TESI STEFFANI LILIANA 2

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI MILANO
Facoltà di Scienze del Farmaco
Dipartimento di Scienze Farmacologiche e Biomolecolari
Corso di Dottorato di Ricerca in
SCIENZE ENDOCRINOLOGICHE E METABOLICHE
ciclo XXVI
Settori scientifico-disciplinari: BIO/09 – BIO/13 – MED/13
MODELLI SPERIMENTALI DI SOVRACCARICO
DIETETICO DI FERRO: EFFETTI CENTRALI E
PERIFERICI SU METABOLISMO E FUNZIONE
RIPRODUTTIVA
Tesi di dottorato presentata da:
Dott. Liliana STEFFANI
Matricola n. R09118
Tutor:
Chiar.mo Prof. Roberto C. MELCANGI
Coordinatore:
Chiar.mo Prof. Angelo POLETTI
Anno Accademico: 2012/2013
INDICE
1. RIASSUNTO ............................................................................................. 7
2.
INTRODUZIONE .................................................................................... 12
2.1 ASSE IPOTALAMO-IPOFISI-GONADI (ASSE HPG): ANATOMIA.........................12
2.1.1 Ipotalamo........................................................................................14
2.1.2 Ipofisi .............................................................................................16
2.1.2.1 Neuroipofisi................................................................................16
2.1.2.2 Adenoipofisi ...............................................................................17
2.1.2.3 Irrorazione sanguigna e sistema portale ipotalamo-ipofisario ............18
2.1.3 Gonadi ............................................................................................18
2.1.3.1 Testicolo ....................................................................................19
3. NEURONI GnRH-SECERNENTI ................................................................ 21
3.1 ORIGINE, SVILUPPO E MIGRAZIONE ...........................................................21
3.2 REGOLAZIONE DELLA MIGRAZIONE............................................................22
3.3 IL PEPTIDE GnRH .....................................................................................27
3.3.1 Forme molecolari di GnRH .................................................................28
3.3.2 Sintesi, secrezione e attività del GnRH.................................................29
3.4 REGOLAZIONE DELLA SECREZIONE DEL GnRH.............................................31
3.4.1 Secrezione pulsatile del GnRH: “GnRH pulse generator” .........................31
3.4.2 Kisspeptina: ruolo nei meccanismi di secrezione del GnRH .....................32
3.4.3 Neuroni KNDy: ipotetico ruolo nei meccanismi di secrezione del GnRH .....33
3.4.4 Pulsatilità intrinseca dei neuroni GnRH.................................................36
4. GONADOTROPINE: LH E FSH .................................................................. 38
4.1 REGOLAZIONE DIFFERENZIALE DELL’ESPRESSIONE GENICA DI LH E FSH IN
RELAZIONE ALLA FREQUENZA DI PULSATILITÀ DEL GnRH .............................39
4.2 VIE DI SEGNALE ATTIVATE DAL RILASCIO PULSATILE DEL GnRH ...................40
4.3 REGOLAZIONE TRASCRIZIONALE DELLE SUBUNITÀ DI FSH E LH ....................42
5. METABOLISMO PERIFERICO E CENTRALE DEL FERRO ............................ 44
5.1 FUNZIONI BIOLOGICHE DEL FERRO............................................................44
5.2 PROPRIETA’ CHIMICHE DEL FERRO.............................................................45
2 5.3 LOCALIZZAZIONE E CONCENTRAZIONE DEL FERRO......................................45
5.4 OMEOSTASI DEL FERRO A LIVELLO PERIFERICO ..........................................46
5.4.1 Assorbimento del ferro attraverso le cellule della mucosa intestinale........46
5.4.2 Trasporto del ferro in circolo ..............................................................48
5.4.3 Trafficking cellulare del ferro ..............................................................48
5.5 REGOLAZIONE DELL’OMEOSTASI CELLULARE DEL FERRO A LIVELLO
PERIFERICO ............................................................................................50
5.6 OMEOSTASI DEL FERRO NEL SISTEMA NERVOSO CENTRALE (SNC) ................52
5.6.1 Ingresso del ferro nel SNC .................................................................52
5.6.1.1 Barriere del SNC .........................................................................52
5.6.1.2 Trasporto del ferro attraverso la barriera emato-encefalica (BEE) ......53
5.6.1.3 Trasporto del ferro attraverso la barriera emato-liquorale (BEL) ........55
5.6.2 Espressione cerebrale dei geni associati al ferro ....................................57
5.7 REGOLAZIONE DELL’OMEOSTASI CELLULARE DEL FERRO NEL SNC .................60
6. TOSSICITA’ DEL SOVRACCARICO DI FERRO A LIVELLO CENTRALE......... 62
6.1 ACCUMULO FISIOLOGICO DEL FERRO NEL CERVELLO ...................................62
6.2 MECCANISMI DI TOSSICITÀ DA SOVRACCARICO DI FERRO A LIVELLO
CENTRALE ..............................................................................................63
6.2.1 Ferro e stress ossidativo ....................................................................64
6.2.2 Ferro e specie reattive dell’azoto ........................................................66
6.3 SUSCETTIBILITÀ DELLE CELLULE CEREBRALI ALLO STRESS OSSIDATIVO........66
6.4 ALTRI MECCANISMI DI TOSSICITA’ DEL SOVRACCARICO DI FERRO NEL SNC ...67
6.5 SINDROMI DA SOVRACCARICO DI FERRO ...................................................68
6.5.1 Sovraccarico di ferro primitivo ............................................................68
6.5.2 Sovraccarico di ferro secondario .........................................................68
6.6 PATOLOGIA DEL SISTEMA GnRH SECERNENTE: IPOGONADISMO....................70
6.6.1 Ipogonadismo ipogonadotropo associato a sovraccarico di ferro ..............74
7. SCOPO DEL LAVORO ............................................................................... 77
8. MATERIALI E METODI............................................................................. 80
8.1 REAGENTI ...............................................................................................80
8.2 ANIMALI .................................................................................................80
8.3 COLTURE CELLULARI ................................................................................81
8.4 DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO TISSUTALE E CELLULARE DI FERRO
3 TRAMITE SPETTROMETRIA DI ASSORBIMENTO ATOMICO ...............................82
8.5 SAGGIO DI VITALITA’ CELLULARE ..............................................................83
8.5.1 ATPlite™ 1step .................................................................................83
8.5.2 Contatore di cellule automatizzato LunaTM ...........................................84
8.6 ESTRAZIONE DI RNA TOTALE DA TESSUTI E DA CELLULE..............................84
8.6.1 Ipotalamo........................................................................................84
8.6.2 Ipofisi, Gonadi, cellule GN-11 e GT1-7 .................................................85
8.6.3 Quantizzazione spettrofotometrica dell’RNA totale .................................86
8.7 RETROTRASCRIZIONE – REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI
(RT-PCR; Reverse Transcription – Polymerase chain reaction).........................86
8.8 PCR QUANTITATIVA IN TEMPO REALE (qPCR; Real-time quantitative PCR) .......89
8.8.1 SYBR Green .....................................................................................89
8.8.2 TaqMan ...........................................................................................89
8.9 STUDIO DELLA MIGRAZIONE DELLE CELLULE GN-11 (CAMERA DI BOYDEN).....91
8.10 ESTRAZIONE DI PROTEINE DALL’IPOTALAMO E DALLE CELLULE GN-11 .........92
8.10.1 Ipotalamo ......................................................................................92
8.10.2 GN-11 ...........................................................................................93
8.11 SEPARAZIONE DELLA FRAZIONE PROTEICA CITOPLASMATICA DA
QUELLA NUCLEARE .................................................................................93
8.12 ANALISI WESTERN BLOT .........................................................................94
8.13 ANALISI IMMUNOCITOCHIMICA................................................................96
8.14 ANALISI STATISTICA DEI DATI ................................................................97
9. RISULTATI.............................................................................................. 98
9.1 MODELLI SPERIMENTALI: MESSA A PUNTO E CRITICITÀ ...............................98
9.1.1 Scelta del modello murino di sovraccarico marziale ...............................98
9.1.1.1 Fenotipo metabolico .................................................................. 100
9.1.1.2 Parametri morfometrici .............................................................. 101
9.1.2 Scelta del modello in vitro di sovraccarico marziale ............................. 104
9.2 QUANTIFICAZIONE DEL CONTENUTO CELLULARE DI FERRO......................... 105
9.2.1 Ipotalamo...................................................................................... 105
9.2.2 GN-11 e GT1-7 .............................................................................. 106
9.2.3 Ipofisi ........................................................................................... 106
9.2.4 Gonadi .......................................................................................... 106
9.3 TOSSICITÀ DEL FERRO A LIVELLO CELLULARE ........................................... 108
9.3.1 GN-11........................................................................................... 108
4 9.4 ESPRESSIONE GENICA DEL RECETTORE DELLA TRANSFERRINA (TfR),
DELLA FERRITINA H (FtH) E DI EPCIDINA .................................................. 110
9.4.1 Ipotalamo...................................................................................... 110
9.4.2 GN-11 e GT1-7 .............................................................................. 110
9.4.3 Gonadi .......................................................................................... 111
9.5 MODULAZIONE DEI GENI SENSIBILI AL FERRO
(TFR, FTH E, NELLE GONADI, EPCIDINA) ................................................... 111
9.5.1 Ipotalamo...................................................................................... 112
9.5.2 GN-11 e GT1-7 .............................................................................. 113
9.5.3 Gonadi .......................................................................................... 114
9.6 EFFETTO DELL'ACCUMULO MARZIALE SULLA CAPACITÀ MIGRATORIA
DELLE CELLULE GN-11 ............................................................................ 116
9.7 EFFETTO DEL SOVRACCARICO MARZIALE SULLA MODULAZIONE DEL
SIGNALING NELLE CELLULE GN-11 ........................................................... 119
9.8 VIE DI SEGNALE COINVOLTE NELL'INIBIZIONE FERRO-DIPENDENTE
DELLA CHEMOMIGRAZIONE DELLE CELLULE GN-11 ..................................... 121
9.9 EFFETTO DELL’ESPOSIZIONE A DOSI ECCESSIVE DI FERRO
SUL PATHWAY INFIAMMATORIO IN VIVO E NELLE CELLULE GN-11 ................ 123
9.9.1 Ipotalamo...................................................................................... 123
9.9.2 GN-11........................................................................................... 125
9.10 EFFETTO DELLA MANIPOLAZIONE DELLO STATO DEL FERRO SULLO
STRESS OSSIDATIVO E DEL RETICOLO ENDOPLASMATICO IN VIVO E
NELLE CELLULE GN-11 .......................................................................... 128
9.10.1 Ipotalamo .................................................................................... 129
9.10.2 GN-11 ......................................................................................... 130
9.11 EFFETTO DEL SOVRACCARICO MARZIALE SUI MECCANISMI
NEUROENDOCRINI COINVOLTI NEL CONTROLLO DELLA RIPRODUZIONE
E DEL COMPORTAMENTO ALIMENTARE .................................................... 132
9.11.1 Ipotalamo .................................................................................... 132
9.11.2 GN-11 e GT1-7 ............................................................................. 135
9.11.3 Ipofisi ......................................................................................... 136
9.12 EFFETTO DEL SOVRACCARICO DIETETICO DI FERRO SULLA MODULAZIONE
DEL SIGNALING NELL’IPOTALAMO........................................................... 137
10. DISCUSSIONE..................................................................................... 140
5 11. BIBLIOGRAFIA ................................................................................... 155
6 1.
RIASSUNTO
Il ferro rappresenta un metallo cardine nella complessa biochimica degli esseri viventi
poiché interviene come cofattore in processi biochimici fondamentali per l’organismo e
riveste un ruolo essenziale per il normale sviluppo e funzionamento del sistema
nervoso centrale (SNC). Tuttavia, l’accumulo nei tessuti di quantità eccessive di ferro
libero è potenzialmente tossico per l’ambiente cellulare poiché può catalizzare la
generazione e la propagazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) con conseguente
danno ossidativo a carico di lipidi di membrana, proteine e acidi nucleici. In diverse
condizioni patologiche quali diabete mellito di tipo 2 (T2D), sindrome metabolica
(MetS),
emocromatosi
ereditaria,
talassemie
e
sindrome
dismetabolica
da
sovraccarico di ferro (DIOS) è emerso un parallelismo tra perturbazione della funzione
metabolica e compromissione dell’asse riproduttivo con insorgenza d’ipogonadismo
prevalentemente ipogonadotropo (HH). In tali situazioni patologiche, il ferro è
l’elemento principale che perturba l’asse ipotalamo – ipofisario in modo dose –
dipendente.
Studi precedentemente condotti dal nostro gruppo di lavoro hanno evidenziato come il
sovraccarico dietetico di ferro (IED – “Iron Enriched Diet”) in topi C57BL/6J riproduca
la DIOS e influenzi negativamente il metabolismo glucidico e lipidico con un’azione
primaria a livello del tessuto adiposo viscerale (VAT), sede d’origine di insulino –
resistenza
(IR),
ma
anche
del
fegato,
probabile
sede
della
compromissione
dell’omeostasi lipidica [1].
Scopo principale di tale lavoro di tesi è stato lo studio della capacità del sovraccarico
marziale di compromettere, oltre alla già indagata funzione metabolica [1], anche
quella riproduttiva, unitamente all’analisi dei meccanismi molecolari alla base della
fisiopatologia dell’eccesso marziale. Tra le probabili sedi anatomiche oggetto della
perturbazione (asse HPG: ipotalamo – ipofisi – gonadi), la nostra attenzione si è
focalizzata prevalentemente sull’ipotalamo poiché, a differenza dell’ipofisi, il suo ruolo
primario ed esclusivo nell’insorgenza di HH non è stato ancora del tutto chiarito.
Poiché l’ipotalamo non è ovviamente esplorabile nell’uomo, per perseguire il nostro
scopo, ci siamo avvalsi di due modelli sperimentali in logica traslazionale: il modello
murino di DIOS già precedentemente caratterizzato a livello metabolico [1] e, come
ulteriore lente di ingrandimento, le cellule GN-11, rappresentative di neuroni GnRH
immaturi e migratori e le cellule GT1-7, neuroni maturi e GnRH secernenti.
Accanto alla caratterizzazione degli effetti centrali e periferici del sovraccarico
marziale in un modello murino adulto, abbiamo quindi indagato il potenziale
7 contributo dell’eccesso di ferro sui meccanismi molecolari e fisiologici (migrazione dei
neuroni GnRH dal placode olfattorio all’ipotalamo) che, durante la vita embrionale,
pongono le basi per l’acquisizione della corretta competenza riproduttiva in età adulta.
L’alimentazione di topi C57BL/6J con dieta IED ha determinato, a livello macroscopico,
un ridotto incremento ponderale, a cui ha sicuramente contribuito la diminuita
assunzione di cibo, e una riduzione nel peso e nel diametro maggiore testicolare.
Sebbene la dieta IED abbia comportato un accumulo marziale nel fegato e nel VAT
comparabile a quello dei pazienti affetti da DIOS, non ha aumentato lo specifico
contenuto di ferro nell’ipotalamo, come è emerso dall’analisi mediante spettrometria
di assorbimento atomico. Il sovraccarico alimentare di ferro non ha indotto
modificazioni nell’espressione genica ipotalamica del recettore della transferrina (TfR)
e della ferritina H (FtH), geni responsivi al ferro. Anche nei testicoli, nonostante si sia
registrato un incremento, seppur modesto, del contenuto marziale, l’analisi RT-qPCR
non ha mostrato variazioni nei livelli dell’mRNA di TfR, FtH e epcidina. Sebbene la
dieta IED non abbia comportato un accumulo centrale di ferro, si sono comunque
registrate variazioni nell’espressione ipotalamica di geni correlati a specifiche funzioni
biologicamente rilevanti in cui è riconosciuto il coinvolgimento di tale metallo. In
merito alla funzione riproduttiva, i topi IED, caratterizzati macroscopicamente da
atrofia gonadica, hanno mostrato un aumento nei livelli del trascritto ipotalamico del
GnRH (apparentemente in contrasto con le nostre aspettative di un HH) senza effetti
sull’espressione dell’mRNA di Kiss-1 e GPR54. La tendenza all’aumento, seppur in
modo non significativo, della trascrizione del GnRH è stata osservata anche nei
neuroni GnRH-secernenti in vitro (cellule GT1-7). Bisogna però tener presente che è
frequente la dicotomia tra espressione genica e proteica ipotalamica; inoltre
l’aumentata espressione del trascritto del GnRH potrebbe essere ascrivibile ad un
“effetto rebound” della ridotta secrezione del decapeptide. A conferma di tale
considerazione, si collocherebbe anche la tendenza alla riduzione dell’espressione
genica ipofisaria di LHβ. Ulteriori indagini, quali il dosaggio dei livelli sierici di LH, FSH
e testosterone libero, sono necessarie per definire l’effettiva sede anatomica della
disfunzione riproduttiva nell’asse HPG e i meccanismi fisiopatologici coinvolti. La
diminuzione dei livelli sierici di leptina, ascrivibile al ridotto incremento ponderale e
alla condizione di lipodistrofia osservata nel VAT dei topi IED, ha promosso uno stato
oressigenico centrale, come indicato dall’aumento dell’espressione genica ipotalamica
del neuropeptide Y (NPY) e dalla riduzione di quella della proopiomelanocortina
(POMC). Una condizione d’infiammazione ipotalamica ma non sistemica dopo IED è
suggerita
dall’incremento
dell’mRNA
di
TNFα
(“Tumor
Necrosis
Factor
α”)
8 esclusivamente nell’ipotalamo di topi IED, sebbene non vi siano modulazioni nel gene
per interleuchina-6 (IL-6). Analogamente al VAT e al fegato, la IED ha stimolato la
sintesi ipotalamica dell’mRNA di CHOP (C/EBP homologous protein) (risposta allo
stress
del
reticolo
endoplasmatico),
senza
però
modificare
quella
di
SOD2
(superossido dismutasi 2) (stress ossidativo) e lo splicing di XBP-1 (X-box binding
protein-1). L’analisi nell’ipotalamo del signaling associato al sovraccarico dietetico di
ferro si è incentrata sulle vie di segnale di ERK1/2 (Extracellular-Signal-Regulated
Kinase 1/2), di PI3K/Akt (Phosphatidylinositol 3-kinase) e di AMPK (5’-AMP Protein
Kinase).
