QUANTA Lite™ LKM-1 ELISA

QUANTA Lite® LKM-1 ELISA
708745
Per uso diagnostico In Vitro
Complessità CLIA: elevata
Finalità d’uso
QUANTA Lite® LKM-1 è un saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per il rilevamento semi-qualitativo
degli anticorpi anti LKM-1 nel siero umano. La presenza degli anticorpi anti LKM-1 può essere utilizzata assieme ai
riscontri clinici e ad altre analisi di laboratorio come ausilio nella diagnosi di epatite autoimmune di tipo 2.
Riassunto e Spiegazione del test
L’epatite autoimmune (EAI) è una malattia eterogenea d’eziologia ignota.1 L’epatite autoimmune di tipo 1 (EAI
lupoide) è il tipo più comune di EAI ed è caratterizzata dalla reattività agli antigeni nucleari (ANA), del muscolo liscio
(Smooth Muscle Antigens, SMA) ed alla actina. L’epatite autoimmune di tipo 2 (EAI-2) è caratterizzata dalla
presenza di anticorpi diretti verso i microsomi epatici e renali (LKM-1) rilevati in sezioni di tessuto epatico e renale
di roditore tramite immunoflourescenza indiretta. La reattività LKM-1 è caratterizzata dalla colorazione del
citoplasma degli epatociti e del tubulo prossimale (non del distale). I pazienti affetti da epatite autoimmune di tipo
2a sono in genere giovani donne con una forma grave della malattia, con livelli bassi di IgA, con buona risposta alla
terapia immunosoppressiva e negative al virus dell’epatite C (HCV).1,2 L’antigene bersaglio principale degli anticorpi
LKM-1 è stato identificato come il citocromo P450 2D6, una proteina microsomiale che si trova nel reticolo
endoplasmatico.3-6 Gli anticorpi LKM-1 si sono riscontrati in una percentuale dei pazienti con infezione cronica da
HCV che va fino all’8%.2,3,7-9 Gli epitopi riconosciuti dai sieri prelevati da pazienti con HCV sono differenti da quelli
riconosciuti dai sieri EAI-2 e potrebbero essere autoanticorpi prodotti durante il decorso della infezione cronica da
HCV piuttosto che da una vera EAI-2.6,7,10,11 Normalmente i pazienti positivi sia al HCV che al LKM-1 sono di età
più elevata, spesso uomini, e generalmente presentano livelli più bassi di anticorpi LKM-1 rispetto ai pazienti affetti
da EAI-2a.1,2 I pazienti positivi sia all’HCV che all’LKM-1 creano una situazione molto difficile per i medici, dato che
la terapia per l’HCV e quella per la EAI-2 sono drasticamente differenti.9,11,12 Oltre agli anticorpi LKM-1 sono stati
identificati anche anticorpi diretti verso il citocromo P450 2C9 (LKM-2) associato alla epatite indotta dall’acido
tienilico, ed anticorpi verso l’uridin difosfato glucoronosil transferasi (LKM-3) che è stata associata alla epatite D.3 In
alcuni pazienti affetti da EAI e negativi ad altri autoanticorpi sembra siano stati rilevati anticorpi all’antigene solubile
epatico (SLA) o all’antigene epato-pancreatico (LP), prospettando l’ipotesi di un altro sottogruppo della EAI.1
Principio della Metodica
L’antigene intero umano ricombinante parzialmente purificato del citocromo P450 2D6 è adsorbito sulla parete dei
pozzetti di una piastra in polistirene in una maniera che conserva l’antigene nel suo stato originale. I controlli prediluiti ed i sieri diluiti dei pazienti vengono distribuiti nei pozzetti corrispondenti, consentendo agli anticorpi anti-LKM1 eventualmente presenti di legarsi all’antigene adsorbito. L’eccesso di campione non legato viene allontanato
mediante il lavaggio e successivamente si aggiunge a ciascun pozzetto un anticorpo anti-IgG umane marcato con
un enzima. Una seconda incubazione consente agli anticorpi anti-IgG umane marcati con l’enzima di legarsi agli
anticorpi del paziente che si sono eventualmente legati alla parete dei pozzetti. Dopo ulteriore lavaggio per
allontanare l’eccesso di anticorpi anti-IgG umane marcati con l’enzima, l’attività dell’enzima rimasto viene misurata
aggiungendo un substrato cromogenico e misurando l’intensità del colore che si sviluppa. Il test può essere letto
mediante uno spettrofotometro ed interpretato confrontando l’intensità del colore che si sviluppa nei pozzetti dei
campioni con quella dei pozzetti dei controlli.
