B06. Cinetica enzimatica

Prof. Giorgio Sartor
Cinetica enzimatica
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B06 - Versione 1.9.4 – Mar-17
Spontaneità
• Una qualunque reazione chimica avviene
se e solo se la
variazione di energia libera (∆G) è
negativa:
spontaneamente
∆GT,p < 0
∆GT = ∆H – T∆S
• A T e p costanti
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-2-
1
Spontaneità
• Quindi, data una qualunque reazione chimica
A→B
• Essa avviene spontaneamente se le energie
libere molari
GB < GA
• Più in generale qualunque trasformazione
avviene se e solo se:
Gfinale < Giniziale
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-3-
Spontaneità ed equilibrio
• Quando
GB = GA
• Quindi
∆G = 0
• La reazione è all’equilibrio
A
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B
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-4-
2
Spontaneità e realtà
• Questo non significa che una reazione chimica (un
processo) esoergonica (∆G < 0) avvenga con velocità
O
O
O
apprezzabile.
P
O
ATP + H2O
O
O
P
O
P
..
O
H
N
O
O
O
O
HO
H
NH 2
N
OH
N
N
↓
O
ADP + Pi
O
O
P
O
+
O
P
O
O
O
N
P O
O
O
O
HO
NH 2
N
OH
N
N
∆G°’ = -7.3 kcal·mole-1 (-30.6 kJ·mole-1) a pH 7
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-5-
Energia di attivazione
• In soluzione l’ATP è stabile perché
esiste l’energia di attivazione.
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-6-
3
Catalisi
• In assenza di catalizzatore:
A+B→C+D
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-7-
Catalisi
Energia libera
∆G* = Energia di attivazione
∆G*
A+B
∆G
C+D
Coordinate di reazione
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-8-
4
Catalisi
• In presenza di catalizzatore:
A + K → AK
AK + B → ABK
ABK → C + D + K
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-9-
Catalisi
Energia libera
∆G*c = Energia di attivazione in presenza di catalizzatore
∆G*c
A+B+K
∆G
AK + B
C+D+K
Coordinate di reazione
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- 10 -
5
Controllo termodinamica e
controllo cinetico di una reazione
• Ogni reazione può avvenire se e solo se è
termodinamicamente favorita (∆G < 0),
• Avviene se e solo se vi è abbastanza energia per
superare l’energia di attivazione:
H202 → H2O + ½ O2
• Catalizzatore :
– Nessuno
– Platino
– Catalasi
∆H* = 18
kcal·mole-1
∆H* = 11.7 kcal·mole-1
∆H* = 5.5 kcal·mole-1
(∆H* = energia di attivazione)
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- 11 -
In una reazione chimica
Velocità di reazione
A→B
v = k · [A]
[A]
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- 12 -
6
Una reazione enzimatica
k1
E+S
k2
ES
E+P
k-1
ES
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EP
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- 13 -
In una reazione enzimatica
Velocità di reazione
E+S
ES
E+P
Alta concentrazione
di substrato
[S]>>[E]
Bassa concentrazione
di substrato
[S]>[E]
v = k'' [Eo]
v = k' [Eo][S]
[S]
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- 14 -
7
Enzimi
• Gli enzimi sono sistemi catalitici, in genere…
… proteine
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- 15 -
Enzimi
• Gli enzimi sono sistemi catalitici, in genere…
… proteine
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- 16 -
8
Specificità degli enzimi
• Specificità
–
–
–
–
Stereochimica
Assoluta
Di gruppo
Di legame
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- 17 -
Specificità degli enzimi
• Specificità stereochimica
steroide 11-β-monossigenasi
H
12
11
13
14
1
9
2
3
OH
16
15
5
7
6
HO
2
11
10
1
8
10
4
17
8
9
3
4
12
17
13
14
15
16
6
5
7
11-β-idrossi steroide
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- 18 -
9
Specificità degli enzimi
• Specificità assoluta
mannitolo-1-fosfato deidrogenasi
CH2OH
CH2OH
HO
H
O
HO
H
HO
H
H
OH
H
OH
H
OH
H
OH
CH2OPO3H-
CH2OPO3H-
mannitolo-1-fosfato
fruttoso-6-fosfato
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- 19 -
Specificità degli enzimi
• Specificità di gruppo
– Proteasi
…-Leu-Arg-Gly-Phe-…
Taglia qui
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- 20 -
10
Centro catalitico
His57
Asp102
Ser195
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- 21 -
Meccanismo delle proteasi a serina
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- 22 -
11
Meccanismo delle proteasi a serina
*
*
Asp102
*
His57
*
*
O
H N
O
Ser195
N
*
H O
*
E
H
Gly193
N *
Sito
Specifico
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- 23 -
Meccanismo delle proteasi a serina
*
*
Asp102
*
His57
*
*
O
H N
O
Ser195
N
H
H
ES
O
H
O
*
*
N
H
*
R
*
N
R
H
Gly193
N *
Sito
Specifico
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- 24 -
12
Meccanismo delle proteasi a serina
*
*
Asp102
*
His57
*
*
O
H N
O
Ser195
N
+
H
*
O
*
H
Intermedio tetraedrico
H
O
N
H
*
R
N
*
H
R
Gly193
N *
Sito
Specifico
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- 25 -
Meccanismo delle proteasi a serina
*
*
Asp102
