Journal Club - Univa Calabria

Journal Club 14/6/2012
Dott.ssa Maria Elena Conidi
CENTRO REGIONALE DI NEUROGENETICA
Malattia di Niemann-Pick di tipo C (NPC) è un disordine
«neuroviscerale» (AR) con accumulo anomalo di colesterolo e
glicosfingolipidi nel sistema endosoma-lisosoma (EL).
Questi difetti di «sequestro» del colesterolo attivano
un’anormale funzione di fegato e milza così come deficit
neurologici diffusi quali atassia, distonia, epilessia e demenza
che possono portare a morte prematura.
NPC è causata da mutazioni di tipo «loss of function» nel
gene NPC1, che codifica per una glicoproteina
transmembrana coinvolta nel trasporto intracellulare del
colesterolo. Tali mutazioni sono accompagnate da perdita di
neuroni nel cervelletto ma non nell’ippocampo.
Evidenza 1
Modelli murinici
Topi transgenici Ncp1-/- si presentano asintomatici alla nascita ma sviluppano
gradualmente tremore e atassia morendo prematuramente tra la 10-12 settimana di età.
A livello cellulare:
Accumulo di colesterolo non esterificato nel sistema EL;
Attivazione della microglia e astrociti;
Perdita del rivestimento mielinico in tutto il sistema nervoso centrale;
Evidente perdita progressiva di neuroni anche nella corteccia prefrontale, talamo,
tronco encefalico e cervelletto, ma meno nell’ippocampo.
Fenotipi simili a quelli osservati nella NPC nell’uomo !!
Evidenza 2
Alterazioni nei livelli/distribuzione di colesterolo possono influenzare il sorting/processing di
diverse proteine inclusa la «proteina precursore amiloide» (APP) da cui si originano i peptidi di Aβ
amiloide.
Gli Aβ peptidi sono coinvolti nella degenerazione delle sinapsi e neuroni nella malattia di
Alzheimer che mostra similitudini con la NPC.
-
↑ livelli/accumulo di colesterolo : ↑ di Aβ peptidi
Inibizione della sintesi del colesterolo: ↓ Aβ.
NPC →alterata distribuzione di PS1 → ↑ Aβ peptidi.
↑Aβ1-42 e βCTF in regioni vulnerabili di cervelli NPC.
risultati
suggeriscono
un ruolo
per la Aβ nello sviluppo e progressione
APP Sebbene
maturo (alquesti
centro)
è metabolizzato
mediante
2 pathways:
patologia
nellache
NPCgenera
si sa molto
riguardo l’origine cellulare o la sua
A) Il della
pathway
-secretasi
sAPP poco
e C83
se esiste,
la vulnerabilità
neuronale osservata nei cervelli con NPC
B) Il associazione,
pathway ß-secretasi
checon
genera
sAPPß e C99.
Tutti i frammenti C-terminali (C83, C99) sono substrati per la -secretasi, generando il dominio
intracellulare di APP (AICD) e, rispettivamente, il peptide p3 (non in figura) e Aß (a destra). Aß si
aggrega in piccoli oligomeri (dimeri, trimeri, etc.).
.
Quali sono i cambiamenti cellulari associati alla degenerazione di
specifiche popolazioni neuronali nei topi Ncp1-/- ???
Scopo 1
Valutare i cambiamenti età-correlati nei livelli e distribuzione di APP, BACE1,
ϒ-secretasi nell’ippocampo e nel cervelletto dei topi Ncp1-/- e di controllo.
Scopo 2
Misurare l’attività delle α- e β-secretasi, così come dei livelli di α- e β- CTF per
stabilire se il processing dell’APP è alterato nei topi Ncp1-/- con conseguente
aumento di Aβ peptidi.
Risultati (1)
Distribuzione intracellulare alterata del colesterolo, perdita di neuroni ed attivazione della glia
nei topi Ncp1-/- di 4, 7, 10 settimane mediante FILIPIN STAINING e FLUORO-JADE C STAINING
1) Presenza di colesterolo in molti neuroni di
ippocampo e cervelletto nei nei topi Ncp1-/- di 10
settimane.
2) Grande numero di microglia attivata e alcuni
astrociti reattivi sono marcati con filipin ed una
up-regulation della microglia (verdi) ed astrociti
(rossi) reattivi nell’ippocampo e cervelletto.
3) Perdita di neuroni nel cervelletto(O-P) ma non
nell’ippocampo (M-N). 4-7 settimane.
4) Riduzione progressiva della densità delle fibre
mielinate (4- e 10- settimane).
