Esperimento di Hammerling

Gli acidi nucleici:
molecole informazionali
Frederick Griffith e lo S. pneumoniae
R
Il batterio Streptococcus pneumoniae,
agente eziopatologico della polmonite
studiato da Frederick Griffith, se fatto
crescere su una “capsula di Petri”,
si può presentare con due forme
alternative: una patogena (che causa la
polmonite) chiamata S (smooth) a
causa di un rivestimento
mucopolisaccaridico, ed una non
patogena R (rough) priva di tale
rivestimento.
S Occasionalmente un batterio di tipo
S si può trasformare in uno di tipo R
e quindi R e S sono da considerarsi
forme mutanti alternative dello
stesso microrganismo.
Esperimento di Emil Griffith
Esiste nei batteri S
(morti)
una molecola
che trasforma
i batteri R in S
(agente trasformante)
Avery, McLeod e McCarty
Proteine, RNA, polisaccaridi e
DNA di batteri S inattivati al calore,
sono aggiunti a batteri R vivi
1° proteine (S) + R
2° RNA (S)
+R
3° zuccheri (S) + R
4° DNA (S)
+R
R
R
R
S
Conclusioni:
il DNA è il principio trasformante
ipotizzato da Frederick Griffith
ed è quindi la molecola
a contenuto informazionale
Esperimento di Hammerling
INNESTI
INCROCIATI
Gli esperimenti di trapianto tra acetabularie
dimostrano che l’informazione genetica risiede nel nucleo
Esperimento di Fraenkel-Conrat
virus della Plantago
di Holmes
virus del
mosaico del tabacco
Conclusioni: anche l’RNA è una
molecola a contenuto informazionale
Meselson e Stahl
Nel 1958, Meselson e
Stahl dimostrarono che
la replicazione del DNA
e’ semiconservativa
LA REPLICAZIONE SEMICONSERVATIVA (2°)
15N
14N
Schema di
“replicazione
semiconservativa”.
DNA parentale in
verde ed il nuovo
DNA sintetizzato in
rosso
Proprietà fisiche del DNA
DENATURAZIONE E RINATURAZIONE
DEL DNA (1°)
nativo
denaturato
inizio rinat.
nativo
Per aumento della temperatura, ed in determinate
condizioni di salinità e di pH, il DNA si denatura.
Riabbassando successivamente la temperatura il DNA
ritorna allo stato nativo
DENATURAZIONE E RINATURAZIONE
DEL DNA (2°)
 Fattori che favoriscono la
denaturazione:
 1° pH > 11
 2° Temperatura  Tm
 3° Concentrazione salina
 4° Concentrazione DNA
 5° Contenuto in GC del
DNA
 6° Dimensione del DNA
1° e 2° favoriscono la denaturazione
3°- 6° stabilizzano il DNA nativo (rinaturazione)
DENATURAZIONE DEL DNA


Effetto Ipercromico
(50μg DNA/ml)
1.4
1.0
Denaturazione vista al
microscopio elettronico
bolle di
denaturazione
Tm
La temperatura in cui un dato DNA si trova al
50% denaturato ed al 50% allo stato nativo viene
definita temperatura di “melting” (fusione) e si
indica con “Tm”
Effetto del contenuto in GC
sulla denaturazione del DNA
100%
denaturato
50%
100%
nativo
Temperature di “melting” di DNA (50%
denaturato) a diversi contenuti di GC
Effetto della concentrazione salina sulla
denaturazione del DNA
Denaturazione del DNA di E.coli (~ 4x106 b.p.)
in condizioni ioniche diverse
IBRIDAZIONE DEL DNA
1 molecola
SONDA
10000 molecole
1° DENATURAZIONE
2° RINATURAZIONE