Accanto
all’attivazione
della
via
di
AMPK,
abbiamo
registrato
una
stimolazione di quella di PI3K/Akt e un effetto neutrale su quella di ERK1/2. Tale
indagine è stata però condotta su ipotalami interi ed è quindi il risultato dei contributi
di diversi nuclei e tipi cellulari, neuronali o meno. Indagini future verteranno
sull’isolamento dei nuclei preposti al controllo della funzionalità riproduttiva per meglio
comprendere quali vie di segnale siano effettivamente coinvolte nella modulazione
dell’asse HPG da parte del ferro.
La disponibilità di modelli in vitro di neuroni ipotalamici immortalizzati, ovviamente
privi di barriera emato-encefalica (BEE), ci ha consentito di realizzare un fenotipo
estremo di sovraccarico marziale ipotalamico e, in particolare, di indagare i reali
meccanismi molecolari attivati dall’eccesso di ferro nei neuroni ipotalamici coinvolti
nella funzionalità riproduttiva. La condizione di sovraccarico marziale è stata indotta
dall’incubazione con il citrato di ammonio ferrico (FAC), una fonte di ferro ferrico
(Fe3+). L’analisi mediante spettrometria di assorbimento atomico ha rivelato come il
trattamento con FAC 200 µM, per un periodo di 24 ore, abbia aumentato il contenuto
marziale delle cellule GN-11 e GT1-7. Tale incremento, più sostenuto nelle GN-11
(circa 10 volte) rispetto alle GT1-7 (circa 5 volte), non ha indotto alterazioni nella
vitalità e nella morfologia delle GN-11 anche dopo aumento del dosaggio a 500 µM.
L’analisi RT-PCR ha confermato come l’assenza di tossicità sia ascrivibile alla
presenza, in entrambe le linee cellulari, dei meccanismi preposti alla captazione e
all’immagazzinamento
del
ferro
in
forma
sicura
e
non
reattiva
ovvero,
rispettivamente, il TfR e la FtH. L’aumento dell’espressione genica della FtH e la
contemporanea riduzione di quella del TfR, dopo trattamento con FAC 200 e 500 µM
per 24 ore, denotano la capacità delle cellule GN-11 e GT1-7 di attivare i meccanismi
necessari per proteggere l’ambiente intracellulare dalla tossicità dell’eccesso marziale.
Studi di chemomigrazione, condotti nelle cellule GN-11 mediante camera di Boyden,
hanno evidenziato l’effetto inibitorio di FAC, dose – (200 – 1000 µM per 1 - 24 ore) e
tempo – dipendente (24 – 72 ore con FAC 200 µM), sulla migrazione FBS-indotta delle
9 cellule GN-11. L’effettivo coinvolgimento di FAC nella riduzione della migrazione
stimolata da FBS è stato confermato dal ripristino della motilità basale delle GN-11
dopo co-trattamento per 24 ore con deferoxamina mesilato (DFO), uno specifico
chelante del ferro. Esperimenti di cinetica seguiti da analisi Western Blotting
dell’estratto proteico totale hanno evidenziato come il trattamento con FAC alla dose
di 200 µM per 5, 10, 20, 30, 60, 180 minuti e 24 ore moduli la fosforilazione (p) delle
vie di segnale di ERK1/2, PI3K/Akt e AMPK nelle cellule GN-11. In particolare,
pERK1/2 è aumentata nell’intervallo 5 – 30 minuti con un massimale a 20 minuti; Akt
è attivata a 10, 20 e 60 minuti; pAMPK diminuisce nell’intervallo 20 – 180 minuti e
l’effetto inibitorio si mantiene anche dopo 24 ore. Per valutare se le suddette vie di
segnale fossero effettivamente coinvolte nella riduzione della migrazione delle cellule
GN-11 indotta da FAC, è stata condotta un’altra serie di saggi di chemomigrazione in
presenza degli inibitori selettivi di MEK1/2 (U0126 10 µM), di PIK3/Akt (LY-294,002
10 µM) e di AMPK (composto C 10 µM) in associazione o meno con FAC alla dose di
200 µM. E’ emerso come tutte le suddette vie agiscano di per sé come segnali promigratori per le cellule GN-11; solo la via di PI3K/Akt contribuirebbe, in associazione
ad altre non ancora identificate, all’inibizione della chemomigrazione FBS-indotta da
parte di FAC. L’accumulo di ferro nei neuroni immaturi, conseguente al trattamento
con FAC alla dose di 200 µM per 24 ore, oltre a non compromettere la vitalità
cellulare, non ha promosso uno stato infiammatorio come indicato da: i) assenza di
traslocazione nucleare e di attivazione della subunità p65 del fattore di trascrizione
NF-kB,
evidenziata
tramite
analisi
Western
Blotting
delle
frazioni
proteiche
citoplasmatiche e nucleari di un unico campione e analisi in immunofluorescenza
(IFL); ii) invariata espressione genica dell’interleuchina-6 (IL-6) e del TNFα in RTqPCR. Solo aumentando il dosaggio di FAC a 500 µM si è ottenuto l’aumento
dell’mRNA di IL-6.
Per quanto concerne l’effetto di FAC alle dosi di 200 e 500 µM sui marker di stress
ossidativo e di risposta allo stress del reticolo endoplasmatico, si è osservato: i) un
aumento dose-dipendente dei livelli di mRNA di SOD2; ii) la mancata induzione della
sintesi di CHOP; iii) l’assenza di variazione nello splicing di XBP-1.
In conclusione, il sovraccarico dietetico di ferro in topi C57BL/6J riproduce il fenotipo
clinico e biochimico di pazienti affetti da DIOS in termini di modulazione dei parametri
associati al ferro, alterazione del metabolismo gluco-lipidico e, parallelamente,
compromissione della funzionalità riproduttiva. Sebbene i nostri risultati ci inducano
ad ipotizzare una condizione di HH, è necessario condurre ulteriori indagini per
identificare l’effettiva sede anatomica dell’asse HPG primariamente danneggiata
10 dall’eccesso marziale. L’ipotalamo appare protetto dal carico di ferro sistemico: le lievi
modificazioni osservate sono probabilmente un epifenomeno delle perturbazioni
marziali e metaboliche periferiche oppure derivano dall’effetto locale di mediatori
indiretti dell’azione del ferro. Dagli studi in vitro è emerso come dosi sovra-fisiologiche
di ferro si accumulino nelle cellule neuronali ipotalamiche e siano potenzialmente in
grado di compromettere i sistemi di difesa. In particolare, l’esposizione dei neuroni
GnRH immaturi in età pre-natale a dosi eccessive di ferro, che non compromettono la
vitalità cellulare, potrebbe perturbare il loro fisiologico processo di migrazione dal
placode olfattorio all’ipotalamo con induzione di HH terziario (ipotalamico). Se si
considerano le cellule GN-11 come modello di migrazione neuronale a prescindere dal
loro ruolo nella funzione riproduttiva, l’inibizione mediata dal ferro della migrazione
potrebbe essere estesa anche al processo di neurogenesi che si verifica in specifiche
aree cerebrali in età adulta.
11 2.
INTRODUZIONE
2.1. ASSE IPOTALAMO–IPOFISI–GONADI (ASSE HPG): ANATOMIA
La riproduzione è indispensabile per la perpetuazione della specie e, per tale ragione,
è soggetta alla fine regolazione di una complessa rete di segnali centrali e periferici,
che sono sensibili a numerosi fattori endogeni e ambientali. In particolare, il controllo
neuroendocrino della riproduzione si basa sulla dinamica interazione tra segnali che
originano da tre principali fonti:
1) l’ipotalamo, dove un piccolo gruppo di neuroni sparsi (circa 1000 nei mammiferi più
evoluti) sintetizza e secerne l’ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH);
2) l’adenoipofisi (ipofisi anteriore), in cui le cellule gonadotrope (meno del 10% di
tutte le cellule ipofisariche), sono stimolate dal GnRH a sintetizzare e rilasciare
l’ormone luteinizzante (LH) e l’ormone follicolo-stimolante (FSH), definiti con il
termine gonadotropine;
3) le gonadi, che oltre a generare i gameti a partire dalla pubertà, rispondono alle
azione trofiche delle gonadotropine con un aumentata sintesi e immissione in circolo
di steroidi sessuali e ormoni peptidici. A loro volta, gli ormoni gonadici modulano la
secrezione di GnRH e di gonadotropine mediante un meccanismo a feed-back
sull’ipotalamo e sull’ipofisi.
Tutti questi elementi costituiscono l’asse ipotalamo-ipofisi-gonadi (HPG), definito
anche asse gonadotropo (Figura 2.1).
Oltre alla suddetta regolazione dinamica in età adulta, gli elementi chiave dell’asse
HPG subiscono sostanziali modificazioni anatomiche e funzionali durante lo sviluppo
fetale nell’ambito del processo di differenziazione cerebrale sessuale e dopo la nascita
per lo sviluppo puberale e, in relazione alla specie, la senescenza riproduttiva.
La maturazione e la funzionalità del sistema riproduttivo sono strettamente correlati
con altre funzioni essenziali per l’organismo, quali la regolazione del peso corporeo e
l’omeostasi energetica, come testimoniato dalle complesse interazioni tra molteplici
segnali
neuroendocrini
che
controllano
sia
il
metabolismo
energetico
che
la
funzionalità riproduttiva. Evidenze di tale fenomeno si riscontrano in condizioni di
stress metabolico e sbilancio energetico, in cui si osservano anche alterazioni dello
sviluppo puberale e della fertilità oppure in patologie gonadiche o riproduttive
correlate a perturbazioni metaboliche gravi come nella sindrome dell’ovaio policistico
[2, 3, 4]. 12 Pinilla L et al. Physiol Rev 2012;92:1235-1316
Figura 2.1
Rappresentazione schematica dei principali elementi dell’asse neuroendocrino che
controlla la riproduzione: asse ipotalamo-ipofisi-gonadi (HPG). I neuroni GnRH ipotalamici, che
ricevono segnali transinaptici e gliali, rilasciano l’ormone GnRH nel sistema portale ipotalamoipofisario. Da qui il GnRH raggiunge le cellule gonadotrope dell’adenoipofisi dove promuove la
secrezione pulsatile delle gonadotropine LH e FSH che, a loro volta, stimolano la steroidogenesi e la
spermatogenesi nelle gonadi. La funzionalità dell’asse HPG è regolata da diversi segnali periferici,
quali gli steroidi sessuali, responsabili del controllo retroattivo: il testosterone prodotto dai testicoli
(T) svolge un’azione inibitoria sulla secrezione di GnRH (nell’ipotalamo) e/o delle gonadotropine
(nell’ipofisi) (meccanismo a feedback negativo); gli steroidi ovarici, soprattutto l’estradiolo (E2) e il
progesterone (P), veicolano segnali sia inibitori che stimolatori in base alla fase del ciclo ovarico.
Altri regolatori periferici dell’asse HPG sono gli ormoni metabolici quali la leptina, sintetizzata dal
tessuto adiposo bianco, (WAT) che ricopre un ruolo stimolatorio/permissivo sulla riproduzione. Tale
figura riporta anche i principali regolatori centrali dell’asse HPG. I fattori inibitori sono rappresentati
in rosso e comprendono: acido γ-aminobutirrico (GABA), peptidi oppiodi endogeni (EOP), dinorfina
(Dyn) e il peptide correlato a RF (RFRP). I segnali stimolatori, in blu, includono: Kiss1, glutammato
(Glu), noradrenalina (NE) e neurochinina B (NKB).
13 2.1.1
IPOTALAMO
In un cervello adulto dal peso medio di 1300 g, l’ipotalamo, costituito da cellule della
sostanza grigia, rappresenta solo 4 g di tessuto. Tale organo si localizza nella porzione
ventrale del diencefalo e contribuisce a formare le pareti laterali del terzo ventricolo.
Visto dalla sua base, l’ipotalamo si estende dal chiasma ottico ai corpi mammillari, con
al centro l’eminenza mediana e il peduncolo ipofisario. Più precisamente, il confine
superiore, che lo separa dal talamo, è segnato da un solco poco profondo, il solco
ipotalamico.
Posteriormente,
l’ipotalamo
si
continua
gradatamente
nel
grigio
periventricolare e tegmentale del mesencefalo. Comunque, è consuetudine definire il
margine posteriore dell’ipotalamo come il piano ventrale passante caudalmente ai
corpi mammillari, due piccoli rilievi pari sulla superficie basale dell’encefalo. Il confine
anteriore dell’ipotalamo corrisponde a un piano verticale diretto dal forame di Monro
alla parte media del chiasma ottico. Il limite inferiore è delimitato da una sottile
parete a forma d’imbuto, il tuber cinereum, che si estende verso il basso nel
peduncolo ipofisario e nel processo infundibulare della neuroipofisi.
È una delle strutture filogeneticamente più antiche e primitive del sistema nervoso
centrale.
L’ipotalamo ha un’organizzazione strutturale molto complessa poiché è composto da
una gran varietà di neuroni, di diverse dimensioni, raccolti in nuclei ben definiti o
sparsi in tutto il tessuto nervoso. I nuclei, ciascuno con un proprio pattern di
connessioni e funzioni e strettamente interconnessi tra loro, hanno la funzione di
produrre e rilasciare i vari fattori coinvolti nella modulazione della sintesi e della
secrezione di ormoni dall’ipofisi anteriore. Dal punto di vista funzionale, in direzione
rostro-caudale, l’ipotalamo può essere suddiviso in tre regioni principali:
1) anteriore, rostrale o sopraottica a livello del chiasma ottico
2) intermedia o tuberale in corrispondenza del tuber cinereum
3) posteriore, caudale o mammillare a livello dei corpi mammillari
L’ipotalamo anteriore comprende:
l’area preottica (POA) mediale e laterale, l’area ipotalamica anteriore, i nuclei
sopraottico,
paraventricolare
(PVN),
soprachiasmatico
e
parvocellulare
periventricolare. Il PVN riceve numerosi input da altre aree o nuclei ipotalamici, quali
il soprachiasmatico e l’arcuato, ed in esso coesistono due tipi cellulari. Il primo
controlla il sistema nervoso autonomo e regola le vie efferenti simpatiche e
parasimpatiche che innervano gli organi viscerali. Il secondo tipo cellulare è costituito
dai neuroni neurosecretori, che modulano la secrezione ormonale ipofisaria. A sua
volta, quest’ultima tipologia di cellule si suddivide in due categorie. La prima è quella
14 dei neuroni neurosecretori magnocellulari, presenti anche nel nucleo sopraottico, i cui
assoni si estendono attraverso il peduncolo ipofisario fino al lobo posteriore dell’ipofisi
(neuroipofisi), dove rilasciano i neuroormoni ossitocina e vasopressina (ADH, ormone
antidiuretico) direttamente nel circolo ematico. Tali assoni costituiscono il tratto
sopraottico-paraventricolo-ipofisario. La seconda categoria comprende i neuroni
neurosecretori parvocellulari, i cui assoni terminano con bottoni sinaptici a livello dei
capillari dell’eminenza mediana dove secernono gli ormoni ipofisiotropi. Tali ormoni
scorrono nel sistema portale ipotalamo-ipofisario dei vasi lunghi, raggiungendo le
rispettive cellule bersaglio nel lobo anteriore dell’ipofisi (adenoipofisi). Il PVN regola
quindi le condizioni generali dell’organismo, quali il volume e la composizione dei fluidi
corporei, la crescita corporea, la riproduzione e la risposta allo stress, stimolando il
sistema nervoso autonomo e inducendo il rilascio di diversi ormoni dall’adenoipofisi.