*
His57
*
*
O
H N
O
Ser195
N
+
H
O
H
H
*
*
O
N
H
*
R
*
N
R
H
Gly193
N *
Sito
Specifico
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- 26 -
13
Meccanismo delle proteasi a serina
*
*
Asp102
*
His57
*
*
O
H N
Ser195
O
N
H
H
O
*
O
*
H
N
H
H
O
H
*
R
N
*
H
R
Gly193
N *
Acilenzima
Sito
Specifico
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- 27 -
Meccanismo delle proteasi a serina
*
*
Asp102
*
His57
*
*
O
H N
Ser195
O
N
O
H
O
O
H
H
*
*
*
H
N
R
H
Gly193
N *
H
H
N
*
R
Sito
Specifico
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- 28 -
14
Meccanismo delle proteasi a serina
*
*
Asp102
*
His57
*
*
O
H N
O
Ser195
N
H
H
*
O
O
*
O
H
N
*
H
R
Gly193
N *
Sito
Specifico
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- 29 -
Meccanismo delle proteasi a serina
*
*
Asp102
*
His57
*
*
O
H N
O
Ser195
N
Intermedio tetraedrico
H
+
H
O
O
*
*
O
H
*
N
R
H
Gly193
N *
Sito
Specifico
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- 30 -
15
Meccanismo delle proteasi a serina
*
*
Asp102
*
His57
*
*
O
H N
O
Ser195
N
+
H
O
H
*
O
*
O
H
N
*
H
R
Gly193
N *
Sito
Specifico
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 31 -
Meccanismo delle proteasi a serina
*
*
Asp102
*
His57
*
*
O
H N
O
Ser195
N
H
H
O
O
*
*
O
H
*
N
R
H
Gly193
N *
Sito
Specifico
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
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- 32 -
16
Meccanismo delle proteasi a serina
*
*
Asp102
*
His57
*
*
O
H N
O
Ser195
N
H O
*
*
H
Gly193
N *
Sito
Specifico
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
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- 33 -
Meccanismo delle proteasi a serina
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
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- 34 -
17
Proteasi a serina (1HAX)
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
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- 35 -
Proteasi a serina (1HAX)
Gly193
Ser195
His57
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- 36 -
18
Specificità degli enzimi
• Specificità di legame
– Esterasi
Estere → Acido + Alcool
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- 37 -
Classificazione degli enzimi
• Singolo enzima
– Ureasi
• Complesso enzimatico
– Complesso piruvato deidrogenasi
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- 38 -
19
Classificazione gerarchica degli enzimi
• Ogni enzima viene classificato a secondo
della reazione che catalizza.
• Viene classificato con un numero:
•
•
•
•
•
EC X.Y.Z.T
X = classe
Y = sottoclasse
Z = sotto-sottoclasse
T = numero dell’enzima nella sottosottoclasse
–
–
–
–
http://www.enzyme-database.org/class.php
http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/enzymes/
http://www.brenda-enzymes.org/
http://www.genome.jp/kegg-bin/get_htext?ko01000.keg
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
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- 39 -
Classificazione gerarchica degli enzimi
• Classi:
– 1. Ossidoreduttasi
• Catalizzano una reazione redox.
– 2. Transferasi
• Catalizzano il trasferimento di un gruppo da una
molecola ad un’altra:
X-Y + Z → X-Z + Y
le chinasi trasferiscono un gruppo fosfato.
– 3. Idrolasi
• Catalizzano la scissione idrolitica di legami C=O, C-N,
C-C, P-O-P,…
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
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- 40 -
20
Classificazione gerarchica degli enzimi
• Classi:
– 4. Liasi
• Catalizzano scissioni di legami con meccanismi diversi
dalle Ossidoreduttasi e dalle Idrolasi.
– 5. Isomerasi
• Catalizzano modificazioni geometriche.
– 6. Ligasi (Sintetasi)
• Catalizzano l’unione di due molecole accoppiata al
consumo di ATP o di un altro nucleotide trifosfato.
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
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- 41 -
Classificazione gerarchica degli enzimi
• Per esempio:
Alcool + NAD+ → Aldeide o chetone + NADH
• Nome comune: alcool deidrogenasi
• Nome sistematico: alcool:NAD+ ossidoreduttasi
• EC 1.1.1.1
Numero dell’enzima nella sotto-sottoclasse
La sotto-sottoclasse – con NAD+ o NADP+ come accettori
La sottoclasse – Agiscono sul gruppo di donatori CH-OH
La classe - Ossidoreduttasi
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
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- 42 -
21
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
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- 43 -
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 44 -
22
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
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- 45 -
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 46 -
23
Isoenzimi
• Questa classificazione NON riguarda gli enzimi
in quanto proteine ma in quanto
CATALIZZATORI
• La classificazione riguarda quindi gli enziomi
che catalizzano una reazione.
