Corso di Laurea: Laurea Triennale in “Biotecnologie” Nome del

Corso di Laurea: Laurea Triennale in “Biotecnologie”
Nome del corso: Biologia Molecolare e Microbiologia
Responsabile del
Corso
Numero CFU e
tipologia del Corso
Sonia Senesi
Corso di 12 CFU, 2 moduli di 6 CFU: Biologia molecolare (I modulo) e
Microbiologia (II modulo)
Responsabile del I
Modulo (Biologia
molecolare)
Giovanni Cercignani
Numero CFU e
tipologia del I
Modulo
Lezioni, 6 CFU
Responsabile del II
modulo
Microbiologia)
Sonia Senesi
Numero CFU e
tipologia del II
Modulo
Lezioni (5 CFU), Laboratorio (0.5 CFU). Esercitazioni (0.5 CFU)
Obiettivo formativo
generale del I
Modulo
. Fornire agli studenti una metodologia di studio e basi operative per
apprendere il funzionamento degli organismi a livello molecolare, con
particolare riguardo ai meccanismi funzionali alla replicazione,
trascrizione e traduzione dei genomi. Comprendere e saper utilizzare
operativamente le proprietà fisiche, chimiche e biologiche di DNA, RNA e
proteine connesse con i suddetti meccanismi. Approfondire i processi di
replicazione, trascrizione e trasformazione del DNA, di traduzione
dell’RNA in proteine e di modulazione dell’espressione genica nei batteri.
Apprendere gli elementi fondamentali delle tecniche di manipolazione del
DNA, sia a fini biotecnologici sia nelle applicazioni alla ricerca di base
Elenco degli
1° CFU: Strutture e funzioni di nucleotidi ed acidi nucleici.
argomenti trattati nel Introduzione alla Biologia molecolare. L’oggetto di studio, la storia, i
I Modulo
metodi e gli obiettivi. Evidenze storiche per il ruolo funzionale del DNA. Le
strutture dell’RNA. L’esperimento di Meselsohn e Stahl: la replicazione del
DNA è semiconservativa. Il flusso dell’informazione genica: dal DNA
all’RNA alle proteine. I costituenti degli acidi nucleici: le basi azotate, i
nucleosidi ed i nucleotidi; fondamenti di bioenergetica, accoppiamento
energetico, intervento dei nucleosidi trifosfati. Tecniche di isolamento ed
analisi degli acidi nucleici. Le regole di Chargaff, la denaturazione del
DNA. Legami a idrogeno e altre interazioni non covalenti alla base del
riconoscimento tra biomolecole. Il modello di Watson e Crick. Le forme del
DNA e loro parametri geometrici. I due filamenti sono antiparalleli. Il solco
maggiore ed il solco minore. Si possono “leggere” sequenze nel DNA a
doppia elica.
2° CFU: Sintesi proteica. Generalità sull’espressione genica: unità
trascrizionali negli Eubatteri, i loro segnali di inizio e di terminazione;
formazione degli mRNA e degli RNA stabili. La traduzione negli Eubatteri.
Ruolo e struttura dei tRNA. Attivazione degli amminoacidi. Le amminoaciltRNA sintetasi. Struttura e assemblaggio del ribosoma. I fattori di inizio
della traduzione. N-formil-Metionina: sintesi e ruolo. Il codice genetico:
ridondanza e wobble hypothesis. La fase di allungamento: ruolo delle
proteine G. La fase di terminazione della traduzione. Accuratezza della
sintesi proteica: considerazioni teoriche e fatti sperimentali. Amminoacidi
omologhi e isosterici: attività correttive di alcune amminoacil-tRNA
sintetasi. La regolazione dell’espressione genica in procarioti. Ruolo delle
terminazioni dipendenti da Rho nella espressione di diversi cistroni di
un’unica unità trascrizionale.
Principali differenze nella trascrizione/traduzione dei geni negli Eucarioti
rispetto ai Procarioti.
3° CFU: Replicazione del DNA negli eubatteri. La replicazione del DNA
in E. coli: bidirezionalità della replicazione. La topologia del DNA e le
topoisomerasi. Le conseguenze e le funzioni del superavvolgimento nel
duplex di DNA circolare e lineare. Reazione di polimerizzazione. La DNA
polimerasi I e le sue attività enzimatiche. La polimerasi III. La processività.
Il modello semidiscontinuo della replicazione (Okazaki e Kornberg).
Modello di replicazione del DNA in E. coli. L’OriC. Le proteine dnaA,
dnaB e dnaC. Il replisoma e l’avanzamento della forca replicativa. Ruolo
delle topoisomerasi nella replicazione. La sintesi discontinua del lagging
strand ed i frammenti di Okazaki. La correzione degli errori di copiatura in
corso di replicazione. La DNA ligasi ed il suo meccanismo di azione. La
terminazione della replicazione in E. coli. Cenni sulla riparazione del DNA,
con particolare riguardo alla correzione in corso di replicazione. Altri
sistemi di replicazione in fagi e virus.