La POA si estende trasversalmente all’interno della regione anteriore e riveste un
ruolo cruciale nel controllo dell’asse riproduttivo sia nell’uomo che nei roditori. In tale
area sono infatti presenti i neuroni secernenti GnRH, i cui assoni rilasciano il
decapeptide GnRH nei capillari dell’eminenza mediana, da dove tale ormone
raggiunge le cellule gonadotrope dell’ipofisi anteriore mediante il sistema portale
ipotalamo-ipofisario. Il nucleo soprachiasmatico, situato subito sopra al chiasma
ottico, riceve l’innervazione diretta dalla retina. Tale nucleo svolge il ruolo di “orologio
biologico” dell’organismo regolando alcune funzioni che variano, in relazione al ciclo
sonno-veglia, in diversi momenti della giornata (temperatura corporea, secrezione
ormonale, fame) o nell’arco di più giorni (ciclo mestruale) secondo un ritmo
circadiano.
La regione intermedia dell’ipotalamo è comunemente suddivisa in due
sezioni, mediale e laterale, da un piano passante per il fornice. La parte mediale
comprende l’area ipotalamica dorsale (DHA), il nucleo infundibulare o arcuato (ARC),
il nucleo ventromediale (VMN) e il nucleo dorsomediale (DMN), mentre la porzione
laterale è costituita dall’area ipotalamica laterale (LHA). I neuroni di ARC, VMN e DMN
sono le componenti più importanti di tale regione ipotalamica e i loro assoni si
proiettano fino ai capillari dell’eminenza mediana. L’ARC, situato lateralmente alla
porzione inferiore del terzo ventricolo, è di notevole importanza per il controllo
dell’asse riproduttivo poiché in esso si sintetizzano diversi ormoni, neuropeptidi e
amine, che intervengono nella regolazione dell’asse HPG. L’LHA e il VMN hanno ampie
connessioni nervose con il tronco encefalico e il telencefalo e svolgono ruoli opposti ed
integrativi per il controllo del peso corporeo. In particolare, LHA invia segnali nervosi
15 parasimpatici agli organi periferici agendo come centro della fame mentre il VMN è
coinvolto nell’innervazione simpatica fungendo da centro della sazietà.
L’ipotalamo posteriore è formato dall’area ipotalamica posteriore (PHA) e dai
corpi mammillari. I corpi mammillari costituiscono il nucleo più importante della
regione caudale e le loro funzioni endocrine e autonomiche sono poco conosciute. Si
ritiene che svolgano un ruolo nella memoria [5, 6, 7].
2.1.2
IPOFISI
L’ipofisi, o ghiandola pituitaria, situata entro la scatola cranica alla base dell’encefalo,
è una struttura neuroendocrina con un diametro massimo di circa 1,5 cm e dal peso di
0,4 – 1 g. Nella sua parte distale, è appoggiata sopra la sella turcica dello sfenoide
mentre, nella porzione prossimale, è collegata alla base del diencefalo, ovvero
all’ipotalamo, mediante il peduncolo ipofisario.
L’ipofisi è una ghiandola composita poiché è formata da due lobi differenti per origine
embrionale, per struttura e per funzione [8,9]. La prima, di derivazione epiteliale, è
definita ipofisi anteriore o adenoipofisi, la seconda invece, una formazione nervosa
dipendente dall’ipotalamo, è denominata ipofisi posteriore o neuroipofisi. Le due
porzioni sono strettamente legate in modo da costituire un unico organo.
2.1.2.1
Neuroipofisi
Durante lo sviluppo embrionale, origina da un’invaginazione dell’ipotalamo ventrale e
del terzo ventricolo dell’ectoderma neurale che si accresce verso il basso formando un
diverticolo [6]. E’ composta dall’eminenza mediana, che la collega all’ipotalamo, dal
peduncolo ipofisario o tronco/processo infundibolare e della pars nervosa. L’unione di
pars infundibolare e pars nervosa forma il lobo posteriore. Le tipologie cellulari che
costituiscono la neuroipofisi sono fondamentalmente tre:
•
una componente vascolare rappresentata da capillari sanguigni fenestrati;
•
una componente nervosa costituita da un intreccio di fibre nervose amieliniche. Si
tratta dei terminali distali degli assoni dei neuroni magnicellulari dell’ipotalamo
(fascio sopraottico-paraventricolo-ipofisario) che discendono compatti e paralleli
lungo il peduncolo e le cui terminazioni assoniche giungono a contatto con i
capillari fenestrati nei quali riversano gli ormoni vasopressina e ossitocina. Tali
peptidi, prodotti a livello dei pirenofori dei neuroni ipotalamici, scorrono lungo il
fascio di fibre nervose, legati ad una proteina di trasporto, la neurofisina, sotto
16 forma di gocce o rigonfiamenti (corpi di Herring), intensamente colorabili con
metodi specifici.
•
una componente gliale modificata formata da cellule (pituiciti) con lunghi
prolungamenti citoplasmatici la cui funzione principale è quella di servire da
sostegno per la componente nervosa e vascolare.
2.1.2.2
Deriva
Adenoipofisi
embriologicamente
dalla
tasca
di
Rathke,
un’evaginazione
ectodermica
dell’orofaringe che migra fino a raggiungere l’adenoipofisi [6]. E’ composta da tre
sezioni: la pars tuberalis,
collocata nella zona più prossima all’ipotalamo, avvolge
parzialmente il peduncolo ipofisario della neuroipofisi, è molto vascolarizzata e non
secerne ormoni; la pars distalis, appoggiata sopra la sella turcica dello sfenoide; la
pars intermedia a contatto con il lobo posteriore e contenente cellule produttrici
dell’ormone melanostimolante (MSH).
La pars distalis è costituita da nidi e cordoni di cellule parenchimali, circondati da
capillari sinusoidi fenestrati, attraverso cui giungono una serie di ormoni ipotalamici
che regolano la sintesi e la secrezione ormonale dai differenti tipi cellulari della pars
distalis. Un delicato stroma reticolare sostiene il parenchima endocrino. Mediante
esami istologici, istochimici e ultrastrutturali, si distinguono diversi tipi cellulari:
•
le cellule cromofile o granulari, che presentano nel citoplasma granuli di
secrezione, differenti per morfologia, dimensioni e distribuzione e contenenti
ormoni glicoproteici. Sulla base dell’affinità tintoriale per le colorazioni più
semplici, tali cellule secernenti sono a loro volta distinte in:
•
acidofile comprendenti le cellule somatotrope produttrici dell’ormone della crescita
o somatotropo (GH) e le cellule lattotrope che sintetizzano la prolattina o ormone
luteotropo (PRL);
•
basofile
di
cui
fanno
adrenocorticotropo
parte
(ACTH),
le
le
cellule
cellule
corticotrope
tireotrope
che
produttrici
dell’ormone
sintetizzano
l’ormone
tireotropo o tireostimolante (TSH) e le cellule gonadotrope da cui originano le
gonadotropine ovvero l’ormone follicolostimolante (FSH) e l’ormone luteinizzante
(LH).
•
le cellule cromofobe o agranulari, costituite da cellule prive di granuli di secrezione
e quindi non colorabili con i comuni coloranti istologici. Si tratta di cellule che
hanno già scaricato i propri ormoni nel sangue (cellule cromofile degranulate) al
momento del prelievo dell’organo o giovani cellule di riserva non ancora
differenziate e incapaci di sintetizzare ormoni.
17 •
le cellule follicolo-stellate, non secretorie e con funzione sconosciuta.
2.1.2.3
Irrorazione sanguigna e sistema portale ipotalamo–
ipofisario
Il sistema portale ipotalamo – ipofisario (vasi venosi tra due letti capillari) è un
distretto vascolare che permette all’ipotalamo di controllare la secrezione ormonale
dall’ipofisi anteriore senza connessioni nervose ma mediante ormoni ipotalamici RH
(ormoni di rilascio o liberine) e IH (ormoni inibitori o statine) che raggiungono
direttamente l’adenoipofisi.
L’ipofisi riceve sangue arterioso da due arterie ipofisarie superiori e da due arterie
ipofisarie inferiori. Le superiori si ramificano in un letto capillare nell’eminenza
mediana dell’ipotalamo, dove i neuroni dei nuclei parvicellulari rilasciano i propri
ormoni. La rete capillare dell’eminenza mediana si converte quindi nelle vene portali
lunghe del sistema portale ipotalamo – ipofisario che drenano il peduncolo ipofisario e
raggiungono l’adenoipofisi. In tale distretto, le vene portali lunghe si aprono in
un’altra rete di capillari o sinusoidi (rete mirabile venosa), dove gli ormoni ipotalamici
inducono (RH) o inibiscono (IH) il rilascio di ormoni dalle cellule endocrine dell’ipofisi
anteriore. Questo secondo letto capillare si converte infine in strutture venose di
drenaggio
che
raggiungono
la
circolazione
sistemica
e
veicolano
gli
ormoni
dell’adenoipofisi ai rispettivi tessuti bersaglio.
La neuroipofisi è irrorata direttamente da ramificazioni delle arterie ipofisarie inferiori
che raggiungono poi il peduncolo ipofisario. Nel lobo posteriore, tali arteriole formano
un sistema di capillari sui quali terminano gli assoni dei neuroni magnicellulari. Da qui
il sangue raggiunge le vene di drenaggio e quindi la circolazione sistemica e le cellule
bersaglio [5].
2.1.3
GONADI
Le strutture anatomiche e i meccanismi di controllo del sistema riproduttivo
assicurano la sopravvivenza della specie umana. L’apparato riproduttivo è composto
nei due sessi da strutture di origine embriologica comune, i cui abbozzi (dotti del Wolff
per il maschio e dotti del Müller per la donna) sono entrambi presenti nell’embrione
nelle fasi precoci dello sviluppo ed evolvono negli organi specifici di uno dei due sessi
in risposta a segnali differenziativi dipendenti dal sesso cromosomico. Gli organi
18 riproduttivi sono composti dalle gonadi (testicolo e ovaio), dalle strutture genitali
interne e dalle strutture genitali esterne.
Le gonadi sono le unità funzionali del sistema riproduttivo. Sono ghiandole sessuali
preposte ad una duplice funzione: 1) la gametogenesi, ovvero la generazione e il
rilascio dei gameti maturi (spermatozoo e ovulo) a partire da cellule germinali; 2) la
steroidogenesi, ovvero la sintesi e la secrezione di ormoni che regolano anche la
produzione di tali gameti [10].
In questa tesi sarà presa in considerazione solo la gonade maschile poichè gli studi in
vivo da noi condotti hanno previsto solo topi maschi.
2.1.3.1
Testicolo
Il testicolo (o didimo) è la gonade maschile ed è organizzato schematicamente in due
differenti compartimenti cellulari [11]:
•
il compartimento interstiziale comprendente le cellule steroidogenetiche o del
Leyding o interstiziali, i macrofagi, i linfociti, i fibroblasti dello stroma e le cellule
endoteliali [11]. Mediante l’utilizzo di vie biosintetiche comuni tra loro e con le
cellule della corticale del surrene, le cellule del Leyding sono responsabili della
sintesi di un gruppo di steroidi denominati globalmente androgeni (testosterone,
diidrotestosterone e androstenedione). La biosintesi degli steroidi testicolari è
stimolata soprattutto dall’LH adenoipofisario che si lega al proprio recettore situato
sulla membrana delle cellule del Leyding, attivando il signaling adenilato
ciclasi/cAMP/PKC (protein kinase C). La fosforilazione della PKC attiva numerosi
bersagli della cascata enzimatica della steroidogenesi con conseguente incremento
della sintesi degli androgeni.
•
il compartimento tubulare in cui coesistono le cellule nutrici o del Sertoli, le cellule
germinali o i gameti (spermatozoi) che insieme costituiscono l’epitelio seminifero e
le cellule peritubulari [11]. Le cellule del Sertoli costituiscono la parete dei tubuli
seminiferi, entro cui avviene la maturazione e il trasporto dei gameti e fungono
quindi da sostegno alle cellule germinali [12]. L’epitelio seminifero presenta una
distribuzione cellulare molto organizzata che subisce modificazioni cicliche nelle
varie
fasi
del
principalmente
ciclo
spermatogenico
coinvolte
[13]. Due tipologie di segnali sono
nell’attivazione
e
nel
mantenimento
della
spermatogenesi: segnali endocrini (fondamentalmente l’FSH adenoipofisario) e
paracrini (soprattutto il testosterone sintetizzato nelle cellule del Leyding sotto
stimolazione dell’LH). Tali segnali agiscono prevalentemente sulle cellule del
19 Sertoli che, con un meccanismo paracrino, sovrintendono alla corretta maturazione
dei gameti [14]. Le cellule del Sertoli inoltre producono l’inibina, un ormone
proteico il cui ruolo sembra essere l’inibizione specifica dell’FSH. Le cellule
peritubulari, localizzate lungo il perimetro dei tubuli seminiferi, sono in contatto
con la membrana basale delle cellule del Sertoli [11] dove, oltre a fornire sostegno
strutturale, partecipano al controllo paracrino degli altri elementi cellulari del
testicolo [15].
Gli androgeni gonadici controllano quindi la secrezione ipotalamica del GnRH
(feedback negativo lungo), il rilascio ipofisario delle gonadotropine (feedback negativo
corto), la funzionalità delle cellule del Sertoli (e indirettamente la maturazione dei
gameti), lo sviluppo, il trofismo e la funzionalità di tutto il sistema riproduttivo. Questi
ormoni,
inoltre,
sono
responsabili
della
comparsa
in
epoca
puberale
e
del
mantenimento nell’adulto delle caratteristiche sessuali secondarie che determinano il
fenotipo maschile.
Tra le distinte popolazioni cellulari testicolari opera un complesso sistema d’interazioni
paracrine costituito da un numero molto elevato di segnali, che comprendono
citochine, fattori di crescita, neuropeptidi e ormoni. Pertanto, le funzioni testicolari
dipendono non solo dalla regolazione endocrina da parte di segnali di diversa origine
(ipofisaria e altro) ma anche dalle interazioni dinamiche tra le diverse popolazioni
cellulari testicolari mediante segnali prodotti localmente.
20 3.
3.1
NEURONI GnRH-SECERNENTI
ORIGINE, SVILUPPO E MIGRAZIONE
Cellule immunoreattive per il GnRH sono state identificate nei placodi olfattivi di
embrioni di diverse specie, suggerendo che tali strutture embrionali primitive, da cui
deriva l’epitelio olfattivo, siano il sito d’origine dei neuroni GnRH [16]. Ne consegue
che tali neuroni debbano migrare prima di assumere la loro definitiva localizzazione
nell’ipotalamo. Durante lo sviluppo embrionale, dall’invaginazione dei placodi olfattivi
si formano due cavità separate dal setto nasale, dalle quali origina l’organo vomeronasale. I neuroni GnRH derivano dall’epitelio della parte mediale del placode olfattivo,
sito d’origine anche dei nervi olfattorio, vomero-nasale e terminale, oltre che di una
popolazione di cellule gliali. I nervi olfattori originano dalla porzione laterale
dell’epitelio del placode e terminano nel bulbo olfattorio principale. Il nervo vomeronasale segue il percorso degli olfattori ma raggiunge il bulbo olfattorio accessorio. Il
nervo terminale, un nervo cranico, corre, assieme al vomero-nasale e mediale agli
olfattori, attraverso il setto nasale e la lamina cribrosa dell’etmoide, da dove penetra,
insieme a branche dell’arteria cerebrale anteriore, nel proencefalo medio-basale, fino
ai nuclei del setto e della zona preottica.
Durante lo sviluppo embrionale di numerosi vertebrati quali il topo, il ratto [17, 18], la
rana, la tartaruga, il delfino, la balena, il maiale, il pollo [19, 20], la scimmia [21] e
l’uomo [22] è stata osservata la migrazione dei neuroni GnRH dalla parte mediale del
placode olfattorio al proencefalo, in direzione rostro-caudale lungo gli assoni dei nervi
vomero-nasale e terminale [23, 24]. Tali nervi fungono da guida per la migrazione dei
neuroni GnRH verso l’encefalo e in mancanza di un “ponte”, formato da tali nervi, tra
la cavità nasale ed il proencefalo [23] non si osservano neuroni GnRH-immunoreattivi
nell’ipotalamo. Una volta attraversata la regione del piatto cribriforme, una regione di
confine tra naso ed encefalo, i neuroni GnRH seguono un sottotipo di assoni olfattivi
che divergono verso il proencefalo basale ed infine dirigono i propri assoni verso
l’organo vascoloso della lamina terminale e quindi nell’eminenza mediana.
Appare evidente come i fattori in grado di modulare l’organizzazione dei nervi
olfattorio, vomero-nasale e terminale possano influenzare anche la migrazione dei
neuroni GnRH [25, 26], che, a loro volta, devono interpretare diversi segnali
ambientali per potersi muovere, inizialmente, nel compartimento nasale e, infine, per
dirigersi centralmente nel proencefalo.
21 Nel topo, al giorno 11 di vita embrionale (E11), si osservano cellule GnRHimmunoreattive, con una morfologia ovale o fusiforme, nell’epitelio della parte
mediale del placode olfattorio, in corrispondenza del nascente organo vomero-nasale.
Al giorno E11.5, si assiste alla migrazione dei primi neuroni GnRH-immunoreattivi
dall’epitelio olfattorio, contemporaneamente all’allungamento dei nervi terminale e
vomero-nasale. Ai giorni E12 ed E13, i neuroni GnRH-secernenti a morfologia
polarizzata sono disposti uno dietro l’altro a formare una sorta di catena diretta verso
il setto nasale, che, al giorno E14 entra nel proencefalo medio-basale caudalmente ai
bulbi olfattori in via di sviluppo. Il percorso di migrazione dal naso al proencefalo da
E11 a E14 è di circa 1320 µm. L’aumento della presenza di neuroni GnRHimmunoreattivi nel setto e successivamente nell’area preottica e nell’ipotalamo tra
E14 e E20 indica la fine del processo di migrazione (Figura 3.1) [23].