• Proteine diverse (con diversa struttura
primaria) che catalizzano la stessa reazione,
sono
ISOENZIMI
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
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- 47 -
Isoenzimi
• Sono le forme multiple dovute a differenze,
determinate geneticamente, di struttura
primaria
• Sono anche isoenzimi quelle proteine che
svolgono la stessa funzione ma sono
geneticamente indipendenti, per esempio:
• EC 1.1.1.37 malato deidrogenasi
– Citosolica (codificata dal DNA nucleare)
– Mitocondriale (codificata dal DNA mitocondriale)
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- 48 -
24
Cenni di cinetica chimica
A
k1
B
k-1
Velocità diretta v1 = -
d[A]
= k1[A]
dt
d[B]
Velocità inversa v-1 = -
• All’equilibrio
= k-1[B]
dt
v1 = v-1
k1[A]eq = k-1[B]eq
k1
k-1
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=
[B]eq
[A]eq
= Keq
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- 49 -
Cenni di cinetica chimica
• Ordine di reazione
– I ordine
v1 = k1[A]
– II ordine
v1 = k1[A]2
oppure
v1 = k1[A][B]
• I ordine rispetto ad A
• I ordine rispetto a B
• II ordine globale
– Ordine 0
v1 = k1
• indipendente dalla concentrazione dei reagenti
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
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- 50 -
25
Dipendenza dalla temperatura
• La velocità di una reazione dipende dalla temperatura
attraverso la costante di velocità k
v = k[A]
E
att1
k = A e- RT
• All’equilibrio
Eatt1
Keq =
k1
k-1
A1 e - RT
=
E
A-1 e
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∆E
att
= Z e- RT
att1
- RT
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- 51 -
Dipendenza dalla temperatura
∆Eatt
∆G
∆H - T∆S
∆H ∆S
Keq = Z e - RT = Z e RT = Z e = Z e - RT - R
RT
∆H
Keq = e - RT
∆H
RT
Eatt 1
Energia
lnKeq = -
Eatt -1
Reagenti
Eatt 1-Eatt -1 = ∆Eatt
∆Eatt ≅ ∆Η
Prodotti
Coordinate di reazione
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
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- 52 -
26
Dipendenza dalla temperatura
ln Keq = -∆H/R 1/T
ln Keq
pendenza = -∆H/R
1/T (K)
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
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- 53 -
Dipendenza dalla temperatura
∆G = ∆G°+ RT ln
[Prodotti]
[Reagenti]
• All’equilibrio
[Prodotti]
[Reagenti]
= Keq;
∆G = 0
0 = ∆G°+ RT ln Keq
∆G° = - RT ln Keq
∆G° = ∆H° - T∆S°
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- 54 -
27
Reazione enzimatica
k1
E+S
ES
k2
E+P
k-1
ES
EP
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- 55 -
Enzima e substrato
•
In una reazione tra enzima (E) e substrato (S),
possiamo distinguere tre fasi:
1. Legame tra E e S per formare il complesso ES
E + S → ES
[S]>>[E]
Stato prestazionario
2.
d[ES]
dt
Stato stazionario
= 0;
3. Scompare il substrato, [ES] diminuisce, v diminuisce
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
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- 56 -
28
Concentrazione
Enzima e substrato
[P]
[S]
[ES]
∆[ES]/∆t ≈ 0
[E]
Tempo
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
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- 57 -
Enzima e substrato
Concentrazione
1a fase
Stato
Pre-stazionario
2a fase
Stato stazionario
3a fase
Fine
[P]
[S]
d[P]/dt ≠ cost.
[ES]
∆[ES]/∆t ≈ 0
[E]
µs → ms
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
s→m→h
B06 - Cinetica enzimatica
Tempo
- 58 -
29
Enzima e substrato
Concentrazione
1a fase
Stato
Pre-stazionario
2a fase
Stato stazionario
3a fase
Fine
[P]
[S]
d[P]/dt ≠ cost.
[ES]
∆[ES]/∆t ≈ 0
[E]
µs → ms
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
s→m→h
Tempo
B06 - Cinetica enzimatica
- 59 -
Enzima e substrato
Concentrazione
1a fase
Stato
Pre-stazionario
2a fase
Stato stazionario
3a fase
Fine
d[S]/dt =cost
d[P]/dt ≠ cost.
d[P]/dt =cost
d[ES]/dt = 0
d[E]/dt =0
µs → ms
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
s→m→h
B06 - Cinetica enzimatica
Tempo
- 60 -
30
Enzima e substrato
Velocità di reazione
• In una reazione enzimatica
l’ordine di reazione è variabile
v = k[E][S]
Ordine 1
v = k[E]
Pseudo ordine 0
[S]
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 61 -
Enzima e substrato
• In una reazione enzimatica
l’ordine di reazione è variabile
Ordine 0
Velocità
Velocità
Ordine 1
[S]
[S]
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 62 -
31
Trattamento secondo Michaelis e Menten
• In una reazione enzimatica [S]>>[E]:
k1
E+S
ES
(veloce)
k-1
k2
ES
E+P
(1)
(lento)
(2)
vdiretta = k2[ES]
• Per l’equilibrio veloce (1)
INDETERMINABILE
K=
k1
k-1
[ES] =
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
=
k1
k-1
[ES]
[E][S]
INDETERMINABILE
[E][S]
B06 - Cinetica enzimatica
- 63 -
Trattamento secondo Michaelis e Menten
• Per l’equilibrio veloce (1)
K=
k1
k-1
[ES] =
=
[ES]
[E][S]
INDETERMINABILE
k1
k-1
[E][S]
[Etot] misurabile
[Etot] = [E] + [ES]
[ES] =
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
k1
k-1
([Etot]-[ES]) [S]
B06 - Cinetica enzimatica
- 64 -
32
Trattamento secondo Michaelis e Menten
• Da cui
[Etot][S]
[ES] =
k-1
k1
k-1
k1
+ [S]
= Kd
Costante di dissociazione
del complesso ES
k-1
ES
E+S
k1
[E][S]
[ES]
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
= Kd = KM
B06 - Cinetica enzimatica
Costante di
Michaelis e Menten
- 65 -
Trattamento secondo Michaelis e Menten
• La concentrazione del complesso ES
[ES] =
[Etot][S]
KM + [S]
• Poiché:
vdiretta = k2[ES]
vdiretta =
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
k2[Etot][S]
KM + [S]
B06 - Cinetica enzimatica
- 66 -
33
Trattamento secondo Michaelis e Menten
• Quando tutto Etot diventa ES allora la velocità sarà massima.