Reagenti
1.
2.
3.
4.
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6.
7.
8.
9.
Piastra microtiter ELISA in polistirene adsorbita con l’antigene intero umano ricombinante parzialmente
purificato del citocromo P450 2D6 (12-1 x 8 pozzetti), con supporto, in busta chiusa contenente materiale
essicante
Controllo ELISA Negativo, 1 flacone di tampone contenente conservante e siero umano senza anticorpi
umani anti-LKM-1, prediluito, 1,2mL
Controllo ELISA fortemente positivo per LKM-1, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi
a ricombinante del citocromo P450 2D6, prediluito, 1,2mL
Controllo ELISA debolmente positivo per LKM-1, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi
a ricombinante del citocromo P450 2D6, prediluito, 1,2mL
Diluente per campioni HRP, 1 flacone – di colore rosa contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris,
Tween 20, stabilizzatori delle proteine e conservante, 50mL
Soluzione di lavaggio HRP Concentrata, 1 flacone di soluzione concentrata 40x – di colore rosso
contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris e Tween 20, 25mL. Vedi la Sezione Metodi per le
istruzioni sulla diluizione.
Coniugato HRP IgG, (montone), anti-IgG umane, 1 flacone – di colore blu contenente tampone,
stabilizzatori delle proteine e conservante, 10mL
Cromogeno TMB, 1 flacone contenente stabilizzatori, 10mL
Soluzione di arresto HRP, Acido solforico 0,344M, 1 flacone – incolore, 10mL
Avvertenze
1.
2.
ATTENZIONE: Questo prodotto contiene un composto chimico (cloramfenicolo allo 0,02%) nel diluente per
i campioni, nei controlli e nel coniugato, noto allo Stato della California come causa di tumori.
Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state testate
e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-HIV, per HBsAg e per anticorpi anti-HCV
mediante metodi approvati dall’FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell’assenza di HIV,
HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Controlli ELISA fortemente positivo LKM-1, ELISA
debolmente positivo LKM-1 ed ELISA Negativo devono essere maneggiati come materiali potenzialmente
infettivi.13
1
3.
4.
5.
6.
7.
8.
La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se ingerita o
assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo o rame
formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità di acqua, se si usa un
lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi.
Il Coniugato HRP contiene un composto chimico velenoso/corrosivo, che può essere tossico se ingerito.
Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi.
Il Cromogeno TMB contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso
la cute. Per prevenire lesioni, evitare l’inalazione, l’ingestione o il contatto con la cute e con gli occhi.
La Soluzione di arresto HRP è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. Evitare l’esposizione a
basi, metalli o altri composti che possono reagire con gli acidi. L’acido solforico è velenoso e corrosivo e
può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con
gli occhi.
Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti.
I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le normative
vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica.
Precauzioni
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Questo prodotto è stato messo a punto per l’uso diagnostico In Vitro.
La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili.
Un lavaggio incompleto o non accurato e l’insufficiente aspirazione del liquido dai pozzetti ELISA può
causare una scarsa precisione e/o un’elevato background.
L’adattamento di questo test all’uso con apparecchiature automatiche e altri dispositivi per trattamento dei
campioni liquidi, in toto o in parte, può causare differenze nei risultati rispetto a quelli ottenuti mediante la
procedura manuale. E’ responsabilità di ciascun Laboratorio confermare che le procedure automatizzate
utilizzate diano risultati entro limiti di accettabilità.
Una serie di fattori influenza le prestazioni del test. Essi comprendono l’iniziale temperatura dei reagenti, la
temperatura dell’ambiente, l’accuratezza e la riproducibilità della tecnica di pipettamento, la scrupolosità
delle operazioni di lavaggio e di aspirazione del liquido dai pozzetti delle piastre ELISA, il tipo di
spettrofotometro usato per leggere i risultati e la lunghezza dei tempi di incubazione durante l’esecuzione
del test. Bisogna prestare molta attenzione alla costanza per ottenere risultati accurati e riproducibili.
Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite.
Una chiusura incompleta della busta richiudibile contenente le strisce di pozzetti ed il materiale essicante
causa la degradazione dell’antigene ed una scarsa precisione nei risultati.
Valori di assorbanza inaccettabilmente bassi possono essere osservati dopo aver usato due o più volte lo
stesso flacone di coniugato HRP per un certo periodo di tempo. E’ importante seguire attentamente le
istruzioni fornite per il trattamento del coniugato HRP per evitare tale inconveniente.
Un’eventuale contaminazione chimica del coniugato HRP può essere conseguenza di una impropria pulizia
o risciacquo di apparecchi o di strumenti. Residui di comuni reagenti chimici di laboratorio quali formalina,
candeggina, etanolo o detergenti causano la degradazione nel tempo del coniugato HRP. Risciacquare
molto accuratamente tutti gli apparecchi e gli strumenti dopo l’uso di detergenti chimici.
Condizioni di conservazione
1.
2.
3.
Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8°C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza
se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite.
Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere rimesse immediatamente nella busta richiudibile
contenente il materiale essicante e conservate nella busta ben chiusa a 2-8°C.
Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 1 settimana a 2-8°C.
Raccolta dei campioni
Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. L’aggiunta al campione di sodio azide o di altri
conservanti può influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica, trattati
con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l’uso di sieri
fortemente emolizzati o lipemici.
Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A2 dell’CLSI (NCCLS)
raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni a temperatura
ambiente per non più di 8 ore. 2) Se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in frigorifero
a 2-8°C. 3) Se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni, congelare a ≤20°C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di essere testati.
Procedura
Materiali forniti
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Piastra microtiter ELISA LKM-1 (12-1 x 8 pozzetti), con supporto
1,2mL Controllo ELISA Negativo prediluito
1,2mL Controllo ELISA debolmente positivo LKM-1 prediluito
1,2mL Controllo ELISA fortemente positivo LKM-1 prediluito
50mL Diluente per campioni HRP
25mL Soluzione di lavaggio HRP concentrata, 40x concentrata
10mL Coniugato HRP IgG, (montone), anti-IgG umane
10mL Cromogeno TMB
10mL Soluzione di arresto HRP, 0,344M Acido solforico
2
Materiali richiesti ma non forniti
Micropipette in grado di erogare volume di 5, 100, 200-300 e 500µL
Puntali monouso per micropipette
Provette per la diluizione dei sieri, volume 4mL
Acqua distillata o deionizzata
Beuta da 1L per diluite la Soluzione di lavaggio HRP concentrata
Lettore per piastre ELISA in grado di leggere a 450nm (e 620nm per le letture a doppia lunghezza d’onda)
Metodica
Prima di incominciare
1.
2.
3.
4.
Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20-26oC) e mescolarli bene.
Diluire la Soluzione di lavaggio HRP concentrata 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone fornito con il kit
a 975mL di acqua distillata o deionizzata. Se non si usa l’intera piastra in una sola volta, si può preparare
una minore quantità di soluzione di lavaggio aggiungendo 2,0mL di concentrato a 78mL di acqua distillata o
deionizzata ogni 16 pozzetti utilizzati. La soluzione di lavaggio diluita è stabile per 1 settimana a 2-8oC.
Preparare una diluizione 1:101 di ciascun campione da testare aggiungendo 5µL di siero a 500µL di
Diluente per campioni HRP. I campioni diluiti devono essere testati entro 8 ore dalla preparazione. NON
DILUIRE i Controllo ELISA debolmente positivo LKM-1, Controllo ELISA fortemente positivo LKM-1 ed
Controllo ELISA Negativo.
La determinazione della presenza o dell’assenza di LKM-1 usando unità arbitrarie richiede due pozzetti per
ciascuno dei tre controlli ed uno o due pozzetti per ciascun campione clinico. Si raccomanda di testare i
campioni in duplicato.