Terzo Ventricolo
Ventricolo Laterale
Proencefalo
Bulbo olfattorio
Ganglio
terminale
Placode olfattorio
mediale
Neuroni GnRH-secernenti
Schwanzel-Fukuda, M and Pfaff, D.W. Experientia, 1990;46(9):956-52
Figura 3.1
Rappresentazione schematica del percorso di migrazione dei neuroni GnRH in un feto
murino di 14 giorni.
3.2
Lo
REGOLAZIONE DELLA MIGRAZIONE
sviluppo
dell’intero
SNC
e,
in
particolare,
della
componente
riproduttiva
ipotalamica, necessita del processo di migrazione cellulare. Da un punto di vista
funzionale, la migrazione consente l’identificazione di specifici neuroni, la definizione
delle loro proprietà funzionali e l’individuazione delle connessioni che stabiliranno nelle
successive fasi di sviluppo.
In generale, per migrazione s’intende il movimento delle cellule dalle zone di origine e
proliferazione ai siti definitivi di differenziamento e specializzazione funzionale. Tale
22 processo si articola lungo percorsi specifici, in precisi periodi di tempo e con una
sequenza temporale definita e termina solo quando ogni singolo neurone ha assunto il
proprio corretto posizionamento in un determinato sito anatomico dove instaurerà
connessioni sinaptiche fondamentali per le proprie funzioni fisiologiche [27]. Esistono
due tipologie di migrazione, che si differenziano per direzionalità e modalità di
orientamento del movimento cellulare. La prima, definita migrazione radiale, è il
movimento che procede dalla superficie ventricolare verso quella piale (in-out) ed è
resa possibile, generalmente, dall’interazione glia-neuroni (migrazione gliofilica). La
seconda, conosciuta come migrazione tangenziale, avviene parallelamente alla
superficie dell’encefalo ed è, in genere, una migrazione neurofilica, cioè prevede
l’adesione specifica dei neuroni su fasci di assoni [28]. Tale meccanismo consente la
formazione degli strati della corteccia cerebrale, cerebellare e dell’ippocampo [29].
Anche i neuroni GnRH raggiungono la loro localizzazione definitiva nell’ipotalamo
tramite migrazione tangenziale neurofilica e, data la loro origine esterna al SNC,
costituiscono un ottimo modello per lo studio dello sviluppo neuronale, dei meccanismi
e delle molecole coinvolte in questo tipo di migrazione.
Il processo migratorio dei neuroni GnRH è scandito dal susseguirsi, in tempi ben
definiti, di 3 fasi fondamentali:
1) spostamento attraverso il compartimento nasale;
2) attraversamento della regione del piatto cribriforme (una zona di confine tra naso
e encefalo);
3) migrazione verso il proencefalo basale con invio degli assoni nell’eminenza
mediana.
Il ruolo guida delle fibre olfattorie periferiche in tale processo è emerso dall’evidenza
che variazioni nella disposizione di tali fibre si ripercuotono anche su quella dei
neuroni GnRH [25, 26, 30]. Sebbene i meccanismi e i segnali molecolari in grado di
modulare la migrazione e di facilitare il passaggio dei neuroni GnRH dalla regione
nasale all’encefalo siano ancora poco conosciuti, negli ultimi anni è stato riconosciuto
il coinvolgimento di numerosi fattori (Tabella 3.1) [31].
23 MOLECOLE
SECRETE
GABA
NOREPINEPHRINE AND SEROTONIN
CHOLECYSTOKININ
FGF
NETRIN-1
Gas-6
HEPATOCYTE GROWTH FACTOR
BRAIN-DERIVED NEUROTROPHIC FACTOR-1
STROMAL-DERIVED FACTOR-1
VEGF
PROTEINE DI
SUPERFICIE
GABA A RECEPTOR
GLUTAMATE RECEPTOR
cMET (receptor for hepatocyte growth factor)
EPHRIN A-5 TYROSINE KINASE
FGFR
NOREPINEPHRINE AND SEROTONIN
RECEPTORS
CHOLECYSTOKININ RECEPTOR
Ark (adesion related kinase)
DCC (receptor for netrin-1)
NELF (nasal embryonic LHRH)
ANOSMIN
FATTORI
NUCLEARI
Oct1, Dlx, Msx, NSCL2, Ebf2, GATA4, SCIP,
Brn2, Pax6, AP2
Tabella 3.1 Geni e proteine che regolano lo sviluppo e la migrazione dei neuroni GnRH.
E’ stato ipotizzato che ciascuna fase del processo migratorio sia controllata da specifici
fattori la cui espressione avviene solo in precise finestre temporali e con una specifica
distribuzione regionale. Le molecole di adesione sfruttate dai neuroni GnRH per
muoversi lungo gli assoni dei nervi vomero-nasale e terminale potrebbero essere
espresse solo nella fase attiva di migrazione ed essere poi spente quando i neuroni si
distaccano dagli assoni per acquisire la loro posizione finale nell’ipotalamo. E’ noto
come i neuroni GnRH siano provvisti di per sé delle proteine citoscheletriche e delle
funzioni motorie necessarie per migrare, ma non è ancora chiaro quali molecole
24 stimolino tale apparato migratorio nelle diverse tratte del cammino verso l’ipotalamo.
Inoltre, tali neuroni dovrebbero essere in grado di modulare l’espressione recettoriale
per specifiche chemochine e sostanze chemoattrattrici, distribuite secondo un
gradiente di concentrazione, in funzione del tipo presente lungo il cammino in un dato
momento.
Un altro aspetto da chiarire è l’identificazione di quali molecole regolino la
determinazione dei fenotipi dei neuroni GnRH. Alcuni lavori supportano l’esistenza di
diversi
fattori
di
trascrizione,
la
cui
espressione
spazio-temporale
potrebbe
contribuire, almeno in parte, all’avvio di programmi genetici. Di questi fattori, alcuni
appaiono presenti prima che l’espressione di GnRH possa essere rilevata in modo
significativo (OTX-1 e -2 [32, 33], Pax-6 [34], Eya-1 e -2 [35], six-3 [36]), altri invece
sono espressi proprio dai neuroni GnRH (Olf-1 [37], GATA-4 [38], AP-2a [39], Ebf-2
[40]).
Anche l’esatto percorso seguito dai neuroni GnRH è ancora oggetto di studio. Il
tentativo di utilizzare una serie di molecole espresse lungo i nervi olfattori come
markers per tracciare la via migratoria dei neuroni GnRH non ha portato ad alcuna
conclusione. Purtroppo, nessuna delle molecole analizzate è risultata esclusiva del
percorso specifico dei neuroni GnRH. La possibilità di marcare gli assoni olfattori, che
proiettano verso i bulbi olfattori principali e accessori [41], con un anticorpo antiperiferina, una proteina associata ai filamenti intermedi [42], e l’osservazione che i
neuroni GnRH sono in grado di migrare su fibre periferina-positive sembra indicare
che:
•
i neuroni GnRH possiedano una motilità intrinseca o controllata da molecole
chemotattiche, a corto raggio di diffusione, prodotte localmente lungo la via di
migrazione e non in altre aree del SNC;
•
le molecole di adesione giocano un ruolo chiave nei meccanismi molecolari che
controllano la migrazione dei neuroni GnRH nelle regioni nasali.
I meccanismi che controllano lo sviluppo e la migrazione dei neuroni GnRH lungo la
via di fibre periferina-positive che si estende bilateralmente in direzione caudale verso
l’eminenza mediana non sono ancora noti ma è certo il contributo di molecole
chemoattrattive derivanti dalle aree coinvolte in tale processo. L’associazione dei
neuroni GnRH con queste fibre assonali ha suggerito il coinvolgimento di molecole di
adesione cellulare, in particolare N-CAM (“Neural-cell adhesion molecule”), una
proteina la cui espressione cambia durante lo sviluppo e il movimento cellulare, e che
è espressa dai nervi terminale e vomero-nasale [43]. Studi condotti durante lo
25 sviluppo embrionale hanno infatti evidenziato come i neuroni GnRH migrino associati
ad assoni N-CAM positivi [20, 44].
Nella regione nasale sono state identificate varie molecole che potrebbero influenzare,
positivamente o negativamente, la migrazione dei neuroni GnRH. Le semaforine e le
proteine slits, espresse con i loro recettori nel sistema olfattivo [45, 46] potrebbero
stabilire e mantenere connessioni tra le varie parti dello stesso sistema. Le netrine,
proteine di secrezione con effetti sia attrattori che repellenti, interagiscono con il
prodotto del gene DCC (“Deleted in Colorectal Cancer” [30]) espresso anche a livello
degli assoni periferina-positivi e con un ruolo apparentemente importante nel
processo di migrazione. Animali knockout per DCC presentano infatti i neuroni GnRH
posizionati in maniera non corretta, fuori dal proencefalo e in associazione con le fibre
periferina-positive [30].
Come già ricordato, lo sviluppo del sistema neuroendocrino del GnRH è intimamente
correlato e dipendente dalla formazione del sistema olfattivo. Gli assoni dei nervi
olfattori sono condotti dall’epitelio sensoriale verso il bulbo olfattivo sotto la guida di
vari fattori tra i quali rientrano probabilmente le proteine TAG-1, galectina-1,
proteoglicano 6B4, i glicoconiugati CC e i recettori olfattori [47‐51]. Rimane tuttavia
ancora da stabilire se qualcuna di queste molecole intervenga in modo rilevante anche
nella migrazione dei neuroni GnRH.
L’espressione genica dei neuroni GnRH subisce delle variazioni in momenti distinti del
processo di migrazione attraverso il sistema olfattorio. Le fasi iniziali del processo
migratorio sembrano influenzate dal fattore NELF (“Nasal Embryonic GnRH Factor”)
[26], mentre il recettore ad attività tirosino-chinasica Ark appare coinvolto nelle
modifiche del citoscheletro fondamentali per il processo di migrazione [52, 53]. I
neuroni GnRH esprimono il gene Ebf2 (“Early B-Cell Factor 2”) appartenente alla
famiglia dei fattori di trascrizione HLH (“Helix-Loop-Helix”) che sono coinvolti in
diversi aspetti dello sviluppo neuronale. Topi knockout per Ebf2 hanno evidenziato
come tale fattore non sia necessario per le fasi iniziali del processo migratorio
neuronale ma sia fondamentale per le tappe terminali. In questi animali, infatti, i
neuroni GnRH raggiungono facilmente la regione del piatto cribriforme, ma poi, invece
di deflettere caudalmente nel proencefalo ventrale migrano dorsalmente attraverso il
telencefalo e mostrano segni di degenerazione [40]. Dato che il gene Ebf2 è espresso
dai neuroni GnRH, si è ipotizzato che il difetto di migrazione interessi in modo
specifico i neuroni GnRH e non la via di migrazione. L’effetto anti-migratorio ottenuto
con il muscimolo, un agonista recettoriale del GABA, ha suggerito come la popolazione
di neuroni GABA localizzata nel placode embrionale potrebbe rallentare la migrazione
26 dei neuroni GnRH dalla regione nasale al SNC [54]. Il GABA potrebbe quindi agire
come segnale di arresto per i neuroni GnRH, con lo scopo di ritardarne l’ingresso nel
SNC [55]. Sebbene la motivazione di tale rallentamento non sia nota, si potrebbe
ipotizzare che questa pausa consenta la maturazione dei neuroni GnRH, garantisca lo
stabilirsi di un pathway migratorio adeguato alle regioni centrali e permetta
adattamenti al nuovo ambiente extracellulare.
Il fattore anosmina-1, così chiamato per il suo ruolo aggiuntivo nello sviluppo del
sistema olfattorio, riveste una funzione importante per la corretta migrazione dei
neuroni GnRH nel SNC come emerge dall’identificazione nella sindrome di Kallmann,
associata al cromosoma X, di mutazioni a livello del gene KAL1, codificante per
anosmina-1. Tali mutazioni portano ad alterazioni della via di migrazione con
conseguenze sul movimento dei neuroni GnRH [56].
Negli ultimi anni, tra i fattori di controllo della migrazione neuronale ha assunto un
certo rilievo la proteina reelina, studiata per le sue funzioni nel controllo della
migrazione radiale dei neuroni a livello della corteccia cerebrale [57]. Reelina è
espressa lungo la via di migrazione dei neuroni GnRH [58, 59] e agisce come segnale
per guidare la migrazione dei neuroni GnRH a livello del SNC; topi reeler, mutanti per
reelina, presentano infatti una riduzione del numero di questi neuroni che potrebbe
spiegare la ridotta fertilità di questi animali [60, 61].
3.3
IL PEPTIDE GnRH
L’ipotalamo regola l’attività riproduttiva dei mammiferi mediante la secrezione
dell’ormone di rilascio delle gonadotropine o GnRH (chiamato anche ormone di rilascio
dell’ormone luteinizzante, LHRH). Tale ormone peptidico è rilasciato dai terminali dei
neuroni GnRH a livello dell’eminenza mediana nel circolo portale ipotalamo–ipofisario,
attraverso cui raggiunge le cellule gonadotrope dell’adenoipofisi per stimolare la
produzione e il rilascio delle gonadotropine LH e FSH [62]. I neuroni GnRH, data la
loro
localizzazione
centrale,
sono
considerati
l’elemento
gerarchicamente
più
importante dell’asse HPG poiché veicolano segnali centrali e periferici, soprattutto per
via indiretta, nel sistema gonadotropo. L’ormone GnRH agisce quindi come l’effettore
finale per la regolazione ipotalamica degli elementi a valle dell’asse riproduttivo [2].
27 3.3.1
Forme molecolari di GnRH
Sebbene l’esistenza di tale molecola fosse già nota dal 1950 [63], solo negli anni
settanta
Guillemin
e
Schally
ne
identificarono
simultaneamente
la
sequenza
aminoacidica (decapeptide: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2) in seguito
al suo isolamento dall’ipotalamo ovino e suino [64, 65]. Per molti anni si ritenne che
questa
fosse
l’unica
Successivamente,
la
forma
ricerca
molecolare
di
tale
esistente
neuropeptide
di
in
GnRH
altre
nei
specie
vertebrati.
ha
portato
all’identificazione di 14 diverse forme di GnRH, anche se, in ogni specie, ne sono state
individuate fino a un massimo di tre (GnRH-1, GnRH-2 e GnRH-3), ciascuna codificata
da un gene diverso [66, 67]. La forma GnRH-1, identificata solo nei vertebrati
superiori, è responsabile dello sviluppo e del controllo neuroendocrino della funzione
riproduttiva in quando stimola il rilascio delle gonadotropine dalle cellule gonadotrope
dell’adenoipofisi [68]. L’isoforma GnRH-2, implicata probabilmente nella regolazione
del comportamento sessuale, dell’assunzione di cibo e del bilancio energetico [69‐72]
è presente in tutti i vertebrati anche se, solo di recente, è stata individuata nei
mammiferi [66, 73]. La variante GnRH-3, identificata esclusivamente nei pesci
teleostei [74], svolge un possibile ruolo come ormone ipofisiotropo oltre ad essere
coinvolta nel controllo del comportamento sessuale [75, 76]. Le tre forme di GnRH
differiscono tra loro per sequenza, sito d’origine e localizzazione finale. I neuroni
GnRH-1 originano a livello del placode olfattivo e migrano fino all'ipotalamo mediobasale (nuclei arcuato e ventromediale) e all’area preottica anteriore [77]. Anche i
neuroni GnRH-3 sono sintetizzati nel placode olfattivo ma raggiungono le aree
anteriori del cervello e il sistema olfattorio [66]. I neuroni GnRH-2 originano, invece,
nel cervello e si differenziano nel mesencefalo. Sono inoltre stati scoperti neuroni
GnRH-1 con funzione “non endocrina”, il cui ruolo specifico resta tuttavia ancora da
comprendere. Nel topo, si tratta di gruppi neuronali che originano direttamente nel
cervello ed esprimono il GnRH in modo transiente durante lo sviluppo [78]; nella
scimmia, invece, tali neuroni sintetizzano un peptide GnRH-1 tronco in aree
extraipotalamiche [79].
Nell’ambito di questo studio saranno presi in considerazione solo i neuroni GnRH-1,
fondamentali per il controllo della funzione riproduttiva e che, per semplicità, saranno
indicati come neuroni GnRH. Nel cervello dei mammiferi, tale popolazione cellulare,
che non raggiunge le 1000 unità, non è raggruppata in nuclei ipotalamici ben definiti
ma è distribuita in gruppi dispersi con una maggiore concentrazione in specifiche
aree. Nel ratto, nella pecora, nella capra e nelle scimmie, la maggior parte dei corpi
28 cellulari di tali neuroni si localizza nelle aree rostrali del cervello, in particolare nel
setto mediale, nella banda diagonale di Broca e nell’area preottica ipotalamica (POA)
[80]. Nei primati e nei roditori, si è identificata una regione di nuclei immunoreattivi
per il GnRH anche nella porzione caudale dell’area retrochiasmatica, nell’ipotalamo
medio-basale e nell’arcuato (ARC) [81, 80]. Nonostante i neuroni GnRH abbiano
un’ampia distribuzione neuroanatomica, la quasi totalità dei loro assoni termina a
livello del letto capillare dell’eminenza mediana in cui il neuropeptide maturo viene
liberato con una pulsatilità altamente sincronizzata per poi raggiungere l’ipofisi
anteriore tramite la circolazione portale [82‐84]. I neuroni che non prendono contatti
svolgono probabilmente la funzione di neurotrasmissione e/o neuromodulazione [85].