4° CFU: La trascrizione del DNA negli eubatteri e la sua regolazione.
Funzioni e meccanismi generali della trascrizione nelle unità trascrizionali
procariotiche. Filamento stampo e filamento sequenza. L’RNA polimerasi.
Il fattore sigma. Identificazione dei siti di legame della polimerasi: il footprinting. Struttura generale del promotore procariotico. Fasi di
allungamento del trascritto. Siti di pausa dell’RNA polimerasi. Terminatori
indipendenti e dipendenti da Rho. La regolazione dell’espressione genica
per induzione e repressione (controllo negativo) e per attivazione (controllo
positivo). Controllo negativo e positivo negli operoni catabolici (lac, ara,
gal). L’operone del triptofano: controllo negativo e meccanismo di
attenuazione. Cenni sulla ciclo litico e lisogenico nel fago lambda come
esempio complesso di regolazione della trascrizione. I piccoli RNA
regolatori: meccanismi on/off di trascrizione/traduzione. Cenni sulla
trasposizione e l’inversione di elementi genici.
5° CFU: Genoma eucariotico. L’organizzazione del genoma eucariotico.
Cinetica di riassociazione di filamenti complementari. Il Cot1/2. DNA
satellite. Cromatina e struttura del nucleosoma. Telomeri e centromeri. La
telomerasi. DNA a sequenza unica ripetute. Geni ripetuti in tandem. La
cromatina attiva in trascrizione. La trascrizione in eucarioti: i vari livelli
della regolazione dell’espressione genica. Electrophoretic mobility shift
assay. Chromatin ImmunoPrecipitation. La RNA pol I e la RNA pol III.
RNA polimerasi II. Il promotore della RNA pol. II. Upstream promoter
elements. I fattori generali della trascrizione. Il complesso di pre-inizio. I
fattori si trascrizione specifici: esempi delle classi principali e della loro
struttura modulare. Espressione di geni inducibili: esempi di geni tessutospecifici e indotti da ormoni. Maturazione e riarrangiamento dei trascritti
eucariotici: Lo splicing e i suoi meccanismi. Self-splicing. Lo splicing
alternativo. RNA editing. I meccanismi dell’interferenza da RNA: miRNA,
siRNA e shRNA.
6° CFU: Le tecniche del DNA ricombinante. Le endonucleasi di
restrizione. Mappatura del genoma: mappe geniche e mappe fisiche. Il
chromosome walking. Tecniche elettroforetiche per separare
poli(d)nucleotidi a doppio ed a singolo filamento. Determinazione della
sequenza di un frammento di restrizione di DNA (Sanger). Le sonde di acidi
nucleici: metodi di preparazione e loro usi. La tecnica del blotting.
Amplificazione del DNA in vitro: polymerase chain reaction (PCR):
concetti di base e sviluppi recenti. Tecniche di clonaggio. I vettori
plasmidici, fagici, cosmidici. Il fago M13. Vettori per genoteche di DNA
genomico YAC e BAC. Sintesi del cDNA da mRNA. Banche di DNA
genomico e di cDNA. La proteomica. Genoma, trascrittoma e proteoma.
Metodi per il sequenziamento del DNA: metodo del dideossi o di Sanger;
metodo chimico o di Maxam e Gilbert; Pyrosequencing. Next generation
sequencing. RNA sequencing e Direct RNA Sequencing.
Obiettivo formativo
generale del II
Modulo
Lezioni: Caratteristiche morfo-funzionali e strutturali-molecolari di
Eubatteri, Archea, Virus e Miceti nell’ottica di un loro uso biotecnologico.
Fisiologia delle cellule microbiche, la loro flessibilità metabolica,
l’adattamento ambientale, dinamica di crescita e strategie di sopravvivenza
di popolazioni batteriche. Ricombinazione genica nei microrganismi.
Meccanismi molecolari della patogenicità batterica e la loro interazione con
l’ospite, nell’ottica di prospettare vaccini ricombinanti protettivi.
Laboratorio/esercitazioni: esecuzione di metodiche convenzionali e
molecolari utili nella diagnostica microbiologica e di sistemi di valutazione
delle suscettibilità batterica agli antimicrobici..
Elenco degli
Breve rassegna dello sviluppo delle Biotecnologiche microbiche.
argomenti trattati nel
Struttura e funzione dei principali componenti cellulari di Eubacteri,
II Modulo
Archea, Virus e Miceti. Studio della struttura e funzione dei seguenti
componenti. 1. Capsula propriamente detta e strato mucoso; 2. Parete
cellulare: struttura e composizione negli Eubatteri Gram-positivi e Gramnegativi e negli Archea; biosintesi della mureina ed antibatterici che la
inibiscono. 3. La membrana esterna dei batteri Gram-negativi: proteine
porine, periplasma e proteine periplasmatiche, endotossine. 4. Membrana
cellulare: composizione e struttura negli Eubacteri ed Archea, i mesosomi e
loro funzioni. 5. Flagelli batterici: struttura, movimento flagellare in liquido
e su superfici solide; la risposta chemiotattica. 6. Fimbrie, pili, spine. 7.