Vmax = k2[Etot]
v=
Vmax[S]
KM + [S]
• Quando il substrato satura l’enzima allora la velocità sarà
massima
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 67 -
Equazione di Michaelis e Menten
v=
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
Vmax[S]
KM + [S]
B06 - Cinetica enzimatica
- 68 -
34
Michaelis e Menten
Leonor Michaelis (1875-1949)
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
Maud Menten (1879-1960)
B06 - Cinetica enzimatica
- 69 -
Efficienza catalitica o numero di turnover
• k2 è detta anche kcat e si ottiene:
kcat =
Vmax
[Etot]
• k2 è detto anche numero di turnover (Moli di substrato
consumate per secondo per moli di enzima) si esprime in s-1.
~1 s-1 < k2 < 106 s-1
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 70 -
35
Trattamento secondo Michaelis e
Menten
Bassa concentrazione
(relativamente) di substrato:
[S]<<KM (Ordine 1)
v=
Vmax[S]
KM + [S]
Velocità di reazione
TRASCURABILE
Alta concentrazione di substrato:
[S]>>KM (Ordine 0)
v=
Vmax[S]
KM + [S]
[S]
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
= Vmax
TRASCURABILE
B06 - Cinetica enzimatica
- 71 -
Trattamento secondo Briggs-Haldane
• Da un punto di vista formale il trattamento è lo stesso di
M.M., cambia il significato cinetico di KM
k1
E+S
k2
E+P
ES
k-2
k-1
• Allo stato stazionario:
d[ES]
dt
[ES] =
k1[E][S]
(k-1 + k2)
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
= 0 = k1[E][S] - (k-1[ES] + k2[ES])
formazione di ES
v=
scomparsa di ES
Vmax[S]
KM + [S]
B06 - Cinetica enzimatica
KM =
k-1 + k2
k1
- 72 -
36
Significato di KM
• KM descrive l’interazione substrato-enzima a livello del
sito di legame.
• KM è una concentrazione:
KM = Kd =
k-1
k1
=
[E][S]
; moli l-1
[ES]
• È la concentrazione di substrato al quale la velocità della
reazione è metà della Vmax
v=
Vmax
2
=
Vmax[S]
KM + [S]
;
[S]
1
=
;
2
KM + [S]
KM = [S]
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 73 -
Significato di Vmax
E+S
k1
k2
E+P
ES
k-1
k-2
• Vmax è legata a k2
Vmax = k2[Etot]
• Dipende dalla concentrazione dell’enzima:
– induzione genica, sintesi e degradazione delle
proteine.
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 74 -
37
Significato di k2
• k2 è una frequenza
Vmax/[Etot] = k2 (moli·l-1·s-1)/(moli·l-1)
k2 = s-1
• Numero di eventi per unità di tempo (numero
di turnover).
• Proprietà cinetica dell’enzima.
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 75 -
Significato di KM e Vmax
v = Vmax
v=
v
Vmax[S]
KM
Vmax
2
KM
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
[S]
B06 - Cinetica enzimatica
- 76 -
38
Enzima
Sorgente
Substrato
Km (mM)
Acetil-CoA sintasi
Cuore di bue
Acetato
ATP-asi
Muscolo di coniglio
ATP
Alcool deidrogenasi
Fegato di cavallo
Etanolo
Anidrasi carbonica
Eritrociti
Anidride carbonica
7.5
Acido aspartico
0.9
Aspartato aminotransferasi
Cuore di maiale
Butirril-CoA deidrogenasi
Fegato di bue
Chimotripsina
Pancreas bovino
1.4
0.014
0.5
Acido α-chetoglutarico
Acido ossalacetico
acido glutammico
Butirril-CoA
0.1
4
0.014
2.5
N-formiltirosinamide
12
N-acetiltirosinamide
32
122
Creatina fosfochinasi
Muscolo di coniglio
Creatina
Esochinasi
Lievito
Glucosio
0.15
19
0.008
Esochinasi
Cervello
Glucosio
Fosfatasi acida
Prostata
α-glicerofosfato
Fosfogliceraldeide deidrogenasi
Muscolo di coniglio
Gliceraldeide-3-fosfato
0.05
Acido glutammico
0.12
Acido α-chetoglutarico
Xantina ossidasi
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
Fegato bovino
Enzima
Ione ammonio
3
2
57
NAD+
0.025
NADH
0.018
Xantina
Latte
0.03
Acetaldeide
B06 - Cinetica
enzimatica
Sorgente
Substrato
1000
Km (mM)
Acetil-CoA sintasi
Cuore di bue
Acetato
ATP-asi
Muscolo di coniglio
ATP
Alcool deidrogenasi
Fegato di cavallo
Etanolo
Anidrasi carbonica
Eritrociti
Anidride carbonica
7.5
Acido aspartico
0.9
Aspartato aminotransferasi
Cuore di maiale
Butirril-CoA deidrogenasi
Fegato di bue
Chimotripsina
Pancreas bovino
Acido α-chetoglutarico
Acido ossalacetico
acido glutammico
Butirril-CoA
0.5
0.1
4
0.014
12
32
122
Creatina fosfochinasi
Muscolo di coniglio
Creatina
Esochinasi
Lievito
Glucosio
0.15
19
0.008
Esochinasi
Cervello
Glucosio
Fosfatasi acida
Prostata
α-glicerofosfato
Fosfogliceraldeide deidrogenasi
Muscolo di coniglio
Gliceraldeide-3-fosfato
0.05
Acido glutammico
0.12
Xantina ossidasi
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
Fegato bovino
Latte
Ione ammonio
3
2
57
NAD+
0.025
NADH
0.018
Xantina
Acetaldeide
B06 - Cinetica
enzimatica
1000000
0.04
2.5
Acido α-chetoglutarico
n° di turnover
(1/s)
1.4
N-formiltirosinamide
N-acetiltirosinamide
- 77 -
0.014
N-benziltirosinamide
gliciltirosinamide
Glutamato deidrogenasi
1000000
0.04
N-benziltirosinamide
gliciltirosinamide
Glutamato deidrogenasi
n° di turnover
(1/s)
0.03
1000
- 78 -
39
Enzima
Sorgente
Substrato