3.3.2
Sintesi, secrezione e attività del GnRH
L’espressione genica del GnRH ipotalamico avviene in modo intermittente e dipende
da una regione promotore di 300-bp chiamata NSE (neuron specific enhancer) [86]. Il
GnRH viene sintetizzato come precursore polipeptidico denominato prepro-GnRH
(proormone) [87, 88] ed è composto da un peptide segnale di 23 aa, dal decapeptide
GnRH seguito da un sito di processamento proteolitico (Gly-Lys-Arg) e dal peptide
associato al GnRH (GAP) di 56 aa. Nei mammiferi, il proormone è codificato da un
gene costituito da 3 introni e da 4 esoni, di cui il primo contiene la sequenza della
regione 5’ non tradotta, il secondo quella del peptide segnale, del GnRH e dei primi 11
aminoacidi del GAP, il terzo quella degli aminoacidi 12-45 del GAP ed il quarto quella
degli aminoacidi 46-56 del GAP e della regione 3’ non tradotta [89].
La conformazione biologicamente attiva del GnRH contiene un ripiegamento nella
regione centrale della molecola, a livello della glicina in posizione 6 (Gly6) [447]. Tale
ormone esplica le proprie azioni biologiche mediante l’interazione con un recettore di
superficie accoppiato alle proteine G (GPCR) denominato GnRH-R. Quest’ultimo
possiede sette eliche transmembrana connesse tra loro per mezzo di tre domini
extracellulari e tre legami intracellulari [448]. I domini extracellulari e le regioni
superficiali delle porzioni transmembrana sono responsabili dell’unione con il GnRH
che avviene a livello dei residui amino-terminali dell’ormone, mentre le eliche
transmembrana
sembrano
implicate
nella
configurazione
e
nel
cambio
conformazionale del recettore come conseguenza della sua attivazione. La specificità e
l’unione ad alta affinità (Kd=0.5 nM) con il GnRH-R sono garantite dalle sequenze
carbossi-terminali dell’ormone GnRH [447].
29 Sebbene la principale funzione del GnRH sia incentrata sulla stimolazione del rilascio
delle gonadotropine dall’adenoipofisi, tale ormone agisce anche in numerosi siti
extraipotalamici e extraipofisarici, quali altre regioni cerebrali [90‐92], le gonadi [93, 94], la placenta [95], la vescica [96‐100], la prostata [95], le ghiandole mammarie, la
milza [101], le isole pancreatiche [102], il timo e il cuore [103], ma il suo ruolo
fisiologico e farmacologico in tali regioni extraipofisariche è tuttora poco conosciuto.
Le azioni del GnRH a livello ipofisario sono classificabili in tre tipologie in base
all’intervallo temporale con cui avvengono:
•
rilascio immediato di LH e FSH nell’arco di pochi minuti (azione acuta)
•
induzione della sintesi di LH e FSH nell’arco di alcune ore (azione a medio termine)
•
cambiamenti morfologici a lungo termine della durata di diversi giorni (azione a
lungo termine) [104].
Numerosi segnali centrali e periferici modulano l’attività neuronale del GnRH. Alcuni,
quali noradrenalina, kisspeptina e neuropeptide Y (NPY) sono di tipo stimolatorio,
altri, tra cui beta-endorfina, progesterone, androgeni e interleuchina-1 (IL-1) hanno
un’azione inibitoria ed altri ancora, ad esempio l’estradiolo, possono svolgere un ruolo
sia stimolatorio che inibitorio sul rilascio di GnRH. In particolare, gli ormoni gonadici
steroidei regolano l’espressione del GnRH e delle gonadotropine agendo a livello
ipotalamico e ipofisario con un classico circuito a feedback negativo [105].
Nella specie femminile, il GnRH viene rilasciato dall’ipotalamo con due diverse
modalità: “pulse” and “surge” [106], che sono regolate in modo indipendente e da
diversi set di neuroni [105]. La secrezione “pulse” (pulsatile o tonica) del GnRH è
responsabile del rilascio pulsatile delle gonadotropine che si osserva durante la
maggior parte del ciclo ovarico per la regolazione della follicologenesi e, in molte
specie, del corpo luteo. Tale modalità di rilascio è controllata, mediante meccanismi a
feedback negativo, dall’estradiolo (E2) e dal progesterone ovarici che inibiscono,
rispettivamente, l’ampiezza e la frequenza di pulsatilità [107]. La modalità “surge”
genera il picco preovulatorio di LH che innesca l’ovulazione ed è regolata, mediante
meccanismi a feedback positivo, dall’aumento in circolo della concentrazione di E2
[108].
30 3.4
REGOLAZIONE DELLA SECREZIONE DEL GnRH
3.4.1
Secrezione pulsatile del GnRH: “GnRH pulse generator”
Il controllo neuroendocrino della funzionalità riproduttiva avviene mediante il rilascio
episodico dell’ormone GnRH dall’ipotalamo, che si riflette nell’attivazione tonica del
GnRH-R nelle cellule gonadotrope dell’adenoipofisi ed infine nella sintesi e nel rilascio
pulsatile delle gonadotropine LH e FSH [109‐114]. Tale natura pulsatile è un aspetto
caratteristico
del
sistema
HPG
[112, 113] ed è essenziale per regolare la
gametogenesi, la sintesi degli ormoni gonadici e quindi per una corretta funzionalità
riproduttiva. Infatti, l’esposizione continua delle cellule gonadotrope al GnRH inibisce
sia la trascrizione che la secrezione di LH e FSH [115].
I siti e i meccanismi molecolari d’azione degli estrogeni non sono stati ancora
pienamente compresi, anche se è certo il coinvolgimento diretto dell’ipotalamo e
dell’ipofisi [62]. Secondo Moenter e collaboratori, il feedback negativo degli estrogeni
sulla secrezione di GnRH/LH sfrutterebbe multipli meccanismi, quali l’azione diretta sui
neuroni GnRH a livello del recettore di membrana GPR30 e del recettore estrogenico β
(tali neuroni non esprimono ERα, sottotipo essenziale per il feedback dell’E2 [116]) e
l’azione indiretta su neuroni afferenti ai neuroni GnRH mediante il recettore
estrogenico α [117].
La secrezione pulsatile del GnRH è il risultato dell’attivazione sincronizzata dei neuroni
GnRH che sono raramente interconnessi tra loro a livello dei corpi cellulari e dei
processi neuronali poiché sono distribuiti in modo sparso nell’ipotalamo [62]. Il rilascio
sincronizzato degli impulsi di GnRH è il risultato dell’integrazione effettuata dal così
detto generatore di pulsatilità del GnRH (“GnRH pulse generator”). Si tratta di una
rete ipotalamica, originariamente proposta da Knobil [118], che comprende i neuroni
GnRH così come altri sistemi afferenti che consentono la secrezione pulsatile del
decapeptide ipotalamico [2]. La localizzazione e l’anatomia di tale network rimangono
ampiamente sconosciute sebbene siano state postulate due ipotesi. La prima
suggerisce l’esistenza di neuroni ipotalamici non GnRH secernenti, e probabilmente
collocati nell’MBH, che attiverebbero elettricamente il rilascio di tale neuropeptide.
Tale ipotesi è stata avvalorata da esperimenti di deafferentazione dell’MBH dal resto
del cervello, da espianti di MBH e dal trapianto di MBH fetale nell’ipotalamo di ratti
anziani o lesionati a livello dell’ARC. In tutti questi casi, l’MBH ha consentito la
permanenza o il ripristino del rilascio pulsatile di GnRH/LH. La seconda ipotesi
sostiene invece che i neuroni GnRH potrebbero contenere al loro interno meccanismi
31 autonomi di eccitazione ad intervalli regolari e quindi un’attività intrinseca, come
dimostrato da esperimenti in vitro con la linea cellulare immortalizzata GT1 o da studi
di elettrofisiologia in singoli neuroni GnRH di topi transgenici GnRH-GFP [62]. I
neuroni GnRH formerebbero quindi una diffusa rete neurale che funzionerebbe come
un generatore della pulsatilità coordinata del GnRH [119].
In ogni caso, la sincronizzazione tra i neuroni GnRH potrebbe avvenire a livello dei
corpi cellulari, dei dendriti o dei terminali assonali.
3.4.2
Kisspeptina: ruolo nei meccanismi di secrezione del
GnRH
Nel 2003, s’identificò la presenza di mutazioni a carico del recettore della kisspeptina
(GPR54) in uomini affetti da ipogonadismo ipogonadotropo [120, 121]. Tale scoperta
ha aperto una nuova era nella ricerca dei meccanismi responsabili della generazione
della pulsatilità del GnRH e, in tale contesto, la kisspeptina ha assunto un ruolo
considerevole. Tale peptide possiede infatti una potente azione stimolatrice sulla
secrezione di GnRH/LH in numerose specie e la sua pulsatilità è in associazione
temporale con quella del GnRH [62]. Inoltre, antagonisti di kisspeptina bloccano il
rilascio tonico di GnRH/LH in diverse specie [122].
Nei mammiferi sono state identificate due popolazioni di neuroni produttori di
kisspeptina, differenti per localizzazione e funzioni:
•
i neuroni dell’ipotalamo anteriore o rostrale: il nucleo AVPV (anteroventrale
periventricolare) nei roditori, la POA (area preottica) nella pecora e il PVN
(periventricolare) nei maiali [123‐126].
Sono molto più numerosi nelle femmine rispetto ai maschi (differenza di sesso) e
sono la sede dei meccanismi di feedback positivo estrogenico [62]. Sono quindi
implicati esclusivamente nel controllo della secrezione “surge” del GnRH.
•
i neuroni dell’ipotalamo intermedio: nucleo ARC (arcuato).
Studi di deafferentazione nel ratto femmina, la presenza nei neuroni Kiss1 dell’ARC
dei recettori degli estrogeni e degli androgeni [124, 125] e la constatazione che
l’espressione di Kiss1 nell’ARC rispecchia il rilascio di LH in diverse condizioni
fisiologiche (pubertà, allattamento, stress, inibizione durante il feedback negativo di
E2 e testosterone) suggeriscono che tali neuroni siano target diretti del feedback
negativo degli steroidi sessuali e che siano quindi coinvolti nella generazione del
rilascio “pulse” del GnRH.
32 In alcune specie mammifere, quali la pecora e la scimmia [62], i neuroni Kiss1
dell’ARC sarebbero anche coinvolti nell’induzione del picco preovulatorio di LH.
3.4.3
Neuroni
KNDy:
ipotetico
ruolo
nei
meccanismi
di
secrezione del GnRH
A partire dal 2007, quattro distinti gruppi di ricerca [127‐129, 108] hanno identificato
uno specifico gruppo di neuroni dell’ARC (concentrati nella regione più posteriore) che
co-esprimono i neuropeptidi kisspeptina, neurochinina B (NKB) e dinorfina (Dyn) da
cui ne deriva il nome “KNDy neurons” [108]. Tale popolazione neuronale è stata
descritta in ratti, topi, capre e scimmie e numerose evidenze supportano la sua
esistenza anche nell’uomo e nella donna, sebbene esista una marcata differenza tra i
due sessi e il ruolo nel maschio sia ancora questione di dibattito. Le componenti
peptidiche dei neuroni KNDy sono diverse per espressione e regolazione nelle diverse
specie, e le maggiori diversità si riscontrano nei roditori soprattutto per quanto
concerne l’attività della NKB [130]. Un crescente interesse per lo studio sulla NKB è
nato nel 2009 in seguito all’identificazione di mutazioni nel gene che codifica per tale
peptide (TAC3) o per il suo recettore (TAC3R) in uomini affetti da ipogonadismo
ipogonadotropo [131, 132]. Numerose evidenze supportano il ruolo chiave delle vie di
segnale di NKB/NK3 e Dyn/KOR nella sincronizzazione dell’attività secretoria dei
neuroni GnRH, sebbene non siano stati ancora pienamente compresi i meccanismi
coinvolti anche a causa di notevoli differenze di specie [108, 62].
I neuroni KNDy dell’ARC presentano alcune caratteristiche peculiari:
•
sebbene kisspeptina, NKB e Dyn siano espressi anche in altre regioni cerebrali, la
loro colocalizzazione è prerogativa dell’ARC ed è conservata in numerose specie di
mammiferi quali ratto, topo, pecora e capra.
•
esprimono ERα (97%) [133, 124, 134], il recettore del progesterone (PR) (90%)
[135] e degli androgeni (AR) [134, 136], il che suggerisce un ruolo integrale di tale
popolazione neuronale nel mediare gli effetti degli steroidi sessuali.
•
nella
pecora,
nel
ratto
e
nella
capra,
formano
una
rete
reciprocamente
interconnessa [133, 135, 137], le cui innervazioni si estendono a connessioni
bilaterali tra i nuclei dell’ARC su ogni lato del terzo ventricolo, molto probabilmente
tramite fibre che passano sotto il ventricolo nella zona interna dell’eminenza
mediana [130]. Questa reciproca innervazione suggerisce la capacità dei neuroni
KNDy di sincronizzare/amplificare le risposte a segnali interni ed esterni a cui sono
sensibili,
quali
gli
steroidi
sessuali
[108]. Tale supposizione è avvalorata
33 dall’identificazione del recettore ad alta affinità per la NKB (NK3R) nei neuroni
KNDy di ratto [138], topo [128] e pecora, nonché del sottotipo recettoriale degli
oppioidi con la più alta specificità per DYN (KOR) nelle cellule KNDy del topo [128].
Studi condotti nel topo, non hanno rilevato l’espressione del GPR54 in tale
popolazione neuronale [139].
•
interagiscono direttamente con i corpi cellulari o i dendriti dei neuroni GnRH del
POA e del MBH nei roditori [140, 123], nelle scimmie [108], nelle pecore [141] e
nell’uomo [142] e con i terminali neurosecretori GnRH secernenti nell’eminenza
mediana nei roditori, nelle scimmie e nelle pecore [130]. Questo aspetto non
preclude però l’esistenza di proiezioni delle cellule KNDy verso interneuroni nel
POA [127].
•
contengono altri neurotrasmettitori e recettori quali il glutammato nei topi [143] e
nelle pecore [141], la galanina e il vGAT (un marker dell’acido γ-aminobutirrico,
GABA) in piccola percentuale nel topo [141, 143].
•
nelle pecore, estendono proiezioni verso altri neuroni non KNDy dell’ARC quali i
corpi cellulari di POMC (7%) e di NPY (20%). I neuroni NPY (13-30%) e POMC (3244%) invierebbero a loro volta innervazioni ai neuroni KNDy permettendo in tal
modo a segnali metabolici, quali la leptina, di modularne l’attività [130].
•
ricevono innervazioni reciproche da altri neuroni KNDy, segnali glutamatergici e
varicosità contenenti vGlut2 [130];
Studi condotti in diverse specie di mammiferi attribuiscono ai neuroni KNDy dell’ARC il
ruolo chiave di mediatori del feedback negativo degli ormoni sessuali e quindi del
rilascio tonico di GnRH. Le diverse componenti peptidiche di tali neuroni medierebbero
differenti tipologie di feedback steroideo:
•
kisspeptina funge da target del feedback negativo di E2 [144] che, nel topo,
interagisce con ERα [145] attivando meccanismi non classici ovvero non associati
al signaling degli elementi di risposta agli estrogeni (ERE) [146]. La riduzione
dell’espressione di kisspeptina da parte degli estrogeni determina un’inibizione
dell’ampiezza di pulsatilità di GnRH/LH.
•
l’espressione di NKB [128, 147] e di NK3R [128] sono inibite dagli estrogeni con
conseguente attenuazione del signaling stimolatorio di NKB/NK3R sul rilascio
pulsatile del GnRH.
•
nella pecora e nell’uomo [148], Dyn è coinvolta nell’inibizione della frequenza di
pulsatilità del GnRH/LH da parte del progesterone [107], che agisce aumentando
34 l’espressione di Dyn e potenziando il signaling inibitorio di Dyn/KOR [149]. Nei
roditori, il ruolo di Dyn nei confronti del progesterone è meno chiaro [128].
Sun e collaboratori [117] hanno inoltre ipotizzato che il feedback negativo degli
steroidi gonadici possa essere veicolato dalla variazione dell’eccitabilità dei neuroni
KNDy dell’ARC attraverso meccanismi mediati da canali ionici.
Il sistema neurale responsabile della mediazione del feedback positivo dell’E2 e quindi
dell’induzione del picco preovulatorio di GnRH/LH (“surge”) è specie specifico [108].