Si ottiene mediante
sonde molecolari:
piccoli acidi nucleici
marcati con:
isotopi radioattivi
gruppi cromogeni
fluorocromi
gruppi
chemiluminescenti
GENOMI E CROMOSOMI (1°)
 Il genoma di un organismo è rappresentato dal suo
DNA totale.
 I genomi variano notevolmente in dimensione: si passa
dai circa 6x105 paia di basi (b.p.) per il Micoplasma ai
circa 3x109 b.p (genoma aploide) per l’uomo ed i
mammiferi in genere.
 Il genoma umano si trova organizzato su 24 cromosomi
distinti che contengono da 50 a 250x106 b.p. di DNA.
GENOMI E CROMOSOMI (2°)
 Un cromosoma contiene molti geni (le unità fisiche
e funzionali dell’eredità), e si stima che in tutto il
genoma umano si trovino circa 25.000
 I geni sono sequenze specifiche che codificano le
istruzioni per sintetizzare le proteine e costituiscono
circa il 2% del genoma umano; il resto consiste di
regioni non codificanti, le cui funzioni sono legate
sia alla integrità strutturale dei cromosomi sia alla
regolazione della espressione genica.
GENOMI E GENI
Organismo
Genoma
(Mb)
N. Geni
(approx.)
Procarioti
Mycoplasma
E. coli
0.58
4.64
500
4300
Invertebrati
C. Elegans
Drosophila
100
140
19000
13600
Vertebrati
Fugu r.
H. sapiens
400
3000
35000
30000
Piante
Arabidopsis
Trillium
125
106000
25000
50000
DNA codificante e non
4.7 Mb
12.1 Mb
100 Mb
3000 Mb
Genomi di procarioti ed eucarioti
Nei procarioti i singoli geni sono separati da brevi
sequenze non codificanti
gene 1
gene 2
gene 3
Negli eucarioti i singoli geni sono separati da lunghissime
sequenze non codificanti
gene 1
gene 2
gene 3
I CROMOSOMI
ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE
 1° sono enzimi prodotti
solo dai batteri
 2° riconoscono sul DNA
sequenze bersaglio
specifiche
 3° le sequenze bersaglio
sono palindromi
 4° operano un taglio sulle
sequenze bersaglio
frammentando il DNA
COME AGISCONO GLI ENZIMI DI
RESTRIZIONE
Hamilton e Wilcox nel 1970 isolano i primi enzimi
di restrizione.
Endonucleasi di restrizione
e frammentazioni (2°)
Il DNA umano (o di altro vertebrato) ha una
dimensione di circa 3 x 109 paia di basi (bp).
Se digerito con EcoRI originerà una serie di
frammenti a dimensione media di 4096 bp.
Il numero di frammenti (tra loro diversi)
generati sarà dunque (circa) 106.
GLI INTERCALANTI
Alcuni composti aromatici si intercalano tra le coppie di basi
del DNA, se questi composti sono fluorescenti come ad esempio
l’ etidio bromuro, tutto il DNA potrà essere visualizzato con
una sorgente di luce ultravioletta.
Digestione del DNA con endonucleasi
Elettroforesi in gel di
agarosio, il
DNA è visualizzato
mediante l’intercalante
“etidio bromuro”
Elettroforesi in gel di agarosio
A
B
A e B sono frammenti di DNA
standard di dimensione conosciuta.
Il DNA viene evidenziato mediante
una sostanza fluorescente (etidio
bromuro) che si intercala tra la
pila di basi complementari.
I frammenti di DNA
ottenuti per mezzo di
enzimi di restrizione da
molecole più grandi,
vengono separati
mediante elettroforesi
su gel di agarosio, ed
il loro peso molecolare
determinato per
interpolazione con
molecole di DNA a
peso molecolare noto.
IL SOUTHERN “BLOT”





Il DNA viene:
1° - digerito con enzimi di restrizione
2° - separato su gel di agarosio mediante elettroforesi
3° - trasferito per capillarità su filtro di nylon
4° - ibridato con una sonda molecolare (e.g. radioattiva)
5° - evidenziato con pellicola per radiografie
IL SOUTHERN “BLOT” 2°
Il Southern “blot” di DNA genomico
I frammenti ottenuti per
digestione con enzimi di
restrizione di DNA genomico
umano (o di vertebrato)
sono circa un milione,
tra questi solo un frammento
ibridizzerà con una sonda
molecolare complementare
ad un singolo gene.