Risultati (2)
Livelli ed espressione di APP nei topi Ncp1-/- IMMUNOBLOTTING ED IMMUNOSTAINING
I livelli di APP nell’ippocampo:
significativamente aumentato solo a 10
settimane mentre nel cervelletto era evidente
già a 7 settimane.
L’espressione totale dell’APP risulta poco
incrementata nei neuroni dell’ippocampo
e cervelletto.
Mentre sono stati identificati astrociti
reattivi che esprimono elevati livelli di
APP nelle regioni dell’ippocampo e
cervelletto a 4-, 7- e 10 settimane (43%
degli astrociti ippocampali; 54% degli
astrociti cerebellari)
La microglia attivata non esprime APP nel
cervello dei topi Ncp1-/- a nessuna età.
Risultati (3)
Livelli e distribuzione di BACE1 e ϒ-secretasi nei topi Ncp1-/- IMMUNOBLOTTING ED IMMUNOSTAINING
L’eliminazione di Npc1:
• aumenta “significativamente” i livelli di BACE1 nell’ippocampo e cervelletto a 10 e 7
settimane
• aumenta i livelli dei componenti delle ϒ-secretasi a 7 sett nell’ippocampo e cervelletto
• Aumenta i livelli di PSEN1 nell’ippocampo e nel cervelletto a 10 settimane.
Rispetto ai controlli, la loro espressione aumenta in modo modesto nell’ippocampo e
cervelletto a partire dalla 7° settimana e l’incremento è parzialmente evidente anche nelle
cellule del Purkinje cerebellari.
Risultati (4)
Livelli e distribuzione di BACE1 e ϒ-secretasi nei topi Ncp1-/- IMMUNOBLOTTING ED IMMUNOSTAINING
Nell’ippocampo e nel cervelletto è stato osservato
un sottogruppo di astrociti reattivi esprimere
BACE1 e le ϒ-secretasi , anche se il numero relativo
di astrociti esprimenti BACE1 e le ϒ-secretasi sono
considerevolmente più alti nel cervelletto.
La microglia attivata non esprime BACE1 e le ϒsecretasi né nell’ippocampo né nel cervelletto a
nessuna età esaminata
Risultati (4)
Attività delle α-secretasi + β-secretasi nei topi Ncp1-/- mediante IMMUNOBLOTTING
L’attività delle α-secretasi non viene alterata
dalla eliminazione di Npc1
L’attività di BACE1 è significativamente più
alta sia nell’ippocampo che nel cervelletto in
tutti i gruppi di età.
I livelli di α- e β-CTF sono marcatamente
elevati nel cervelletto a 10 settimane e non
alterati nell’ippocampo.
CONCLUSIONI
Questo studio dimostra che alterati livelli/distribuzione del colesterolo nel cervello dei topi
Ncp1-/- è associato con livelli/espressioni incrementati di APP e β-secretasi nel cervelletto e
delle Υ secretasi anche nell’ippocampo.
•
•
•
Considerando che una parte dell’APP cellulare, così come β-ϒ secretasi sono localizzati in domini ricchi di
colesterolo, è verosimile che un incremento o un alterata distribuzione del colesterolo aumenta il
pathway amiloidogenico dell’APP. In linea con quanto detto, questo studio ha evidenziato significativi
aumenti nei livelli/espressione dell’APP e dei suoi enzimi di processamento (es. BACE1) nell’ippocampo
ed in particolare nel cervelletto suggerendo un incremento del potenziale amiloidogenico colesterolomediato.
Anche gli astrociti reattivi, che giocano un ruolo critico nella patogenesi della NPC esprimono elevati
livelli di APP, β e ϒ secretasi .
Sebbene l’attività delle β-secretasi è notevolmente aumentata nel cervello dei topi Npc1 -/- nei diversi
gruppi di età, i frammenti α- e β-CTF aumentano solo nel cervelletto di topi Npc1 -/- a 10 settimane.
Mentre l’aumento dei livelli di β-CTF può rappresentare l’incremento di produzione/accumulo nei
neuroni cerebellari, è possibile che l’aumento delle α-CTF rifletta la riduzione della clearance lisosomiale
di questo polipeptide in assenza di NCP1.
L’alterata distribuzione del colesterolo può aumentare i livelli/espressione di APP e degli enzimi
coinvolti nel suo processamento sia nei neuroni che negli astrociti reattivi, contribuendo sia
direttamente che indirettamente alle caratteristiche patologiche associate alla NPC.