Nei roditori, E2 agisce a livello dei neuroni Kiss1 dell’AVPV e nelle aree adiacenti [144,
150]. Nei primati, il feedback positivo di E2 avviene nel MBH, probabilmente nel VMN o
nell’ARC. Nella pecora, i neuroni KNDy permangono una delle sedi del controllo
estrogenico positivo (oltre a quello negativo), come avvalorato anche dall’espressione
del gene precoce Fos [108]. In tale specie, la mediazione del feedback sia positivo che
negativo dell’E2 potrebbe avvenire in due sottopopolazioni differenti dei neuroni KNDy
oppure nella stessa popolazione neuronale che risponderebbe differentemente a basse
(controllo negativo) e elevate (regolazione positiva) concentrazioni di estradiolo [151].
Non è da escludere anche il possibile coinvolgimento di altri sistemi neurali,
prevalentemente noradrenergici e somatostatinergici [106].
Navarro [128] nel topo, Lehman [108] nella pecora e Wakabayashi [129] nella capra
hanno proposto un plausibile modello per spiegare il ruolo dei neuroni KNDy nella
generazione della secrezione “pulse” del GnRH. I neuroni KNDy dell’ARC inviano i
propri assoni verso i neuroni GnRH mentre i loro collaterali e dendriti formano un
circuito neurale bilaterale interconnesso. All’interno di tale rete neurale, il signaling di
NKB/NK3R facilita l’attivazione sincronizzata dei neuroni KNDy, mentre il signaling di
Dyn/KOR, in ritardo rispetto a quello di NKB/NK3R, pone termine a tale stimolo
attivatorio. Tali meccanismi generano oscillazioni ritmiche nell’attività del circuito
neurale e ciascuna di queste oscillazioni si traduce in un impulso per il rilascio di
kisspeptina verso i neuroni GnRH del POA o nell’eminenza mediana evocando infine il
rapido aumento della secrezione pulsatile del GnRH nella circolazione portale [62]. Il
ruolo di kisspeptina come effettore finale per i neuroni GnRH è avvalorato dalla
presenza in tali neuroni del GPR54, dall’assenza di KOR, dalla presenza nulla o
comunque scarsa di NK3R e dall’osservazione che la distruzione genetica o
farmacologica [130] del signaling di kisspeptina blocca l’azione stimolatrice della NKB
nei topi e nelle scimmie.
Secondo Ducret e collaboratori [152], i neuroni KNDy
sarebbero caratterizzati da un’attività spontanea probabilmente dovuta a canali ionici
di depolarizzazione lenti che si traduce nell’aumento della NKB. Le attività casuali di
35 ciascun neurone KNDy si propagherebbero tra le altre cellule interconnesse del
circuito neurale dell’ARC mediante il signaling di NKB/NK3R stimolando il rilascio di
altra NKB. Il risultante circuito a feedback positivo evocherebbe impulsi attivatori
sincronizzati dei neuroni KNDy che risponderebbero rilasciando kisspeptina. L’aumento
iniziale della NKB stimolerebbe anche il rilascio della Dyn che provocherebbe
l’inibizione ritardata dei neuroni KNDy mediante il signaling di Dyn/KOR (feedback
negativo) e imporrebbe una quiescenza prolungata impedendo la generazione
temporanea di un altro impulso attivatorio. L’azione di Dyn sui neuroni KNDy
sopprimerebbe infine anche il rilascio di Dyn che consentirebbe quindi l’inizio di un
nuovo impulso attivatorio e di un nuovo rilascio pulsatile di Kisspeptina e di GnRH.
[62, 108, 130]. Riassumendo, kisspeptina è l’effettore finale, NKB è il peptide che
scatena l’eccitazione sincronizzata dei neuroni KNDy aumentando la frequenza di
pulsatilità del GnRH/LH mentre Dyn spegne il firing neuronale inibendo l’attività delle
cellule KNDy e mantendo sotto controllo la frequenza di rilascio pulsatile. Tuttavia, ad
oggi, non sono stati chiariti i meccanismi responsabili del rilascio controllato di Dyn
dai neuroni KNDy e neppure se Dyn venga rilasciata contemporaneamente o con
leggero ritardo dopo NKB. È ancora questione di dibattito se tale neuropeptidi siano
presenti nelle stesse o in differenti vescicole secretorie all’interno dei terminali
presinaptici [130].
Goodman e collaboratori hanno inoltre dimostrato l’esistenza di proiezioni dei neuroni
GnRH verso i neuroni KNDy dell’ARC sollevando l’ipotesi di reciproche connessioni
nervose per il controllo della secrezione episodica di GnRH (possibile feedback
negativo del GnRH sull’attività dei neuroni KNDy). In realtà tale innervazione non
interviene nella regolazione della frequenza di pulsatilità del GnRH/LH [141].
3.4.4
Pulsatilità intrinseca dei neuroni GnRH
La secrezione episodica del GnRH dai neuroni ipotalamici è una proprietà intrinseca
del neurone GnRH e dipende dall’interazione autocrina (loop autocrino) di tale
decapeptide con i propri recettori (espressi nei neuroni produttori di GnRH) e quindi
dall’attivazione dei meccanismi di segnale intracellulare che conducono a picchi
sincronizzati di rilascio di GnRH [114]. Tali processi sono già evidenti nei neuroni
GnRH fetali e quindi potrebbero regolare l’espressione genica e il rilascio del
decapeptide durante la migrazione embrionale [153‐155].
Oltre all’ipotalamo, altre sedi periferiche della produzione del GnRH sono le cellule
ovariche della granulosa [156], le cellule testicolari [157], la placenta umana [158], il
sistema immunitario [159] la tasca del Rathke [160] e l’ipofisi [161].
36 Il sistema GnRH ipofisario potrebbe comunicare con quello ipotalamico mediante il
sistema portale ipotalamo-ipofisario e il flusso ematico neuroipofisario retrogrado
[162, 163]. Tale organizzazione vascolare, che connette due sistemi in cui il GnRH
interagisce con il GnRH-R in modo autocrino, fornisce un meccanismo regolatorio
addizionale (feedback corto) che controlla la secrezione di LH e GnRH [164]. Le azioni
coordinate dei due sistemi individuali contribuiscono alla pulsatilità sincronizzata del
GnRH che innesca il rilascio di LH dall’ipofisi [114].
L’espressione genica di kisspeptina e GPR54 nei neuroni GnRH ipotalamici e l’eterooligomerizzazione costitutiva o indotta da agonista del GnRH-R e del GPR54 indicano
che entrambi i recettori sono coinvolti nella regolazione dei neuroni GnRH ipotalamici.
Inoltre, la stimolata secrezione del GnRH da parte di kisspeptina e l’inibito rilascio di
kisspeptina da parte del GnRH mostrano che come i sistemi autoregolatori GnRHR/GnRH e GPR54-kisspeptina siano integrati da meccanismi a feedback negativo per
controllare la secrezione di GnRH e kisspeptina [114].
37 4.
GONADOTROPINE: LH E FSH
Le gonadotropine LH e FSH sono ormoni glicoproteici costituiti da due subunità, α e β,
unite tra loro mediante interazioni non covalenti. La subunità α, costituita da 90 – 100
aa in base alla specie, è comune ad entrambe le gonadotropine, mentre la subunità β,
delle dimensioni di 105 – 121 aa, è la componente esclusiva di ciascuna
gonadotropina in quanto è responsabile della sua specificità biologica [165‐167].
Entrambe le subunità si caratterizzano per la presenza di oligosaccaridi uniti
principalmente a residui di asparagina (Asn). Il loro assemblaggio avviene a livello del
reticolo endoplasmatico e tale fase è un fattore limitante nel processo di secrezione
degli eterodimeri [168]. Sia il legame al recettore che la trasduzione del segnale
necessitano della dimerizzazione delle subunità [166, 449].
La secrezione delle gonadotropine avviene in modo pulsatile e i livelli medi circolanti
di tali ormoni subiscono notevoli cambiamenti nelle prime fasi dello sviluppo
postnatale fino alla pubertà. Nel ratto maschio, i livelli di FSH aumentano
progressivamente dal 15° giorno dalla nascita fino al 45° (raggiungimento della
pubertà), mentre i livelli di LH sono caratterizzati da un profilo di secrezione più
variabile
[169].
progressivamente
Nella
ratta
dalla
nascita
femmina,
fino
i
al 15°
livelli
sierici
di
FSH
aumentano
giorno, per poi ridursi e
quindi
incrementarsi leggermente al giorno 35 in concomitanza con il periodo puberale. Al
contrario, l’LH aumenta tra i giorni 5 e 10 postnatali, diminuisce fino al giorno 25 per
poi incrementarsi bruscamente fino al raggiungimento dei valori massimi con l’arrivo
della pubertà (in media il giorno 35 dopo la nascita) [170, 449].
Le gonadotropine esercitano le proprie molteplici funzioni in seguito all’interazione con
recettori di membrana accoppiati alla proteina G [171], costituiti da un dominio NH2terminale extracellulare e glicosilato, da sette eliche transmembrana interconnesse tra
loro mediante tre anse extracellulari e tre legami intracellulari e da un dominio Cterminale intracellulare ricco in residui di serina e treonina [449].
Il gene da cui deriva il recettore dell’LH (LHR) è composto da 10 introni e 11 esoni
[172], di cui i primi 10 codificano per il dominio NH2-terminale mentre l’esone 11 per il
dominio C-terminale e per le sette eliche transmembrana. Il recettore dell’FSH (FSHR)
origina da un gene che consta di 9 introni e 10 esoni, di cui i primi 9 contengono la
sequenza del dominio NH2-terminale mentre l’esone 10 tutto il rimanente della
struttura recettoriale [173]. Sia LHR che FSHR, in seguito all’interazione con le
38 proteine G, attivano diversi isoenzimi adenilatociclasici con conseguente aumento dei
livelli dell’adenosina monosfato ciclico (cAMP). In aggiunta, è stata comprovata la
capacità di tali recettori di attivare altre vie di segnale, incrementando il ricambio di
fosfatidilinositoli, elevando i livelli di Ca2+ intracellulare e attivando proteine chinasi
dipendenti da mitogeni [174‐176, 449].
I recettori delle gonadotropine si localizzano prevalentemente a livello delle gonadi dal
momento che le principali azioni biologiche di LH e FSH si esplicano a tale livello.
Nell’ovaio,
FSHR
è
necessario
per
lo
sviluppo
follicolare
ed
è
espresso
prevalentemente nelle cellule della granulosa [177] mentre, nei testicoli, è stato
identificato
soprattutto
nelle
cellule
del
Sertoli
con
un
ruolo
critico
per
la
spermatogenesi [178, 449].
L’LHR è essenziale nell’ovaio per la maturazione follicolare, l’ovulazione e la funzione
luteale e si localizza di prevalenza nelle cellule della granulosa, della teca, luteali e
interstiziali [179] e tale espressione richiede una stimolazione ormonale appropriata
mediata da FSH e estradiolo. Nel testicolo, l’LHR è stato identificato principalmente
nelle cellule del Leyding in quanto svolge un ruolo critico nella sintesi di testosterone e
nella spermatogenesi. Studi recenti hanno evidenziato la presenza dell’LHR in tessuti
extragonadici, inclusi l’utero di diverse specie, le vescicole seminali umane, la prostata
umana e di ratto, la ghiandola surrenalica umana, la ghiandola mammaria di ratta in
allattamento, la retina neurale, le cellule neuroendocrine e il cervello della ratta [180].
Quest’ultimo è piuttosto interessante vista la capacità dell’LH di attraversare la
barriera
ematoencefalica
[181].
Il
possibile
ruolo
fisiologico
della
presenza
extragonadica di recettori delle gonadotropine è tuttora poco conosciuto [449].
4.1
REGOLAZIONE DIFFERENZIALE DELL’ESPRESSIONE GENICA
DI LH E FSH IN RELAZIONE ALLA FREQUENZA DI PULSATILITÀ DEL
GnRH
La sintesi e la secrezione intermittenti di LH e FSH dalle cellule gonadotrope
dell’adenoipofisi sono strettamente regolate da numerosi fattori endocrini, paracrini e
autocrini, inibitori (steroidi gonadici) e stimolatori [115, 182], come evidenziato dalle
variazioni prevedibili e riproducibili dei livelli circolanti delle gonadotropine durante il
ciclo estrale. Nei primi momenti della fase follicolare e di quella luteale, l’FSH
predomina sull’LH, mentre l’LH supera l’FSH nella tarda fase follicolare. Il GnRH
ipotalamico e il ritmo pulsatile con cui tale ormone raggiunge l’ipofisi anteriore sono
sicuramente due requisiti imprescindibili per la biosintesi e il rilascio di LH e FSH, che
39 sono invece soppressi dall’esposizione continua al decapeptide [115, 165, 183‐185]. Il
rilascio episodico del GnRH varia per frequenza e intensità durante diverse condizioni
fisiologiche quali l’insorgenza della pubertà e il ciclo estrale [182]. Queste variazioni
nel pattern di pulsatilità del GnRH hanno effetti differenziali sulla trascrizione della
subunità comune α e di quella specifica β di FSH (FSHβ) e LH (LHβ) [185,186] e sui
profili di rilascio delle gonadotropine biologicamente attive [187]. In particolare, un
incremento nella frequenza di pulsatilità del GnRH ipotalamico (> 1 pulsazione all’ora)
favorisce la trascrizione di LHβ e determina un preferenziale rilascio di LH (aumenta il
rapporto LH/FSH). Al contrario, ridotte frequenze di impulsi secretori di GnRH (< 1
pulsazione all’ora) comportano una più consistente trascrizione di FSHβ e quindi un
più marcato rilascio di FSH [115, 182, 183, 185]. Tale meccanismo consente ad un
singolo neuropeptide ipotalamico di indurre cambiamenti differenziali su due distinti
ormoni rilasciati dallo stesso tipo cellulare ipofisario ed è reso possibile dall’abilità
delle cellule gonadotrope di decifrare i diversi input di rilascio episodico del GnRH
[182]. Contrariamente alla maggior parte dei recettori accoppiati a proteine G, il
GnRH-R non va mai incontro ad un processo di desensitizzazione a causa dell’assenza
dell’estremità
C-terminale
[188]. Altri meccanismi intervengono
quindi
nella
modulazione della risposta cellulare alla pulsatilità del GnRH quali l’internalizzazione
del recettore mediata da ligando, il cambiamento nel numero dei recettori o
nell’attività delle vie di segnale a valle del GnRH-R. Studi in vitro condotti da Kaiser e
collaboratori [186, 189] hanno dimostrato che le cellule gonadotrope rispondono in
modo differenziale alla pulsatilità del GnRH tramite il cambiamento nel numero di
GnRH-R. Nel dettaglio, gli impulsi di GnRH aumentano l’espressione dell’mRNA del
GnRH-R in quantità maggiori all’aumentare della velocità di frequenza. Tuttavia, non
sono stati ancora chiariti i meccanismi con cui le cellule gonadotrope convertono il
segnale pulsatile del GnRH nella sintesi e nella secrezione preferenziale di FSH e LH.
4.2
VIE DI SEGNALE ATTIVATE DAL RILASCIO PULSATILE DEL
GnRH
A seconda del tipo cellulare considerato, ipotalamico o ipofisario, il GnRH-R è
accoppiato alle proteine Gαq/11, Gαi, Gαs [190] e probabilmente G12/13, il che implica il
coinvolgimento di numerose vie di segnale nella mediazione della sintesi di LH e FSH
in risposta alla pulsatilità del GnRH. Le proteine Gαq/11 inducono la fosfolipasi C a
generare inositolo trifosfato (IP3) e diacilglicerolo (DAG) provocando il rilascio del
calcio intracellulare e l’attivazione del signaling delle proteina chinasi C (PKC) [191].
40 Le proteine Gαs e Gαi agiscono sull’adenilato ciclasi per modulare i livelli di AMP ciclico
(cAMP) [192].
La cascata di MAPK (mitogen-activated protein kinase) che include ERK (extracellular
signal related kinase), JNK (jun N-terminal kinase) e p38 è stimolata dal GnRH. I
differenti pattern di attivazione di ERK in risposta alla variazione della frequenza di
pulsatilità del GnRH potrebbero essere responsabili dei distinti profili di espressione di
FSHβ e LHβ nelle cellule gonadotrope [193]. Armstrong e collaboratori [194] hanno
posto la mancata desensitizzazione della traslocazione di ERK nel nucleo dopo
stimolazione a frequenze diverse con GnRH come una prova che ERK non sia il
decodificatore della pulsatilità del decapeptide. Potrebbero però essere coinvolti dei
meccanismi a valle della traslocazione di ERK.
Il gruppo di Haisenleder [195, 196] ha attribuito un possibile ruolo come decodificatore
della frequenza di pulsatilità del GnRH al signaling del calcio e quindi all’attivazione di
CamK1/2 (Ca2+/calmodulin-dependent kinases).
Il fattore di trascrizione NFAT (nuclear factor of activated T-cells) potrebbe mediare gli
effetti del GnRH sulla trascrizione di FSH e LH, in seguito all’attivazione da parte della
calcineurina, una fosfatasi proteica [197]. Tuttavia, la traslocazione reversibile [197]
di tale fattore nel nucleo subisce una desensitizzazione indipendentemente dalla
frequenza di pulsatilità del GnRH e quindi non darebbe credito all’ipotesi del
coinvolgimento della via Ca2+/NFAT nella decodificazione del segnale pulsatile del
GnRH [198].