Esecuzione del test
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
TUTTI I REAGENTI DEVONO ESSERE PORTATI A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26°C) PRIMA DI
INIZIARE IL TEST. Posizionare i pozzetti/le strisce necessarie nel supporto. Rimettere immediatamente
la strisce inutilizzate nella busta contenente il materiale essicante e sigillarla bene per minimizzare
l’esposizione all’umidità ambientale.
Distribuire 100µL dei Controlli ELISA debolmente positivo LKM-1, ELISA fortemente positivo LKM-1 ed
ELISA Negativo prediluiti e dei sieri diluiti nei rispettivi pozzetti. Coprire i pozzetti ed incubare per 30 minuti
a temperatura ambiente su una superficie piana. Il tempo di incubazione inizia dopo l’aggiunta dell’ultimo
campione.
Lavaggio: Aspirare completamente il contenuto di ciascun pozzetto. Distribuire 200-300µL di soluzione di
lavaggio HRP diluita in tutti i pozzetti e quindi aspirarla. Ripetere questa operazione per altre due volte, per
un totale di tre lavaggi. Dopo l’ultimo lavaggio capovolgere la piastra e scuoterla fermamente su tovaglioli di
carta assorbente per rimuovere eventuali residui di liquido. E’ importante vuotare completamente ciascun
pozzetto dopo ciascun lavaggio. Per l’aspirazione mantenere la stessa sequenza usata per l’aggiunta dei
campioni.
Distribuire 100µL di Coniugato HRP IgG in ciascun pozzetto. Il coniugato dovrebbe essere prelevato dal
flacone mediante tecniche sterili. Prelevare dal flacone solo la quantità di coniugato necessaria per
l’esecuzione del test. PER EVITARE POSSIBILI CONTAMINAZIONI MICROBICHE E/O CHIMICHE, NON
RIMETTERE MAI IL CONIUGATO INUTILIZZATO NEL FLACONE. Incubare i pozzetti per 30 minuti come
descritto al punto 2.
Lavaggio: Ripetere la procedura descritta al punto 3.
Distribuire 100µL di Cromogeno TMB in ciascun pozzetto ed incubare al buio per 30 minuti a temperatura
ambiente.
Distribuire 100µL di Soluzione di arresto HRP in ogni pozzetto. Per l’aggiunta della Soluzione di arresto
HRP mantenere la stessa sequenza e gli stessi tempi utilizzati per l’aggiunta del Cromogeno TMB. Agitare
gentilmente la piastra con le dita per mescolare completamente i reagenti nei pozzetti.
Leggere l’assorbanza (OD) di ciascun pozzetto a 450nm entro 1 ora dall’aggiunta della soluzione di arresto.
Se si preferisce una lettura a doppia lunghezza d’onda, si può usare la lunghezza d’onda di 620nm come
riferimento.
Controllo di qualità
1.
2.
3.
4.
I Controlli ELISA debolmente positivo LKM-1, ELISA fortemente positivo LKM-1 ed ELISA Negativo devono
essere inclusi ogni volta che si esegue il test per assicurare che tutti i reagenti ed il test funzionino in modo
corretto.
Si deve notare che, poichè i Controlli ELISA debolmente positivo LKM-1, ELISA fortemente positivo LKM-1
ed ELISA Negativo sono prediluiti, essi non rappresentano un controllo procedurale per le tecniche di
diluizione utilizzate per i campioni.
Ulteriori controlli possono essere inclusi in base alle indicazioni o alle richieste delle vigenti
regolamentazioni o delle organizzazioni di accreditamento. Ulteriori sieri di controllo possono essere
preparati raccogliendo un pool dei sieri umani, aliquotandolo e conservandolo a < -20°C.
Perchè i risultati del test siano considerati validi, tutti i seguenti criteri devono essere soddisfatti. Se anche
uno solo non rientra nei valori specificati, i risultati non dovrebbero essere considerati validi ed il test
dovrebbe essere ripetuto.
a.
L’assorbanza del Controllo ELISA fortemente positivo LKM-1 prediluito deve essere maggiore di
quella del Controllo ELISA debolmente positivo LKM-1 prediluito che a sua volta deve essere
maggiore di quella del Controllo ELISA Negativo prediluito.
b.
Il Controllo ELISA fortemente positivo LKM-1 prediluito deve avere un’assorbanza maggiore di 1,0
mentre l’assorbanza del Controllo ELISA Negativo prediluito non deve essere maggiore di 0,2.
c.