Km (mM)
Acetil-CoA sintasi
Cuore di bue
Acetato
ATP-asi
Muscolo di coniglio
ATP
Alcool deidrogenasi
Fegato di cavallo
Etanolo
Anidrasi carbonica
Eritrociti
Anidride carbonica
7.5
Acido aspartico
0.9
Aspartato aminotransferasi
Cuore di maiale
Butirril-CoA deidrogenasi
Fegato di bue
Chimotripsina
Pancreas bovino
Acido α-chetoglutarico
Acido ossalacetico
acido glutammico
Butirril-CoA
1.4
0.014
0.5
0.1
4
0.014
2.5
N-formiltirosinamide
12
gliciltirosinamide
32
122
Creatina fosfochinasi
Muscolo di coniglio
Creatina
Esochinasi
Lievito
Glucosio
0.15
19
0.008
Esochinasi
Cervello
Glucosio
Fosfatasi acida
Prostata
α-glicerofosfato
Fosfogliceraldeide deidrogenasi
Muscolo di coniglio
Gliceraldeide-3-fosfato
0.05
Acido glutammico
0.12
Acido α-chetoglutarico
Glutamato deidrogenasi
Xantina ossidasi
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
Fegato bovino
Latte
Ione ammonio
3
2
57
NAD+
0.025
NADH
0.018
Xantina
Acetaldeide
B06 - Cinetica
enzimatica
1000000
0.04
N-benziltirosinamide
N-acetiltirosinamide
n° di turnover
(1/s)
0.03
1000
- 79 -
Linearizzazione dell’equazione di
Michaelis e Menten
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 80 -
40
Lineweaver-Burk
v=
Vmax[S]
KM + [S]
• Inversione
KM + [S]
KM
1
=
=
v
Vmax
Vmax[S]
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
1
[S]
+
1
Vmax
B06 - Cinetica enzimatica
- 81 -
Lineweaver-Burk
KM
1
=
v
Vmax
1
[S]
+
1
Vmax
1/v
1/Vmax
Pendenza = KM/Vmax
-1/KM
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
0
1/[S]
B06 - Cinetica enzimatica
- 82 -
41
Eadie-Hofstee
• Trasformazione
v (KM + [S]) = Vmax[S]
vKM + v[S] = Vmax[S]
vKM
[S]
v[S]
+
vKM
[S]KM
v
KM
v/[s]
= Vmax
[S]
+
Vmax/KM
=
Pendenza = - 1/KM
Vmax
Vmax
KM
Vmax
v
1
=
-v
[S]
KM
KM
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
v
B06 - Cinetica enzimatica
- 83 -
Eadie-Hofstee (oppure)
• Trasformazione
v (KM + [S]) = Vmax[S]
vKM + v[S] = Vmax[S]
vKM
[S]
v[S]
+
vKM
[S]KM
[S]
+
v = -KM
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
v
KM
Vmax
v
= Vmax
=
Vmax
Pendenza = - KM
Vmax/KM
KM
v
+ Vmax
[S]
v/[s]
B06 - Cinetica enzimatica
- 84 -
42
Reazioni enzimatiche con più substrati
• Meccanismo sequenziale: i substrati si legano in modo
sequenziale:
• Prima uno poi l’altro in ordine preciso:
– Meccanismo sequenziale ordinato
• Senza un ordine preciso:
– Meccanismo sequenziale casuale
• Meccanismo a ping-pong
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 85 -
Meccanismo sequenziale ordinato
E
P+Q
A+B
E+A
EA;
EAB
EPQ;
EQ
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
EA + B
EAB;
EPQ
EQ + P;
E+Q
B06 - Cinetica enzimatica
- 86 -
43
Meccanismo sequenziale casuale
E
P+Q
A+B
E+A
EA
A
E+B
Q
B
EPQ
EAB
E+P
EP
EB
P
E+Q
EQ
DNA POLIMERASI
DIIDROFOLATO REDUTTASI
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 87 -
Meccanismo a ping-pong
E
P+Q
A+B
E+A
EA
E'P
E' + P
E' + B
E'B
EQ
E+Q
P
A
E
E'A
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
E'P
Q
B
E'
B06 - Cinetica enzimatica
E'B
EQ
E
- 88 -
44
Centro catalitico
His57
Asp102
Ser195
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 89 -
Meccanismo delle proteasi a serina
*
*
Asp102
*
His57
*
*
O
H N
O
Ser195
N
E+A
H
H
O
H
O
*
*
N
H
*
R
*
N
R
H
Gly193
N *
Sito
Specifico
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 90 -
45
Meccanismo delle proteasi a serina
*
*
Asp102
*
His57
*
*
O
H N
O
Ser195
N
+
H
E’A
*
O
*
H
H
O
N
H
*
R
N
*
H
R
Gly193
N *
Sito
Specifico
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 91 -
Meccanismo delle proteasi a serina
*
*
Asp102
*
His57
*
*
O
H N
O
Ser195
N
E’A → E’P
H
+
O
H
H
O
N
H
*
R
*
*
*
N
R
H
Gly193
N *
Sito
Specifico
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 92 -
46
Meccanismo delle proteasi a serina
*
*
Asp102
*
His57
*
*
O
H N
O
Ser195
N
O
H
H
N
H
O
H
*
H
O
*
*
R
*
N
H
R
H
Gly193
N *
Acilenzima
E’P + B
Sito
Specifico
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 93 -
Reazioni enzimatiche con più substrati
• Il trattamento è complesso, occorre fare lo studio cinetico
tenendo fissa la concentrazione di uno dei substrati (B) variando
l’altro (A), così, di grafici di Lineweaver-Burk si può avere una
descrizione del meccanismo:
[B]
1/v
[B]
1/v
1/[A]
Sequenziale casuale
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
1/[A]
Ping-pong
B06 - Cinetica enzimatica
- 94 -
47
Regolazione dell’attività enzimatica
• I fattori che regolano l’attività enzimatica sono:
– Temperatura
• Enzimi solubili o di membrana
– pH
– Effettori
• Inibitori (inattivatori)
• Attivatori
• Effetti allosterici
– Concentrazione di substrati e prodotti
• Vie metaboliche
– Repressione o induzione genica
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 95 -
Temperatura
• La velocità delle reazioni chimiche dipende dalla
temperatura.