Studi recenti avvalorano la capacità di PKA (protein kinase A) di mediare la
trascrizione di FSHβ in seguito a pulsatilità di GnRH sia lente che veloci [199]. Alcuni
sostengono che l’attività di tale chinasi aumenterebbe con frequenze di pulsatilità
basse, mentre altri ritengono che tale aumento non sarebbe dipendente dal tipo di
frequenza di pulsatilità [200].
Tsutsumi e Webster hanno proposto un modello per la regolazione del signaling del
GnRH-R in risposta al rilascio di GnRH tonico o pulsatile. La stimolazione tonica da
parte del GnRH causa un aumento transiente nel signaling di Gs/cAMP/PKA che ritorna
rapidamente ai valori basali nonostante la continua presenza di GnRH. Al contrario, il
signaling di Gq/11/DAG/Ca2+ rimane elevato durante tutto il periodo di stimolazione
tonica del GnRH. Il rilascio pulsatile del decapeptide ipotalamico provoca una rapida
attivazione di Gs/cAMP/PKA, un effetto cumulativo di multipli impulsi e una mancanza
di desensitizzazione. Ne derivano impulsi regolari e d’intensità constante nel tempo
che mimano la pulsatilità del GnRH. La via di segnale di Gq/11/DAG/Ca2+ mostra
un’iniziale attivazione che correla con il picco di GnRH ma ciascun impulso successivo
41 ha intensità sempre più bassa fino all’abbattimento del segnale dopo due ore di
stimolazione pulsatile del GnRH. Questa desensitizzazione del signaling di Gq potrebbe
riflettere un feedback negativo indotto a valle da PKC o CaMK [105].
4.3
REGOLAZIONE TRASCRIZIONALE DELLE SUBUNITÀ DI FSH E
LH
La trascrizione di FSHβ è la fase limitante della sintesi di FSH. Una volta che la via di
segnale del GnRH è stata avviata, la sintesi di FSH è direttamente accoppiata al suo
rilascio mediante la via secretoria costitutiva [201]. Al contrario, LH è immagazzinato
in granuli secretori fino allo stimolo secretorio [202].
Nel promotore di FSHβ è stato identificato un elemento responsivo al GnRH, [203]
conservato nella specie umana, [204] e contenente un parziale sito CRE (cAMP
response element)/AP1. In tale regione, sotto stimolazione di frequenze di pulsatilità
lente del GnRH, si lega CREB (cAMP response element binding protein) che, dopo
fosforilazione a livello della Ser133 mediata dalla PKA, recluta e lega CBP (CREB
binding protein) per indurre la trascrizione di FSHβ
([199]). ICER (inducible cAMP
early repressor) è sintetizzato ed espresso preferibilmente a seguito di frequenze di
pulsatilità veloci del GnRH e compete con CREB per il sito CRE sul promotore di FSHβ
per ridurre la trascrizione di tale subunità [182]. Le vie di segnale di ERK e del calcio
rispondono diversamente alla frequenza del GnRH e sono potenziali candidati per la
regolazione di ICER [193]. Gli omo- ed etero-dimeri di AP1, composti da una
combinazione di c-Fos, c-Jun, Jun B e Jun D, sono stimolati da frequenze di pulsatilità
più lente rispetto agli effettori negativi della trascrizione di FSHβ, chiamati SKIL e
TGIF1. In presenza di frequenza di pulsatilità alte, questi repressori si legano al
promotore e inibiscono qualsiasi potenziale azione di c-Fos e c-Jun [105]. pERK, JNK e
p38 potrebbero mediare l’aumentata espressione delle proteine AP1 [203]. Tuttavia
non è stato ancora compreso come il GnRH induca l’espressione di CREB, ICER e AP1
in modo integrato per decodificare la frequenza di pulsatilità e controllare la sintesi di
FSH.
Nella parte prossimale del promotore di LHβ avviene il legame di due EGR1 (early
growth response 1), due SF1 (steroidogenic factor 1) e un elemento omeodominio
[193]. Frequenze di pulsatilità del GnRH veloci favoriscono la stabilità e livelli elevati
di EGR1 che aumentano la trascrizione di LH, mentre frequenze lente inducono
maggiormente i corepressori della famiglia EGR, chiamati NAB1/2 (Ngfi-A binding
protein) che riducono la trascrizione di LHβ [205]. Inoltre, anche il corepressore di
42 SF1, chiamato Dax1 (dosage-sensitive sex reversal-adrenal hypoplasia congenitacritical region on the X-chromosome gene 1) è stimolato a basse frequenze e ridotto
ad alte frequenze di pulsatilità del GnRH. ERK media sia l’aumento della trascrizione di
EGR1 che, l’induzione, a basse frequenze di GnRH, di NAB1/2. EGR1 contribuisce ad
indurre MKP2 (MAPK phosphatases 2) fornendo un potenziale meccanismo tramite cui
un classico regolatore di LHβ potrebbe anche influenzare la trascrizione di FSHβ.
L’aumentata espressione di EGR1 e poi di MKP2 a frequenze alte di pulsatilità del
GnRH potrebbe ridurre la fosforilazione di ERK e quindi l’attività degli induttori della
trascrizione di FSHβ, come AP1 [193].
Nelle cellule gonadotrope, frequenze di pulsatilità alte e basse del GnRH stimolano vie
di segnali comuni (ad esempio ERK) e quindi la decodificazione del tipo di pulsatilità
del GnRH si potrebbe basare sull’ampiezza, la durata e la frequenza di attivazione di
tali vie di segnale che coinvolgerebbero multipli fattori di trascrizione [193].
43 5.
METABOLISMO PERIFERICO E CENTRALE DEL
FERRO
5.1
FUNZIONI BIOLOGICHE DEL FERRO
Il ferro è un microelemento d’importanza vitale per la maggior parte delle forme di
vita conosciute perché agisce da cofattore in numerose reazioni metaboliche che
sostengono la divisione cellulare, il trasporto d’ossigeno nell’emoglobina e nella
mioglobina [206], la funzionalità dei citocromi, della citocromo ossidasi, della
perossidasi e della catalasi, la produzione di energia nei mitocondri, la sintesi e il
riparo di DNA. Le proteine Fe-S nella catena respiratoria mitocondriale trasferiscono
gli elettroni, generati dal ciclo dell’acido tricarbossilico, alle molecole di ADP per la
produzione di energia, soddisfacendo in tal modo all’elevata richiesta energetica delle
cellule neuronali. In mancanza di ferro, gli eritrociti non potrebbero veicolare ai tessuti
l’ossigeno legato all’emoglobina (gruppo heme) e la fosforilazione ossidativa da parte
dei complessi della catena respiratoria mitocondriale non sarebbe possibile (clusters
Fe-S) [207].
Nel cervello, il ferro è richiesto non solo per la sintesi di DNA e ATP e per la
respirazione mitocondriale ma anche per la biosintesi di neurotrasmettitori, la sintesi
di mielina, la crescita assonale e la trasduzione del segnale postsinaptico mediato da
recettore [208]. Tale metallo è quindi di fondamentale importanza per una corretta
embriogenesi in età fetale e per il mantenimento di una corretta funzionalità del SNC
nelle prime fasi dello sviluppo neonatale e durante la vita adulta. La Tabella 5.1
[209] elenca i principali ruoli fisiologici del ferro nel cervello.
Gaasch, J.A. et al., Neurochem
Res 2007;32:1196-1208
Tabella 5.1 Ruolo del ferro nello sviluppo del cervello e nel mantenimento della sua funzionalità.
44 5.2
PROPRIETÀ CHIMICHE DEL FERRO
Il ferro partecipa ai diversi processi metabolici mediante reazioni reversibili di
ossidazione del Fe2+ e di riduzione del Fe3+ che permettono il trasferimento di singoli
elettroni. Il ferro è un metallo di transizione del blocco d e i suoi orbitali d liberi
consentono alle specie ioniche del ferro (Fe2+, Fe3+, Fe4+) di legare diverse
biomolecole mediante atomi di ossigeno, azoto e zolfo. Il potenziale redox biologico,
lo stato di spin elettronico e quindi la reattività del ferro derivano dalla natura della
molecola a cui è legata la specie ionica del ferro. Tale configurazione, in aggiunta allo
stato di ossidazione del ferro stesso, detta la tipologia di reazione chimica e biologica
di cui è responsabile una biomolecola associata al ferro. In particolare, le reazioni che
coinvolgono il trasporto e il deposito di ferro, il trasferimento elettronico o
l’ossidazione/riduzione di altre molecole nell’organismo sono prevalentemente di tipo
redox e idrolitico o coinvolgono la formazione di complessi polinucleari [210].
La necessità del ferro per le normali funzioni fisiologiche ha reso indispensabile un
meccanismo finemente regolato per assicurare un effetto netto neutrale del ferro
assunto con la dieta [211]. Tale aspetto è di fondamentale importanza soprattutto per
il cervello, uno dei siti dell’organismo in cui si mantengono le concentrazioni più
elevate di ferro [212].
5.3
LOCALIZZAZIONE E CONCENTRAZIONE DEL FERRO
Il corpo umano contiene una media di 4 - 5 g di ferro, di cui la maggior parte
costituisce il gruppo eme delle proteine preposte al trasporto di ossigeno (65%
emoglobina e 4% mioglobina) ed è definito “ferro eme”. La quota rimanente forma il
ferro “non-eme” che è legato alle proteine plasmatiche (soprattutto alla transferrina
(Tf) ma anche debolmente all’albumina, ad aminoacidi a basso peso molecolare,
all’ATP e al citrato [213]) oppure è immagazzinato sotto forma di ferritina [212] (Ft, la
principale proteina di deposito intracellulare di ferro), nel sistema reticoloendoteliale e
nelle cellule parenchimali epatiche [208]. La concentrazione media di ferro nel siero è
9-30 µM (soprattutto legato alla Tf), mentre quella ematica (principalmente sotto
forma di emoglobina) è circa 8.5 mM [214].
Dopo il fegato, il cervello contiene la più elevata quantità di ferro (circa 60 mg di
“ferro non-eme” in un uomo normale adulto) [215, 216] diversamente distribuito nelle
varie strutture cerebrali [215]. Nel SNC di un uomo adulto e sano, il ferro è
sequestrato soprattutto nei gangli della base, nell’ippocampo, in alcuni nuclei
45 cerebellari e in altre regioni cerebrali subcorticali [217]. La substantia nigra e il globus
pallidus possono contenere livelli di ferro che eccedono quelli epatici (3.3-3.8 mM in
un cervello umano normale e adulto) mentre la concentrazione di “ferro non-eme”
nella corteccia parietale umana è circa 0.65 mM [216]. Tali elevate concentrazioni
marziali nel cervello potrebbero essere giustificate dalla sostenuta richiesta di
metabolismo ossidativo, necessario per mantenere i gradienti ionici di membrana, per
il trasporto assonale e per la trasmissione sinaptica [209, 218, 219].
5.4
5.4.1
OMEOSTASI DEL FERRO A LIVELLO PERIFERICO
Assorbimento del ferro attraverso le cellule della mucosa
intestinale
Ogni giorno, un soggetto sano ingerisce circa 12 - 18 mg di ferro eme e non-eme
(ferro inorganico – Fe2+ e Fe3+) con la dieta e di questi solo 1 - 2 mg sono assorbiti
esclusivamente nella forma ridotta Fe2+. Sulla membrana apicale dell’enterocita
coesistono due sistemi per la captazione delle due forme di ferro dietetico: il ferro
eme è trasportato nel citoplasma da un putativo recettore eme e diventa il substrato
dell’ossigenasi eme microsomiale che rilascia Fe2+, porfobilinogeno e CO [220]; il Fe3+,
dopo riduzione a Fe2+ da agenti riducenti nel tratto gastrointestinale (ascorbato) o
dalla reduttasi ferrica duodenale (Dcytb) [221] sulla membrana apicale dell’enterocita,
e direttamente il Fe2+ sono internalizzati mediante il DMT1 (divalent metal transporter
1, conosciuto anche come DCT1, divalent cation transporter 1 o Nramp2, natural
resistance associated macrophage protein 2) [222]. Il DMT1 trasporta nella stessa
direzione un protone e un atomo di Fe2+, oppure, non selettivamente, altri metalli
divalenti, quali manganese (Mn), rame (Cu), cobalto (Co), zinco (Zn), cadmio (Cd) e
piombo (Pb) [222]. Oltre che nell’epitelio duodenale, il DMT1 è stato identificato anche
negli eritrociti, nelle cellule epiteliali renali, nei cardiomiociti, nell’epitelio placentale
umano e nel cervello [208]. All’interno dell’enterocita, il pool di Fe2+ può subire due
diversi destini: quando i suoi livelli eccedono le necessità dell’organismo, è
incorporato in una molecola di ferritina; se invece è richiesto per le normali funzioni
fisiologiche, è trasportato verso la membrana basolaterale e quindi nella circolazione
sistemica mediante la ferroportina 1 (FPN1, chiamata anche IREG1), un trasportatore
transmembrana del ferro [221]. L’esportazione mediata da FPN1 è facilitata dalla
ferrossidasi legata alla membrana efestina, che ossida il Fe2+ appena rilasciato
46 dall’enterocita in Fe3+ e ne facilita quindi il legame con l’apo-transferrina (apo-Tf,
transferrina libera e non legata a ferro), la principale proteina per il trasporto in
circolo del ferro ferrico [223]. Nelle condizioni di saturazione della capacità di legame
della transferrina (Tf), il Fe3+ può legarsi ad altre molecole, costituendo il pool di ferro
non legato alla Tf (NTBI – non-Tf bound iron) [224] (Figura 5.1).
La regolazione dell’uptake duodenale di ferro e quindi dei livelli di tale metallo
nell’organismo è coordinata dall’epcidina, un ormone peptidico di piccole dimensioni
(25 aa) sintetizzato soprattutto dagli epatociti [225]. Il sovraccarico di ferro e
l’infiammazione
aumentano
l’espressione
dell’epcidina
che
limita
l’esportazione
cellulare di ferro (e quindi l’assorbimento di ferro dietetico) mediante il legame con la
FPN che subisce internalizzazione e degradazione intracellulare [225, 226]. Inoltre,
l’espressione di DMT1 è controllata dal fattore indotto da ipossia 2α (HIF-2α), che
coordina la trascrizione di tale proteina in risposta all’ipossia e al deficit marziale nella
mucosa duodenale [227].
Crichton, R. et al., Journal of Inorganic Biochemistry 2002;91:9-18
Figura 5.1
Rappresentazione schematica dell’assorbimento di ferro attraverso una cellula della
mucosa intestinale sana. A livello della membrana apicale dell’enterocita, il ferro dietetico non eme è
assorbito come Fe2+ tramite il DMT1 mentre il ferro eme è internalizzato da un recettore specifico e
degradato per liberare Fe2+. L’enterocita rilascia in circolo solo la quota di ferro necessaria per
l’organismo mentre l’eccesso marziale è trattenuto all’interno della ferritina. La liberazione del ferro
coinvolge il trasportatore IREG1 e l’ossidasi efestina collocati sulla membrana basolaterale a cui fa
seguito l’incorporazione del Fe3+ nella apotransferrina. Gli ioni Fe2+ possono essere rilasciati in
circolo anche liberi (NTBI) per una successiva ossidazione da parte della ceruloplasmina sierica.
47 5.4.2
Trasporto del ferro in circolo
In soggetti normali, Il ferro raggiunge una concentrazione sierica di 3, 5 µg/ml [224].
La Tf, una glicoproteina a singola catena polipeptidica di 78 kDa, è la principale
proteina di trasporto del ferro nella circolazione sanguigna. Ciascuna molecola
bilobata di Tf, costituita da due unità globulari alle estremità N- e C- terminali,
presenta due siti di legame reversibile per il Fe3+ con cui forma una struttura
tetradentata a 4 atomi mediante un residuo aminoacidico di istidina, uno di aspartato
e due di tirosina [206]. La Tf legata a due ioni Fe3+ è anche chiamata transferrina
diferrica (Fe2Tf) o olo-transferrina (holo-Tf). In un individuo adulto e sano, circolano
nel sangue circa 3 – 4 mg di ferro legati alla Tf e generalmente solo il 30% di tutta la
Tf circolante è saturata da tale metallo [209]. Solo in condizioni di severo sovraccarico
corporeo di ferro (concentrazioni plasmatiche di ferro maggiori di 42 µM), come
nell’emocromatosi, si registra la saturazione di Tf [210]. Studi pioneristici condotti da
Katz nel 1961 [228] hanno dimostrato che Fe2Tf è rapidamente eliminata dalla
circolazione sanguigna (emivita dell’ordine di 1.7h), mentre Tf subisce un centinaio di
cicli di legame, trasporto e rilascio del ferro prima della definitiva eliminazione dal
circolo (emivita dell’ordine di 7.6 giorni). Nella maggior parte delle cellule di
mammifero, la captazione del ferro è mediata dai recettori della transferrina (TfRs),
omodimeri collegati da ponti disolfuro e costituiti da due subunità glicosilate identiche
di 90 kDa [224].