Nucleoide batterico e citoplasma. 8. La spora batterica: caratteristiche
morfologico-strutturali; la sporulazione; la termoresistenza delle spore
batteriche; geminazione ed esocrescita.
Archea: Principali caratteristiche morfologiche, strutturali, fisiologiche e
molecolari che differenziano gli Archea dagli Eubacteria. Caratteristiche
generali degli Alofili estremi, Metanogeni, Metanotrofi ed Iper-termofili in
rapporto all'habitat colonizzato. Loro importanza biotecnologica.
Virus: Struttura della particella virale. Organizzazione dei virioni: struttura
del capside e tipi di acido nucleico. Virioni con rivestimento ed infezione
cellulare. Coltivazione dei virus. I batteriofagi: Replicazione dei fagi T pari
(T4 come modello di fago virulento) e fago lambda (come modello di fago
temperato). Batteriofagi a ssDNA lineare e circolare ed ad RNA.
Miceti: Caratteristiche morfo-funzionali e strutturali-molecolari. Fisiologia
e metabolismo fungino. Coltivazione dei miceti in laboratorio e loro
identificazione con sistemi tradizionali e molecolari.
Nutrizione, metabolismo e crescita batterica: Caratteristiche generali del
metabolismo microbico: flessibilità ed adattabilità metabolica. Produzione
di energia. Respirazione aerobica, anaerobica e fermentazione. Richiami ai
sistemi di trasporto e nutrizione batterica. Cinetica della crescita delle
popolazioni batteriche in terreno liquido (fase di latenza, di crescita
esponenziale, stazionaria, di morte). Caratteristiche delle cellule in fase
esponenziale, stazionaria e di sopravvivenza, con particolare riguardo ai
meccanismi cellulari e molecolari che regolano la risposta cellulare nella
transizione crescita/non crescita e nella sopravvivenza; cellule vitali non
coltivabili. Parametri che influenzano la resa cellulare ed il ritmo di crescita.
Sistemi di regolazione globlale e differenziamento nei procarioti.
Sistemi a due componenti e fattori sigma alternativi. La risposta
chemiotattica. La risposta “Quorum sensing”. Differenziamento swarming.
La regolazione del ciclo cellulare in batteri a rapida e lenta crescita. La
repressione catabolica e la risposta stringent/relaxed. La risposta a
variazione dell’osmolarità nei Gram-negativi.
La ricombinazione genica nei batteri: Meccanismi di trasferimento
genico: coniugazione, transduzione, trasformazione. Caratteristiche
generali dei plasmidi e trasposoni: principali tipi di plasmidi e
meccanismi di controllo del numero e partizione delle copie. Importanza dei
plasmidi nella farmaco-resistenza e patogenicità microbica.
Patogenicità e virulenza microbica. Meccanismi molecolari di
patogenicità microbica. Fattori di virulenza (adesine, invasine, enzimi
degradativi) e patogenicità (eso- ed endotossine). Plasmidi di virulenza ed
isole di patogenicità. Rapporto ospite-parassita: Microrganismi patogeni,
patogeni opportunisti e commensali. Epidemiologia, meccanismi
patogenetici e diagnosi microbiologica di microrganismi modello, tra cui
Streptococcus pneumonieae e Neisseria meningitidis.
Testi consigliati
I Modulo: Watson, T. A. Baker, S. P. Bell, A. Gann, M. Levine, R. Losick “Biologia molecolare del gene” 6a edizione. Zanichelli 2009.
II Modulo: E. Galli, G. Dehò “Biologia dei microrganismi”. Casa Editrice
Ambrosiana
Illustrazione di
eventuali attività di
laboratorio e/o
esercitazioni
II Modulo: LABORATORIO/ESERCITAZIONI Preparazione ed uso di
terreni di coltura solidi e liquidi (minimo, ricco, complesso, sintetico, non
selettivo, selettivo, differenziale e di arricchimento). Le colture microbiche
e fungine: semina su terreni di crescita solidi. Isolamento in coltura pura ed
identificazione delle colture mediante analisi delle colonie e delle
caratteristiche biochimiche-metaboliche dei microrganismi. Introduzione ai
sistemi diagnostici automatizzati. Introduzione ai farmaci antibatterici e
determinazione del valore di MIC ed MBC in terreno liquido e solido.
Modalità di
svolgimento delle
prove d’esame
I Modulo: Sono previste due verifiche scritte in itinere; l’esame finale è
orale.
II Modulo: Possono essere effettuate verifiche scritte in itinere con esame
finale orale
Propedeuticità
I e II Modulo: Tutti i corsi del 1° anno.
Conoscenze
richieste
Fondamenti di Biologia generale, Biologia Cellulare, fondamenti di
Chimica generale e di Chimica Organica, concetti di Fisica, principi di
Biochimica e Genetica generale