• La stabilità di una proteina dipende dalla temperatura.
Velocità
Denaturazione
Aumento cinetico
optimum
Temperatura
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 96 -
48
Temperatura
• La temperatura influenza la fluidità di membrana
Enzima solubile
Enzima di membrana
Temperatura
di transizione
della fase lipidica
Ln v
Ln v
Temperatura
alta
1/T
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
Temperatura
bassa
Temperatura
alta
1/T
Temperatura
bassa
B06 - Cinetica enzimatica
- 97 -
pH
• La stabilità di una proteina dipende dal pH.
• Alcuni processi coinvolgono valori estremi di pH
Tripsina
Aceticolinesterasi
Velocità relativa
Pepsina
2
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
6
pH
B06 - Cinetica enzimatica
10
- 98 -
49
Effettori
• Attivatori
• Inibitori
• La differenza non è netta, la stessa molecola
può funzionare in entrambi i modi a seconda
delle condizioni
–
–
–
–
Carica
Concentrazione
Enzima legato ad altre molecole
…
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 99 -
Inibitori
• Si definiscono inibitori quelle molecole che diminuiscono
l’attività di un enzima, possono dare
• Inibizione reversibile
– Modificano in modo reversibile (in genere attraverso un
legame non covalente) l’enzima
• Inibizione irreversibile
– Modificano in modo irreversibile l’enzima
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 100 -
50
Inibitori reversibili
• A secondo delle loro caratteristiche si
definiscono:
– Inibitori competitivi
– Inibitori non competitivi
– Inibitori acompetitivi
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 101 -
Inibitori competitivi
• Agiscono competendo con il substrato per lo
stesso sito di legame, agiscono quindi sulla
formazione del complesso ES.
• L’inibizione è rimossa aumentando la
concentrazione di S
KM
S
E+
[S][E]
ES
E+P
KM =
EI
E+P
Ki =
Ki
I
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
[ES]
[I][E]
B06 - Cinetica enzimatica
[EI]
- 102 -
51
Inibitori competitivi
• Senza inibitore
Vmax [S]
KM + [S]
v
v=
• Con inibitore
Vmax [S]
v=
KM ( 1 +
[I]
Ki
[S]
) + [S]
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 103 -
1/V
Inibitori competitivi
• Senza inibitore
KM
1
=
v
Vmax
1
[S]
+
1
Vmax
1/Vmax
-1/KM(app)
0
1/[S]
• Con inibitore
1
[I]
1
KM
1
=
(1+
)
+
v
Vmax
Ki
Vmax
[S]
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 104 -
52
Inibitori competitivi
SUBSTRATO
INIBITORE
• Sono molecole simili
al substrato
• Occupano lo stesso
sito di legame
SITO ATTIVO
DELL’INZIMA
SUBSTRATO ED
INIBITORE SI
LEGANO ALLO
STESSO SITO
PRODOTTI
IL LEGAME
DELL’INIBITORE
PREVIENE IL
LEGAME DEL
SUBSTRATO
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 105 -
Biosintesi del colesterolo
• Viene sintetizzato nelle cellule epatiche a partire da
acetil-CoA per formare 3-R-mevalonato.
O
H3C
S
CoA
H
S
O
S
S
H 3C
O
H3C
O
CoA
CoA
CoA
H
S
3-idrossi-3-metil
glutaril-CoA
HMG-CoA
CoA
OH
O
O
H3C
CoA
S
Tiolasi
O
Acetoacetil-CoA
I riduzione
II riduzione
NAPD+
NADPH + H+
O
OH
CH3
O
H
H
O
OH
NAPD+
OH
CH3
OH
S
H
CoA
Intermedio legato
all'enzima
3-R-mevalonato
H
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
CoA
NADPH + H+
HMG-CoA reduttasi
O
S
CH3
HMG sintasi
Acetil-CoA (Cn)
O
S
B06 - Cinetica enzimatica
CoA
- 106 -
53
HMG reduttasi EC 1.1.1.34
• È una glicoproteina di
membrana del reticolo
endoplamatico,
• Il suo peso molecolare è
di 97 kD,
• Il sito attivo è rivolto
verso il citoplasma.