L’assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo LKM-1 deve essere maggiore di due volte
rispetto a quella del Controllo ELISA Negativo oppure >0,25.
3
d.
e.
Il Controllo ELISA Negativo e quello ELISA fortemente positivo LKM-1 servono per controllare
un’eventuale malfunzionamento dei reagenti. Il Controllo ELISA fortemente positivo LKM-1 non
assicura la precisione in corrispondenza del valore soglia del test.
L’utente del test dovrebbe fare riferimento al Documento C24-A dell’CLSI (NCCLS) per ulteriori
informazioni su appropriate tecniche di Controllo di Qualità.
Calcolo dei risultati
Si deve determinare innanzitutto il valore medio di assorbanza per ciascun set di duplicati. La reattività di ciascun
campione viene quindi calcolata dividendo il valore medio di assorbanza del campione per il valore medio di
assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo LKM-1 e moltiplicando il risultato per il numero di unità
assegnate al Controllo ELISA debolmente positivo LKM-1, che è stampato sull’etichetta del flacone.
Assorbanza campione
Valore del campione = ———————————————— x Valore Controllo ELISA debolmente positivo LKM-1 (unità)
(unità)
Assorbanza Controllo ELISA debolmente positivo LKM-1
La reattività è collegata in modo non lineare alla quantità di anticorpi presente. Mentre gli aumenti e le diminuzioni
delle concentrazioni degli anticorpi vengono evidenziate da un corrispondente aumento o diminuzione della
reattività, il cambiamento non è proporzionale (ad es., un raddoppio della concentrazione di anticorpi non raddoppia
necessariamente la reattività). Se si desidera una più accurata quantificazione del contenuto di anticorpi, si
possono allestire e testare diluizioni seriate del campione. L’ultima diluizione che risulta positiva nel test dovrebbe
essere refertata come il titolo anticorpale del paziente.
Interpretazione dei risultati
Il metodo ELISA è molto sensibile alla procedura ed è in grado di individuare anche piccole differenze nella
popolazione dei pazienti. I valori riportati qui di seguito sono solo valori suggeriti. Ciascun Laboratorio dovrebbe
stabilire il proprio range di normalità basato sulla procedura da esso utilizzata, sui controlli, sull’apparecchiatura e
sulla popolazione di pazienti secondo le proprie metodiche standard.
Il campione può essere quindi classificato come negativo, dubbio o positivo in base alla seguente tabella.
Unità
<20,0
20,1 – 24,9
>25
Negativo
Dubbio
Positivo
I campioni che danno risultati dubbi dovrebbero essere ritestati prima di refertare i risultati.
1.
2.
3.
4.
5.
Un risultato positivo indica la presenza di anticorpi IgG diretti verso il P450 2D6 ricombinante umano e
suggerisce la possibilità di epatite autoimmune tipo 2.
In un campione con livelli equivoci di IgG LKM-1 non è possibile determinare la presenza di anticorpi. Se i
risultati permangono equivoci dopo un secondo test, si dovrebbe contrassegnare il risultato come equivoco
e/o procedere con il prelievo di un altro campione.
Un risultato negativo indica assenza di anticorpi IgG verso LKM-1 o livelli inferiori alla soglia di positività
dell’analisi.
I campioni che danno valori di OD al di sopra del range di lettura del lettore della piastra possono essere
riportati come più elevati della più grande OD misurabile divisa per la OD del debolmente positivo per 25 o
possono essere diluiti, ri-analizzati per ottenere un valore calcolato.
Sul referto si dovrebbe riportare la seguente frase: “I seguenti risultati sono stati ottenuti mediante il test
QUANTA Lite® LKM-1 ELISA della INOVA. I valori LKM-1 ottenuti con test prodotti da altre Ditte possono
non essere utilizzabili in modo intercambiabile. Il livello di IgG determinato con questo metodo non può
essere correlato ad un titolo endpoint.”
Limitazioni del test
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Un risultato negativo non esclude la presenza di epatite autoimmune tipo 2.
Un risultato negativo della ricerca di anticorpi LKM-1 non esclude la presenza di questi anticorpi, perché la
concentrazione potrebbe essere inferiore ai limiti di rilevabilità dell’analisi.
