2. 1 metodi di trasfezione

Terminologia
Introduzione di DNA in:
• Batteri
• Eucarioti
• Virus -mediata
trasformazione
transfezione
transduzione/infezione
Tipi di Trasfezione
Trasfezione in transient
DNA non integrato nel genoma dell’ospite
I vettori sono persi dalle cellule ad alta frequenza
La proteina clonata nel vettore di espressione è espressa
temporaneamente
Picchi di espressione generalmente dopo 24-72 h
Efficieza: 1-90% della popolazione cellulare
Metodologia semplice, utile per esperimenti di breve tempo
con cellule in coltura
Trasfezione stabile
DNA del vettore è integrato in modo random nel
genoma dell’ospite
Le cellule stabilmente trasfettate sono selezionate grazie alla
resistenza a farmaci
Tecnica idonea per esperimenti a lungo termine
Espressione: costante o inducibile
Efficienza:
100% dopo selezione
Trasfezione in Transient
DNA of interest
Reporter construct
assay transfected cells
transfection
Expression of reporter construct
(48-72 hrs)*
* Da Determinare empiricamente a seconda del saggio
Trasfezione stabile
reporter
linearize vectors
isolate clones and screen for
copy # and expression
reporter
neor
select transfected cells
(drug in culture)
transfection
expand cells
(24-48 hrs)
Selezione di trasfettanti stabili positivi
I markers di selezione sono geni che neutralizzano
l’effetto di farmaci tossici
Lista di markers di selezione frequentemente utilizzati negli
eucarioti superiori
neoR – neomycin (G418, analogo della Neomicina solfato)
hygR – hygromycin
pacR – puromycin
zeoR – zeomycin
Markers Selezionabili di trasfettanti in transient
Transient :
• visualizazione dell’efficienza di trasfezione
Green flourescent protein (GFP) /filter cube
Luciferase/ luminometer
Chemiluminescent reactions:
Β-galactosidase (B-gal)/X-gal substrate
• mechanical sorting: magnetic beads or FACS
Trasfezione transiente
reporter
*1:12 ratio
GFP
assay transfected cells
transfect
Allow reporter expression
(48-72 hrs)
Trasfezione transiente
DNA IRES
GFP
Bicistronic vector
assay transfected cells
transfect
Allow reporter expression of your protein
and GFP protein in the same cell.
(48-72 hrs)
Metodi di Trasfezione
‰ Metodo basato sulla Precipitazione (originale)
‰
CaPO4 (calcium-phosphate)
‰
DEAE-dextran (diethylaminoethyl)
‰ Sostanze Lipofiliche (non-cariche e cationiche)
‰
Lipofectin® (Invitrogen) vs.
Lipofectamine™(Invitrogen) and
Fugene©(Roche)
‰ Meccanici
‰
Electtoporazione
‰
Gene-gun
‰ Iniezione diretta
‰ Utilizzo di virus (trasduzione)
Metodi per introdurre nelle cellule molecole che non
possono attraversare la membrana
elettroporazione
Precipitazione con fosfato di calcio
•kit commerciale o reagenti preparati in laboratorio
• DNA, CaCl2, Hepes buffered saline solution (HBS)
• La grandezza dei precipitati è inversamente proporzionale
alla [DNA]
La soluzione di HBS e il mezzo cellulare sono critici!!!