• È anch’essa regolata dal
sistema protein chinasi.
HMG
CoA
NADP
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 107 -
HMG reduttasi EC 1.1.1.34
• Viene inibita dalle
statine, usate come
farmaci per ridurre
elevati livelli di
colesterolo.
Mevastatina
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 108 -
54
Inibitori competitivi
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 109 -
Inibitori non competitivi
• Agiscono legandosi in un sito diverso dal sito di legame
del substrato il quale può comunque legarsi.
• L’inibizione NON è rimossa aumentando la
concentrazione di S
KM
E+P
ES
E+S
Ki
KM
EI + S
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
[ES]
+I
+I
Ki
[S][E]
KM =
[I][E]
Ki =
ESI
B06 - Cinetica enzimatica
[I][ES]
=
[EI]
[ESI]
- 110 -
55
Inibitori non competitivi
• Senza inibitore
Vmax [S]
KM + [S]
v
v=
• Con inibitore
Vmax
(1+
v=
[I]
Ki
[S]
[S]
)
KM + [S]
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 111 -
1/V
Inibitori non competitivi
• Senza inibitore
KM
1
=
v
Vmax
1
[S]
+
1
Vmax
1/Vmax
• Con inibitore
-1/KM
0
1/[S]
[I]
1
[I]
1
KM
1
=
(1+
)
+
(1+
)
v
Vmax
Ki
Vmax
Ki
[S]
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
B06 - Cinetica enzimatica
- 112 -
56
Inibitori non competitivi
INIBITORE
SITO ATTIVO
DELL’INZIMA
• Sono molecole diverse
dal substrato, si
SITO INIBITORIO
legano ad un proprio (REGOLATORIO)
sito
• Ioni metallici (Cu++)
• Complessanti (EDTA)
• Modulatori
v.1.9.4 © gsartor 2001-2017
SUBSTRATO
SUBSTRATO ED
INIBITORE SI
LEGANO A
SITI DIVERSI
IN ASSENZA
DI INBITORE SI
FORMANO
I PRODOTTI
LA PRESENZA
DELL’INIBITORE
RIDUCE LA
VELOCITÀ DI
FORMAZIONE
DEL PRODOTTO
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- 113 -
Inibitori acompetitivi
• Agiscono legandosi e bloccando il complesso
enzima-substrato.
KM
E+S
[S][E]
E+P
ES
KM =
[ES]
+I
[I][ES]
Ki
Ki =
[ESI]
ESI
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57
Inibitori acompetitivi
v
• Senza inibitore
Vmax [S]
v=
KM + [S]
• Con inibitore
Vmax
[I]
(1+
Ki
v=
[S]
)
[S]
KM
(1+
[I]
Ki
+ [S]
)
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- 115 -
1/V
Inibitori acompetitivi
• Senza inibitore
KM
1
=
v
Vmax
1
[S]
+
1
Vmax
1/Vmax
• Con inibitore
0
-1/KM(app)
1
KM
1
=
+
v
Vmax
[S]
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1
Vmax
(1+
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[I]
Ki
1/[S]
)
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58
Riassumendo…
KM
• Inibizione
competitiva
[S][E]
KM =
E+P
ES
E+S
[ES]
+I
[I][E]
Ki =
Ki
[EI]
EI + S
[I][ES]
Ki' =
KM
• Inibizione non
competitiva
E+S
ES
+I
+I
[ESI]
E+P
Ki'
Ki
KM
EI + S
ESI
KM
E+S
• Inibizione
acompetitiva
E+P
ES
+I
Ki'
ESI
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- 117 -
…riassumendo
a = (1 +
[I]
Ki
)
a' = (1 +
[I]
Ki'
Tipo di inibizione
VMAXapp
KMapp
Nessuna
VMAX
KM
Competitiva
VMAX
aKM
Non competitiva
VMAX/a’
aKM /a’
Acompetitiva
VMAX /a’
KM /a’
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)
- 118 -
59
Inibitori irreversibili
Inibitore
Formula
Origine
Meccanismo
Ione cianuro
CN-
Mandorle
amare
Complessa gli ioni
metallici nelle
proteine
Sintetico
Inibisce gli enzimi
con serina nel sito
attivo
Sintetico
Come il DFP
Frutto del
calabar
Come il DFP
Diisopropil
fluorofosfato
(DFP)
CH3
H3C
CH3
F
P
O
O
O
CH3
Sarin
H3C
CH3
F
P
O
CH3
O
H
N
H3C
H3C
O
N
Fisostigmina
O
N
CH3
CH3
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Inibitori irreversibili
Inibitore
Parathion
Formula
O
C2H5
P
O
S
N-tosil-Lfenilalanina
clorometil
chetone
(TPCK)
C2H5
Meccanismo
Sintetico
(particolarmente attivo
su acetilcolinesterasi di
insetti)
NO2
Come il DFP
O
O
Sintetico
Reagisce con l’His57 della
chimotripsina
Penicillum
Notatum
Inibisce gli enzimi
della sintesi della
parete batterica
Cl
HN
S
O
R
O
O
HN
S
Penicillina
O
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Origine
N
CH3
CH3
CH3
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- 120 -
60
Attivatori
• Sono molecole che aumentano (o permettono) l’attività
enzimatica
– Protezione dell’enzima
• Glutatione
• Ioni metallici
– Attivazione per azione sulle subunità
Enzima inattivo + cAMP →
Subunità + Subunità
catalitica
regolatrice
– Azione proteolitica su proenzimi
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- 121 -
Attivatori
• Azione proteolitica su proenzimi
Tripsinogeno
+
Chimotripsinogeno
Enteropeptidasi
+
Tripsina
π-chimotripsina
Proelastasi
Procarbossipeptidasi
+
+
Elastasi
Carbossipeptidasi
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B06 - Cinetica enzimatica
+
α-chimotripsina
- 122 -
61
Effetti allosterici
• Un enzima allosterico è, in genere,
un oligomero con subunità
correlate.