Un risultato positivo indica la presenza di anticorpi diretti verso il citocromo P450 2D6 ricombinante umano
e non indica necessariamente la presenza di epatite autoimmune tipo 2.
La diagnosi di epatite autoimmune tipo 2 viene fatta sulla base dei riscontri clinici, dei dati demografici del
paziente interessato e di altri esami diagnostici.
Gli anticorpi anti LKM-1 possono essere rilevati in un numero ridotto di pazienti affetti da HCV come
risultato della infezione e potrebbero non essere dovuti alla EAI-2. I campioni positivi al LKM-1 dovrebbero
essere analizzati per l’HCV.
I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del paziente e
del risultato degli altri test sierologici.
Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero.
Valori attesi
L’incidenza di epatite autoimmune di tipo 2 è di circa 5 - 30 casi su un milione. Questa malattia è più frequente
nelle età comprese fra i 2 ed i 14 anni e molto più frequente nelle femmine rispetto ai maschi (8:1).14,15
Range normale
Un gruppo di 194 campioni raccolti da 151 adulti e 43 soggetti pediatrici è stato analizzato con il kit QUANTA Lite®
LKM-1 ELISA. Un campione è risultato equivoco ai limiti (20,7 unità). I restanti 193 campioni sono stati interpretati
quali risultati negativi. Escludendo il campione equivoco la specificità era del 100% (193/193). Il valore medio per
questa popolazione era di 6,3 unità, la mediana era 5,7 unità ed il valore più elevato era 20,7 unità. L’età degli
individui era compresa fra 1 e 75 anni.
4
Caratteristiche specifiche
Studi clinici
Nel primo studio si è riunito ed analizzato in un laboratorio clinico esterno un gruppo di 84 campioni clinicamente
definiti. La Figura 1 riassume i dettagli dei campioni analizzati ed i risultati dello studio. Il QUANTA Lite® LKM-1
ELISA ha dimostrato una sensibilità del 100% (22/22) per i campioni positivi all’epatite autoimmune di tipo 2,
positivi all’LKM-1 IFA e negativi all’HCV. Si sono riscontrati livelli bassi di reattività LKM-1 nei pazienti HCV positivi.
Il QUANTA Lite® LKM-1 ELISA ha riscontrato che il 70% (14/20) di un gruppo selezionato di campioni LKM-1,
IFA+/HCV+ era positivo al QUANTA Lite® LKM-1 ELISA. È stata riscontrata una specificità del 100% del QUANTA
Lite® LKM-1 ELISA (34/34) per 34 campioni positivi all’LKM-1, IFA da soggetti che clinicamente non presentavano
la positività all’EAI-2 ed erano HCV negativi. Inoltre 3 pazienti positivi all’LKM-2 e 5 LKM alotano positivi sono
risultati negativi con il QUANTA Lite®
LKM-1 ELISA. Un secondo studio esterno ha esaminato un gruppo che
conteneva 4 pazienti affetti da EAI-2 documentata (età 2, 2, 4 1/2 e 6 anni) ed altri 41 campioni di pazienti con
malattie autoimmuni ed epatiche. Tutti e 4 i campioni EAI-2 sono stati interpretati quali risultati positivi. Tre
campioni positivi all’HCV erano LKM-1 ELISA ed IFA positivi, uno era solo LKM ELISA positivo. Tre campioni
positivi all’HCV erano LKM-1 IFA ed ELISA positivi, uno era solo LKM ELISA positivo. Pregasi consultare la
sezione “reazioni crociate” per altri campioni testati.
Figura 1
QUANTA LITE LKM-1 ELISA
Valutazione dei campioni clinici
140
120
U
N
I
T
S
100
80
60
40
20
0
LKM-1 Positivi
Autoimmune
Hepatitis 2
positivi
HCV negativi
n=22
LKM-1
Positivi HCV
positivi
n=20
LKM-1 Positive
- NOT
Autoimmune
Hepatitis 2
- HCV negativi
n=34
LKM-2
positivi
n=3
LKMHalothane
positivi
n=5
Nello studio interno si è analizzato un gruppo di 79 campioni raggruppati da laboratori di riferimento e da
campioni presenti negli archivi interni. I risultati degli esami eseguiti con il QUANTA Lite® LKM-1 ELISA e
l’LKM-1 IFA sono riassunti nella Tabella 1.