Può attivare vie di trasduzione del segnale o risposte da stress
Calcio Fosfato
I
II
III
ddH2O
99
100
101
X
2
2
2
Y
2
2
2
Z
2
1
0.5
15
120
15
120
DNAs 0.5µg/µl
Reagents
2M CaCl2 15
2XHBS
120
IV
* For 6-well dish
Numero di cellule trasfettate atteso
‰
Liposomi
‰ Il metodo di trasfezione più efficiente e “gentile”
‰ Caro
‰ Speranze di utilizzare tale metodologia per il drug
delivery (farmaci antisenso). Sono in atto tentativi di
sviluppare liposomi cellulo-specifici
Reagenti Cationici Lipidici
• il rapporto DNA/lipidi e il tempo di incubazione sono parametri
critici (tempo 3 ore-overnight)
• In generale, efficienza aumentata - aumentata tossicità
• Mezzi Serum-free raccommandati per ottimizzare il risultato;
cambiare il mezzo di coltura dopo l’incubazione
Elettroporazione
• Efficienze di trasfezione alta con molti tipi
cellulari
• Facile da eseguire se si ha a disposizione
l’apparecchiatura idonea
Elettroporazione
cuvette
• inizio con molte cellule
• utile con molti tipi cellulari
• [DNA] meno critica, mantenere i sali al minimo
0.4cm
cuvette
Cellule di Mammfero :
Capacitance =960µF
Voltage = 250V
Time constants = 30-50ms
Gene Gun
• Il DNA è sparato ad alta velocità nelle
cellule
• Può essere utilizzato anche su interi
organismi
• Utilizzato per la trasformazione delle piante
Gene Gun
Bullet: DNA-reporter gene precipitated onto gold /tungsten particles
Resuspend
in alcohol
Dry with nitrogen
Store @ 4°C
***This method especially effective in thicker slices of tissue!***
Iniezione diretta
• Efficienza del 100%
•Utilizzata per cellule grandi (es.: ovociti di Xenopus) e per
generare animali transgenici
Trasduzione con retrovirus
• un virus è utilizzato per introdurre un gene non-virale
• utile per trasfettare tipi cellulari difficili : cellule primarie,
cellule in vivo
• utilizza un trasferimento mediato da recettore presente sulla
superficie cellulare invece della permebilità transitoria della
membrana
•Metodologia di trasferimento del DNA ad alta efficienza
•Il DNA frequentemente si integra nel genoma della cellula ospite
•E’ uno strumento molto utile per la ricerca ed è utilizzato in
tentativi di terapia genica
Trasferimento genico mediato da virus.
Metodo molto sofisticato e a alta efficienza
Il vettore può essere generale o cellulo-specifico
Retroviral gene transfer (The M13 like vectors for mammalian cells)
The retroviral genome:
LTR
gag
pol
env
LTR promoter
Structural genes,
pol is Reverse
Transcriptase (RT)
ψ
LTR
Element, required for
packaging of viral
particles
Vettori retrovirali
LTR and ψ elements are inserted in a plasmid
LTR
neoR
AbR
CMV
MCS
ψ
LTR
ColE1
Linee cellulari per l’impacchettamento
cells contain retroviral structural genes, no ψ or LTR
gag
pol
env
element
Produzione di particelle retrovirali
I vettori retrovirali sono trasfettati nelle cellule per
l’impacchettamento
gag, pol, env produrranno RNA“retrovirale” usando l’ LTR e lo
impacchetteranno in particelle “retrovirali”. RT è incorporata nella
particella retrovirale.
ψ
plasmide
ψ
gag
pol (RT)
env
ψ
ψ
ψ
ψ
Particelle Retrovirali
Le particelle retrovirali infettano le cellule
bersaglio.
L’RNA è converito in DNA da parte della
RT
ψ
Retroviral particle
ψ
RNA
RT
ψ
DNA
Variabili che possono essere controllate!
‰ Qualità del DNA
‰
E’ NECESSARIO UN DNA DI ALTA QUALITA’!!!!
‰
Cloruro di Cesio o Qiagen
‰
(bassi livelli di endotossina/LPS)
‰ Accurata determinazione della concentrazionedel DNA
‰
OD260 e/o visualizazione su gel di agarosio
‰ Cellule in buona “salute” e attenzione alla densità cellulare
‰ Cellule da troppo tempo in colture (Overcrescita) possono
smettere di dividersi ed andare in contro ad apoptosi
‰ E’ necessario ottimizzare lo stato di confluenza cellulare per la
trasfezione
‰ Profilo di espressione della proteina
‰
Un timecourse lungo dell’espressione della proteina
target può richiedere una trasfezione stabile.
Quantizzazione del DNA su gel
Usare questo metodo insieme alla OD260 per meglio stimare la [DNA]
50ng 100 200 DNAx
Scelta del metodo di trasfezione
‰ Depende dal tipo cellulare!
‰
‰
‰
‰
‰
‰
Aderenza del tipo cellulare
(con I floaters, I metodi di precipitazione sono meno
efficienti)
Scopo dell’esperimento
(evitare lipofection per studi di patch-clamp electrophysiology)
Velocità di crescita delle cellule
(retrovirus non infetteranno cellule senescenti)
‰ E’ necessario massimizzare l’efficienza? o minimizare la
tossicità?
Espressione in cellule di
mammifero
• Vantaggi:
– modificazioni post-traduzionali
– Resa moderata (0,1 – 1 g/l)
• Svantaggi:
–
–
–
–
Crescita molto lenta (gen.time 14 –30 h)
Mezzi di crescita costosi
Aumentati costi di produzione
Rischi per la salute (virus)
L’espressione in cellule animali è poco
utilizzata per ottenere grandi quantità di
una proteina ma è fondamentale per gli
studi funzionali sulla proteina in esame