• Gli effetti allosterici consistono nel
legame di un effettore ad un sito
diverso da quello del substrato con
conseguente variazione delle
proprietà cinetiche dell’enzima.
• L’effettore può essere lo stesso
substrato (effettori omotropici) o
diverso (effettori eterotropici).
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Sito
attivo
Sito
dell’effettore
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- 123 -
Effetto allosterico
• Un enzima allosterico è un
oligomero con subunità correlate la
cui attività (Km) viene influenzate
dal legame del substrato
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- 124 -
62
Effetti allosterici
• Il legame con l’effettore modifica (modula) le proprietà
di legame del substrato.
• La velocità dipende da [S] come una sigmoide.
K + [S]n
v
v=
Vmax [S]n
[S]
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n = indice di cooperatività (costante di Hill)
n = 1 nessuna cooperatività
n > 1 cooperatività positiva
n < 1 cooperatività negativa
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- 125 -
Effetti allosterici
• Il legame con l’effettore modifica (modula) le proprietà
di legame del substrato.
• La velocità dipende da [S] come una sigmoide.
K + [S]n
v
v=
Vmax [S]n
n = indice di cooperatività
[S]
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Emoglobina
B06 - Cinetica enzimatica
- 126 -
63
Vie metaboliche
• Una via metabolica è data da un insieme di reazioni
catalizzate da enzimi che si susseguono l’una all’altra.
• Le vie metaboliche sono regolate:
Inibizione da
prodotto
Attivazione da
substrato
Attivazione
compensatoria
A
B
A
B
A
D
C
E
D
B
C
E
D
E
P
H
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C
K
X
Y
Z
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Vie metaboliche ramificate
Inibizione
multivalente A
Inibizione
cooperativa
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A
B
C
B
E
F
G
K
X
Y
D
C
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E
F
G
K
X
Y
D
- 128 -
64
Vie metaboliche ramificate
Inibizione
cumulativa
Inibizione
di enzimi
multipli
A
B
B
A
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C
C
E
F
G
H
K
I
Z
X
Y
E
F
G
K
X
Y
D
D
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- 129 -
Catabolismo e anabolismo
C
A
B
S
E
F
X
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T
Z
Y
B06 - Cinetica enzimatica
- 130 -
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Regolazione genica
• Un’altra via con la quale viene regolata l’attività di uno o più
enzimi è attraverso l’induzione o la repressione genica della
sintesi proteica di quella proteina con attività enzimatica.
• Anche per gli enzimi esiste una sorta di omeostasi.
ENZIMA
SINTESI
mRNA
DEMOLIZIONE
AMINOACIDI
Induzione
Repressione
DNA
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- 131 -
Regolazione genica
• Un’altra via con la quale viene regolata l’attività di uno o più
enzimi è attraverso l’induzione o la repressione genica della
sintesi proteica di quella proteina con attività enzimatica.
• Anche per gli enzimi esiste una sorta di omeostasi.
ENZIMA
SINTESI
mRNA
DEMOLIZIONE
AMINOACIDI
Induzione
Repressione
DNA
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Crediti e autorizzazioni all’utilizzo
• Questo materiale è stato assemblato da informazioni raccolte dai seguenti testi di Biochimica:
– CHAMPE Pamela , HARVEY Richard , FERRIER Denise R. LE BASI DELLA BIOCHIMICA [ISBN 9788808-17030-9] – Zanichelli
– NELSON David L. , COX Michael M. I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER - Zanichelli
– GARRETT Reginald H., GRISHAM Charles M. BIOCHIMICA con aspetti molecolari della Biologia
cellulare - Zanichelli
– VOET Donald , VOET Judith G , PRATT Charlotte W FONDAMENTI DI BIOCHIMICA [ISBN 9788808-06879-8] - Zanichelli
• E dalla
–
–
–
–
consultazione di svariate risorse in rete, tra le quali:
Kegg: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes http://www.genome.ad.jp/kegg/
Brenda: http://www.brenda.uni-koeln.de/
Protein Data Bank: http://www.rcsb.org/pdb/
Rensselaer Polytechnic Institute:
http://www.rpi.edu/dept/bcbp/molbiochem/MBWeb/mb1/MB1index.html
• Il materiale è stato inoltre rivisto e corretto dalla Prof. Giancarla Orlandini dell’Università di Parma alla
quale va il mio sentito ringraziamento.
Questo ed altro materiale può essere reperito a partire da: http://www. gsartor.org/pro
• Il materiale di questa presentazione è di libero uso per didattica e ricerca e può essere usato senza
limitazione, purché venga riconosciuto l’autore usando questa frase:
Materiale ottenuto dal Prof. Giorgio Sartor
Università di Bologna
Giorgio Sartor
Ufficiale: [email protected]
Personale: [email protected]
Aggiornato il 07/03/2017 22:15:52
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