Tabella 1
n=79
LKM-1 IFA
POS
EQ
QUANTA LITE®
POS
41
1
LKM-1 ELISA
EQ
0
0
NEG
5
7
Concordanza complessiva = 91,5% (65/71) (esclusi i risultati equivoci)
NEG
1
0
24
Studio di reattività crociata
Campioni da una varietà di gruppi clinici sono stati analizzati con il QUANTA Lite® LKM-1 ELISA per
rilevare eventuali reazioni crociate. I risultati sono riportati nella Tabella 2.
Tabella 2: Studio di reattività crociata
Gruppo di pazienti
HCV *
LKM-2
LKM-alotano
Antigene Solubile Epatico (SLA)
Epatite autoimmune tipo 1
Morbo di Crohn
Colite acuta
Cirrosi (una alcolica, una non specifica)
Cirrosi biliare primaria
Crioglobulinemia
Steatoepatite non alcolica
Pancreatite post-ostruttiva
Morbo di celiaco
Sclerodermia
Morbo di Addison (adreal pos.)
Anticorpo insulare (ICA)
Decarbossilasi dell’acido glutammico (GAD)
AMA
SMA
TPO
Sm
RNP
Gruppo di pazienti
n=
40
3
5
5
15
6
1
2
1
3
1
1
1
1
1
2
2
8
3
9
1
1
n=
5
Pos
5**
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Pos
Eq.
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Eq.
Neg
35
3
5
5
14
6
1
2
1
3
1
1
1
1
1
2
2
8
3
9
1
1
Neg
SS-A
1
0
SS-B
1
0
Scl-70
1
0
Jo-1
1
0
Ribosoma P
1
0
Cromatina
1
0
PCNA
1
0
ANA/DNA
9
0
Centromero
1
0
* Campioni HCV positivi (non selezionati per reattività LKM-1 IFA)
** 4/5 sono LKM-1 IFA positivi
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
9
1
Precisione e riproducibilità
La performance Intra-Test è stata valutata analizzando per 12 volte 6 campioni: uno negativo, uno equivoco,
uno ai limiti della positività, uno debolmente positivo, uno moderatamente positivo ed uno fortemente positivo.
I risultati sono riassunti nella Tabella 3.
Tabella 3
Sera 1 Sera 2 Sera 3 Sera 4 Sera 5 Sera 6
Mean
61,7
13,5
4,9
12,9
43,6
66,2
S.D.
2,6
0,8
0,3
0,4
0,8
2,8
C.V.%
4,2
5,8
5,3
3,2
1,8
4,3
La performance Inter-Test è stata valutata analizzando 10 campioni. Questi includevano dei negativi, dei
debolmente positivi, dei moderatamente positivi e dei fortemente positivi. Le prove sono state effettuate un
totale di 6 volte in un arco di tempo di 3 giorni. Durante ciascuno dei giorni si sono effettuate due serie di
analisi, una al mattino ed una nel pomeriggio. I risultati, riassunti nella Tabella 4, mostrano un CV% di circa
5% o inferiore per tutti i campioni che hanno dato risultati di 5,5 o superiore.
Tabella 4
Sera 1
58,0
1,4
2,3
Mean
S.D.
C.V.%
Sera 2
3,2
0,7
22,7
Sera 3
65,8
2,7
4,1
Sera 4
5,1
0,7
14,1
Sera 5
50,2
1,2
2,5
Sera 6
46,9
2,4
5,1
Sera 7
4,4
0,8
17,6
Sera 8
48,5
2,2
4,5
Sera 9 Sera 10
44,2
5,4
2,2
0,8
4,9
14,2
La riproducibilità dei risultati fra diversi laboratori è stata valutata comparando i risultati ottenuti tramite un
gruppo di campioni analizzati in cieco nel laboratorio esterno 2 e quelli ottenuti precedentemente alla INOVA
Diagnostics. L’analisi di regressione ha mostrato un concordanza eccellente con un valore di R2 di 0,99.
