseudopeste aviare”
D.P.R. 5 novembre 1996 n 656
“Regolamento per l’attuazione della direttiva 92/40/CEE che
prevede misure comunitarie contro l’Influenza aviare”
Misure di Polizia Veterinaria
Le misure di Polizia veterinaria si applicano negli allevamenti di volatili da
cortile, non si applicano se la malattia viene individuata in altri volatili (art.1)
Denuncia del sospetto o dell’accertamento della malattia obbligatoria e
immediata (art.3)
Azienda sotto controllo ufficiale fino alla conferma della malattia (art.4):
- Prelievo di idonei campioni per i necessari esami diagnostici da parte dell’IZS
- Censimento e registrazione di tutti i volatili presenti (morti, malati e sani)
- Isolamento di tutti i volatili presenti
- Divieto di spostamento da e per l’azienda dei volatili
- Autorizzazione per qualsiasi movimento da e per l’azienda di persone, animali
diversi dai volatili, mangimi, materiali, rifiuti, deiezioni, lettiere e letame
- Divieto di uscita di uova dall’azienda, ad eccezione di quelle destinate
direttamente ad uno stabilimento di trasformazione in ovoprodotti
- Mezzi di disinfezione alle entrate e alle uscite dei locali e dell’azienda
- Indagine epidemiologica
- Le misure rimangono in vigore fino all’esclusione della malattia
Misure di Polizia Veterinaria
Conferma della malattia (art.5):
- Abbattimento in loco di tutti i volatili presenti
- Distruzione delle carcasse e delle uova
- Distruzione o apposito trattamento di mangime, lettiera e letame
- Individuazione e distruzione delle carni dei volatili macellati e delle uova durante
il periodo di incubazione della malattia
- Sorveglianza ufficiale dei pulcini nati dalle uova
- Pulizia e disinfezione dei locali, delle zone circostanti e degli autoveicoli
- Divieto di ripopolamento dell’azienda prima che siano trascorsi 21 gg.
- Indagine epidemiologica
Indagine epidemiologica (art.7)
Zona di protezione (minimo 3 km.) e zona di sorveglianza (minimo 10
km.) (art.9)
- Durata zona di protezione: 21 giorni
- Durata zona di sorveglianza: 30 giorni
Misure di Polizia Veterinaria
Vaccinazione (art.16):
- E’ vietata la vaccinazione contro l’Influenza avaria
- In deroga al comma 1, in caso di comparsa della malattia e ad integrazione
delle misure di lotta applicate, la vaccinazione può essere praticata solo in
conformità a specifica disposizione adottata in sede comunitaria in collaborazione
con il Ministero della Sanità
- In deroga ai commi 1 e 2, il Ministero della Sanità può disporre, previa notifica
alla Commissione europea, la vaccinazione d’emergenza intorno ad un focolaio
purché non siano pregiudicati gli interessi fondamentali della Unione europea
Strategia vaccinale “DIVA”
Il ceppo virale usato in tale vaccino possiede lo stesso
antigene H (H7) del virus di campo ma ha un antigene N
eterologo (N3)
La protezione clinica e la diffusione del virus sono
assicurati dalla reazione immunitaria indotta dal gruppo H
omologo mentre gli anticorpi contro l’antigene N indotti dal
virus di campo potrebbero essere usati come marker
dell’infezione di campo
Strategia vaccinale “DIVA”
“Test discriminatorio”: Immunofluorescenza indiretta (iIFAT)
Uccelli vaccinati (H7N3)
Sensibilità relativa: 99.1%
Specificità relativa: 95.7 %
Uccelli infetti (H7N1)