Linearità
Le diluizioni di 3 campioni hanno mostrato che la prova ha dato una buona linearità quando sono state
utilizzate diluizioni da 1:50 a 1:51.200 (Figura 2).
Figura 2
PROVA DI LINEARITÀ
TM
QUANTA LITE LKM-1 ELISA
Unità
y = -9,6737x + 75,098
2
R = 0,988
y = -11,896x + 103,04
100.0
80.0
60.0
40.0
20.0
2
R = 0,9878
y = -12,163x + 75,67
2
1:1600
1:800
1:400
1:200
1:100
1:50
R = 0,9976
Diluzione
6
Bibliografia
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
McFarlane IG. The Relationship between autoimmune markers and different clinical syndromes in autoimmune
hepatitis. Gut 42: 599-602, 1998.
Manns MP. Liver/kidney microsomal autoantigens. In: Autoantibodies, eds: Peter JB and Shoenfeld Y. Elsevier.
pp 462-466, 1996.
Manns MP and Obermayer-Straub P. Cytochromes P450 and uridine triphosphate-glucoronosyltransferases:
model autoantigens to study drug-induced, virus-induced, and autoimmune liver disease. Hepatology
26(4):1054-1066,1997.
Zanger UM, Hauri HP,Loeper J, Homberg JC and Meyer UA. Antibodies against human cytochrome P450 dbl in
autoimmune hepatitis type II. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8256-8260,1988.
Manns MP, Johnson EF, Griffin KJ, Tan EM and Sullivan KF. Major antigen of liver kidney microsomal autoantibodies in idiopathic autoimmune hepatitis is cytochrome P450 dbl. J. Clin. Invest. 83:1066-1072,1989.
Gueguen M, Yamamoto AM, Bernhard O and Alvarez F. Anti-liver-kidney microsome antibody type 1 recognizes
human cytochrome P450 dbl. Biochem. Biophys. Res. Commun. 159:542-547, 1989.
Miyakawa H, Kitazawa E, Abe K, Kawaguchi N, Fuzikawa H, Kikuchi K, Kako M, Komatsu T, Hayashi N and
Kiyosawa K. Chronic hepatitis C associated with anti-liver/kidney microsome-1 antibody is not a subgroup of
autoimmune hepatitis. J. Gastroenterol. 32(6): 769-776, 1997.
Clifford BD, Donahue D, Smith S, Cable E, Luettig B and Manns MP. High prevalence of serological markers of
autoimmunity in patient with chronic hepatitis C. Hepatology 231:613-619, 1995.
Gregorio GV, Pensati P, Iorio R, Vegnente A, Mieli-Vergani G and Vergani D. Autoantibody prevalence in
children with liver disease due to chronic hepatitis C virus (HCV) infection. Clin. Exp. Immunol. 112(3): 471-6,
1998.
Declos-Valee JC, Hajoui O, Yamamoto AM, Jacqz-Aigrin E and Alvarez F. Conformational epitopes on CYP2D6
are recognized by liver/kidney microsomal antibodies. Gastroenterology 108: 470-467, 1995.
Dalekos GN, Wedemeyer H, Obermayer-Straub P, Kayser A, Barut A, Frank H and Manns MP. Epitope
mapping of cytochrome P450 2D6 autoantigen in patients with chronic hepatitis C during alpha-interferon
treatment. J. Hepatol. 30(3):366-375, 1999.
Todros L, Saracco G, Durazzo M, Abate ML, Touscoz G, Scaglione L, Verme G and M Tissetto. Efficacy and
safety of interferon alfa therapy in chronic hepatitis C with autoantibodies to liver-kidney microsomes.
Hepatology 22:1374-1378, 1995.
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of
Health, 2007, Fifth Edition.
Beaune P, Pessayre D, Dansette P, Mansuy D and Manns MP. Autoantibodies against cytochromes P450: a
role in human diseases. Adv. Pharmacol. 30:199-245, 1994.
Homberg JC, Abuaf N, Bernard O, Islam S, Alvarez F, Khalil SH, Poupon R, Darnis F, Levy VG, Grippon P, et
al. Chronic active hepatitis associated with antiliver/kidney microsome antibody type 1: a second type of
“autoimmune hepatitis.” Hepatology 7(6): 1333-9, 1987.
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March 2012
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