Una quota molto esigua di ferro (meno dell’1%) non è veicolata alla Tf (NTBI – Non-Tf
bound iron) bensì a ligandi a basso peso molecolare (LMW), quali gli ioni citrato e
ascorbato e, in piccola percentuale, alle proteine albumina e ferritina [229] e all’ATP.
5.4.3
Trafficking cellulare del ferro
Il TfR1 è una proteina di membrana ubiquitaria con una struttura dimerica e, a valori
di pH neutri, presenta un’affinità elevata per Fe2Tf e bassa per apo-Tf. Tale affinità
selettiva non consente alla Tf libera di agire da inibitore competitivo della holo-Tf per
il legame con TfR1 [230]. L’interazione della Fe2Tf con TfR1 comporta la formazione di
un complesso che è internalizzato per endocitosi all’interno di vescicole rivestite di
clatrina, che, una volta internalizzate, perdono il proprio rivestimento e si fondono con
gli endosomi. Una pompa protonica ATP-dipendente acidifica (pH 5.5) il lume
dell’endosoma e provoca un cambiamento conformazionale della Fe2Tf e del TfR1 con
conseguente
rilascio
di
Fe3+
dalla
sua
proteina
chaperone
all’interno
del
compartimento endosomiale [231]. Lo ione Fe3+ libero è rapidamente ridotto a Fe2+
48 dalla reduttasi ferrica STEAP1-4 (six-transmembrane epithelial antigen of prostate 14) e quindi esportato nel citoplasma dalla proteina transmembrana DMT1 (divalent
metal transporter-1) [232]. Nell’endosoma acidificato, apo-Tf è ancora legata con
forte affinità al TfR1 e tale interazione previene la degradazione della Tf libera quando
l’endosoma si fonde con il lisosoma prima dell’esocitosi. Durante tale processo, il pH
ritorna a valori neutri provocando la dissociazione di apo-Tf dal TfR1 con conseguente
reciclaggio in circolo della Tf che può nuovamente legare due ioni Fe3+ [233] e
ripristino del TfR sulla membrana cellulare. Nel 1999 è stato identificato un recettore
omologo della Tf, denominato TfR2 [234], espresso preferenzialmente in alcuni
distretti (epatociti, eritrociti, cellule della cripta duodenali e neuroni dopaminergici) e
con un’affinità molto più bassa del TfR1 per la holo-Tf.
Nel citoplasma gli ioni ferro costituiscono un pool dinamico a basso peso molecolare o
“pool di ferro labile” (LIP – labile iron pool) o “pool di ferro chelabile” e sono coinvolti
in diversi processi cellulari in base alle necessità della cellula, quali il legame a
chaperones che donano ferro a specifiche proteine target [235], il sequestro nella
ferritina ed emosiderina e l’ingresso nei mitocondri. La ferritina è un eteropolimero di
24 subunità, solubile in acqua e ad elevato peso molecolare. Il ruolo principale di tale
molecola
consiste
nel
reciclaggio
del
ferro
per
la
sintesi
dell’eme
e
nella
compartimentalizzazione in una forma non reattiva del ferro libero che quindi non può
raggiungere elevate concentrazioni nel citoplasma e nel nucleo [236]. La ferritina è
raramente saturata poiché è in grado di trattenere da 2000 a 4500 ioni Fe3+ [237]. È
composta da catene leggere (ferritina L) e catene pesanti (ferritina H) che si
assemblano in diversi rapporti per formare una sfera cava in cui vengono inglobati gli
atomi di ferro essenzialmente come ferridriti. La ferritina H contiene un centro
ferrossidasico ed è coinvolta nell’ossidazione del Fe2+ a Fe3+, necessaria per
l’incorporazione del ferro nella ferritina, mentre la ferritina L è responsabile della
mineralizzazione del ferro e della sua conservazione [209]. In condizioni di
sovraccarico di ferro, la ferritina è degradata nei lisosomi e trasformata in depositi
ricchi in ferro disorganizzati conosciuti come emosiderina [211, 238]. In tale struttura
il ferro è conservato in forma insolubile e può quindi eccedere la quantità di ferro
legato alla Tf [209]. Sebbene alcuni studi dimostrino la possibile mobilitazione del
ferro dall’emosiderina [239], il ruolo fisiologico di tale molecola e del ferro in essa
contenuto è ancora poco conosciuto [215]. L’incremento del contenuto intracellulare di
ferro non è necessariamente immagazzinato nella ferritina o nell’emosiderina ma può
anche aumentare le dimensioni del LIP, sebbene in modo molto più transiente [240].
49 Il ferro è importante per la corretta funzionalità dei mitocondri, dove è incorporato in
cluster Fe-S e nelle proteine heme [231]. I meccanismi dell’uptake mitocondriale di
ferro non sono stati ancora confermati, sebbene sia stata ipotizzata la diffusione del
NTBI o la traslocazione della Fe2Tf extracellulare mediante i trasportatori mitocondriali
mitoferrina 1 o 2 con formazione di endosoma [241]. All’interno di tale organello
cellulare, la proteina fratassina agirebbe come chaperone del ferro intramitocondriale
[242].
Nelle cellule di mammiferi, l’esportazione di ferro, nella forma di Fe2+, è resa possibile
solo dalla ferroportina [243]. Tale proteina transmembrana è accoppiata ad una
ferrossidasi che ossida il Fe2+ a Fe3+ per renderlo immediatamente disponibile al
legame con Tf.
5.5
REGOLAZIONE DELL’OMEOSTASI CELLULARE DEL FERRO A
LIVELLO PERIFERICO
Nelle cellule di mammifero, l’omeostasi marziale è regolata dall’equilibrio tra
assorbimento,
deposito
intracellulare
e
utilizzo
di
ferro
ed
è
perseguita
prevalentemente nella fase della sintesi proteica (traslazione dell’mRNA in proteina)
piuttosto che in fase trascrizionale (sintesi di mRNA). L’esistenza di una regolazione
post-trascrizionale dell’omeostasi del ferro comporta che non sempre i livelli del
trascritto genico correlano con quelli della proteina [244]. Le sequenze regolatrici
dell’omeostasi del ferro (IREs – iron responsive elements) sono localizzate alle
estremità 5’ e 3’ della sequenza codificante di un mRNA, ovvero in corrispondenza di
regioni non codificanti o non tradotte (UTRs). Gli IREs al 5’-UTR sono solitamente
responsabili dell’inizio della trascrizione, ovvero del legame del ribosoma, mentre
quelli al 3’-UTR controllano la stabilità e la degradazione da parte delle ribonucleasi
dell’mRNA [224]. Nella maggior parte dei tipi cellulari conosciuti, sono state
identificate due proteine di legame degli IREs, denominate IRP-1 e IRP-2 (iron
regulatory protein 1 e 2) [245]. Tali proteine citoplasmatiche e strettamente correlate
agiscono come sensori del ferro convertendosi in due diverse forme [224] e regolando
l’omeostasi del ferro post-trascrizionale. Gli IREs sono presenti nell’mRNA di proteine
coinvolte nell’uptake (TfR e DMT1), nel deposito (Ft) e nell’esportazione di ferro
(FPN). Poiché i trascritti contenenti gli IREs non sempre subiscono dei cambiamenti
nei loro livelli in risposta a diversi stati di ferro, è necessario confrontare l’espressione
50 genica con i livelli proteici di tali trascritti per capire se le risposte ai diversi stati di
ferro siano regolate a livello genetico o post-trascrizionale [244].
In condizioni di bassa concentrazione cellulare di ferro, IRP1 e IRP2 si legano
direttamente e con alta affinità alla struttura a stelo ed ansa (“stem-loop”) degli IREs.
Nel dettaglio, il legame di IRP1/2 a livello della regione 3’ non tradotta dell’mRNA del
TfR1 protegge e stabilizza tale mRNA promuovendo la trascrizione di TfR1. Al
contrario, l’interazione di IRP1/2 con la regione 5’ non tradotta dell’mRNA della Ft ne
previene la traslazione riducendo l’espressione della Ft citoplasmatica e quindi la
capacità di deposito cellulare di ferro [210]. Si verifica quindi un aumento del ferro
disponibile a causa del simultaneo incremento dell’uptake di ferro tramite TfR1 e della
prevenzione del sequestro di ferro da parte della ft. Quando i livelli cellulari di ferro
sono elevati, il ferro libero lega IRP1/2 impedendone il legame con gli IREs. Ne
consegue una risposta cellulare opposta rispetto a quella osservata nei casi di deficit
di ferro, ovvero l’aumento della sintesi della Ft citoplasmatica e la degradazione del
TfR1 (Figura 5.2). I meccanismi dell’inibizione del legame IRP/IRE dipendono dalle
proteine coinvolte: IRP1-Fe subisce un cambio conformazionale che previene il legame
dell’IRE, mentre il complesso IRP2-Fe va incontro a degradazione mediante la via
ubiquitina-proteasoma [246]. Esistono due principali trascritti di mRNA di DMT1, di cui
uno contiene una sequenza IRE nella regione 3’ non tradotta che è disponibile al
legame con le proteine cellulari. L’mRNA di DMT1 è regolato in modo analogo al
trascritto di TfR ovvero mediante il controllo della stabilizzazione del sistema IRE/IRP
[208].
Sia IRP1 che IRP2 sono presenti nel cervello di ratto e umano [206].
Figura 5.2
Rouault, T.A., Nat Rev Neurosci, 2013;14(8):551-64
Regolazione post-trascrizionale dell’omeostasi marziale cellulare da parte del sistema
IRE/IRP.
51 L’omeostasi
dell’ossigeno
cellulare
regola
il
metabolismo
del
ferro
a
livello
trascrizionale mediante i fattori indotti dall’ipossia (HIFs) costituiti da una subunità
proteina citosolica HIF-1α ed una nucleare HIF-1β che insieme formano un
eterodimero di legame del DNA a livello della sequenza CREB. In condizioni di
normossia, HIF-1α è idrolizzato con una reazione che richiede Fe2+ come cofattore e
subisce ubiquitinazione. In caso d’ipossia, HIF-1α trasloca nel nucleo, forma un
dimero con HIF-1β e lega CREB inducendo la trascrizione di geni target tra cui quelli
codificanti per Tf, TfR1 and DMT1. Poiché il ferro è necessario per l’idrolisi di HIF-1α,
la riduzione dei livelli cellulari marziali aumenta la dimerizzazione di HIF-1α e HIF-1β e
quindi la trascrizione delle proteine coinvolte nell’uptake e nell’esportazione del ferro
[206].
5.6
OMEOSTASI DEL FERRO NEL SISTEMA NERVOSO CENTRALE
(SNC)
5.6.1
Ingresso del ferro nel SNC
5.6.1.1
Barriere del SNC
Nel SNC sono presenti due tipi di barriere: la prima è la barriera emato-encefalica
(BEE o BBB – blood-brain barrier) che impedisce ai nutrienti presenti nel sangue
arterioso di passare nel fluido interstiziale cerebrale e quindi di raggiungere il tessuto
nervoso; la seconda è la barriera emato-liquorale (BEL) o emato-fluido cerebrospinale
(BCB – blood-cerebrospinal fluid barrier) che ostacola il passaggio delle sostanze dai
capillari cerebrali di tipo arterioso al liquor cerebrospinale [207]. Poiché non esistono
barriere strutturali tra il fluido cerebrospinale (CSF) e quello interstiziale, è possibile
uno scambio libero di materiali tra questi due liquidi [208].
La base strutturale della BEE sono le cellule endoteliali che ricoprono i capillari
cerebrali ed esprimono le principali proteine delle giunzioni strette, quali occludina,
claudine e ZO1, che sigillano tra loro cellule adiacenti. Il lato abluminale delle cellule
endoteliali dei capillari cerebrali è circondato da tre strati cellulari: 1) una membrana
basale; 2) i periciti (30%); 3) i pedicelli astrocitari (90%) [247]. Questo complesso
sistema di giunzioni strette e di molteplici strati cellulari non consente la diffusione e
52 la migrazione di nutrienti e macromolecole di piccole dimensioni e di natura polare.
Pertanto, esiste un sistema di recettori e trasportatori che media il trasporto di tali
sostanze attraverso le membrane luminale e abluminale delle cellule endoteliali
polarizzate della BEE verso il SNC. Le sostanze che attraversano la BEE dalla
circolazione sanguigna entrano poi nel fluido interstiziale cerebrale.
La BEL è localizzata nel plesso coroideo, una struttura riccamente vascolarizzata e
polarizzata all’interno dei quattro ventricoli cerebrali e composta da tre strati cellulari:
1) le cellule epiteliali apicali che confinano con il CSF; 2) il sottostante tessuto
connettivo di supporto; 3) lo strato più interno di cellule endoteliali a contatto diretto
con il sangue [248]. Le cellule endoteliali del plesso coroideo presentano delle
fenestrature e quindi permettono alla holo-Tf circolante nei capillari cerebrali di
attraversare rapidamente le cellule endoteliali e di raggiungere la membrana
basolaterale dell’epitelio coroidale polarizzato, dove le giunzione strette tra le cellule
rendono necessario il passaggio del solo ferro. La BEL ostacola l’accesso di molecole,
proteine, ioni e macromolecole idrosolubili dal sangue al CSF ma è nota la sua
capacità di rimuovere sostanze dal CSF al sangue. Le funzioni principali della BEL
consistono nella produzione attiva e nella secrezione nel cervello del CSF e di
molecole critiche quali la transtiretina e la transferrina [208].
La rigida regolazione del traffico tra sangue e tessuti cerebrali da parte della BEE e
della BEL limita lo scambio di ferro e delle proteine associate tra i due compartimenti,
proteggendo così il cervello dalle fluttuazioni potenzialmente dannose dei livelli di
ferro sistemico [249]. Inoltre, tali sistemi di barriere consentono al cervello, mediante
meccanismi regolatori propri, di mantenere il controllo sulla propria omeostasi
marziale indipendentemente dallo stato di ferro periferico [244].
5.6.1.2
Trasporto
del
ferro
attraverso
la
barriera
emato-
encefalica (BEE)
In condizioni fisiologiche normali, il cervello regola l’omeostasi del ferro mediante tre
sistemi ben coordinati: 1) l’internalizzazione di ferro, mediata o meno da TfR,
attraverso le barriere del SNC; 2) l’immagazzinamento di ferro dipendente dalla
disponibilità cellulare di ferritina; 3) l’esportazione di ferro la cui entità è correlata al
flusso di CSF o al meccanismo di ritorno delle sostanze dal CSF al sangue [249];
[208].
Il ferro legato alla Tf è la specie principale internalizzata dal cervello. La holo-Tf,
circolante nei capillari cerebrali, è internalizzata per endocitosi nell’endotelio dei
53 capillari cerebrali dal recettore della transferrina 1 (TfR1), espresso con elevata
densità [209] sul lato luminale della BEE [250]. Nell’endotelio, la Fe2Tf dissocia: apoTf è reciclata nella circolazione sanguigna mentre il ferro è trasportato, probabilmente
da FPN, nel fluido interstiziale del compartimento cerebrale, attraverso la membrana
abluminale delle cellule endoteliali. Tuttavia, studi differenti non sono concordi
sull’effettiva presenza di tale trasportatore nell’endotelio dei capillari cerebrali [207].
In prossimità delle cellule endoteliali si proiettano i pedicelli astrocitari che esprimono
la ceruloplasmina (Cp) legata alla membrana dal glicosil fosfatidil inositolo (GPI). Tale
molecola con attività ferrossidasica ed antiossidante non è in grado di oltrepassare la
BEE e necessita quindi della sintesi cerebrale [251]. La Cp potrebbe facilitare sia
l’attività di esportazione del ferro da parte della FPN che il legame del Fe3+ ad apo-Tf,
sintetizzata e secreta prevalentemente dagli oligodendrociti e dall’epitelio del plesso
coroideo [252]. La holo-Tf neosintetizzata diffonde nel fluido del parenchima cerebrale
verso i neuroni e le cellule gliali esprimenti TfRs. Apo-Tf e holo-Tf ritornano quindi
nella circolazione sistemica mediante i villi aracnoidei e le vene cerebrali [250].
L’assorbimento di ferro non mediato da Tf potrebbe costituire un’altra via significativa
per l’uptake cerebrale di tale metallo come si evince dalla rilevante presenza di ferro
nel
cervello
di
animali
trattati
con
anticorpi
anti-TfR,
di
topi
transgenici
ipotransferrinemici o di modelli murini di saturazione della Tf in seguito ad iniezione
endovena di
59
FeCl3 [208]. Fisiologicamente, meno dell’1% del ferro circola nel sangue
non è legato a Tf. Di conseguenza, nella microcircolazione cerebrale locale, il ferro
libero potrebbe derivare dalla dissociazione da Tf in seguito al legame della holo-Tf
con TfR e potrebbe essere internalizzato nella BEE da DMT1 o altri trasportatori. E’
anche possibile che il ferro non legato a Tf nel parenchima cerebrale locale origini dal
rilascio cellulare di ferro. Sebbene Siddapa e collaboratori [253] abbiano dimostrato la
presenza di DMT1 nelle cellule endoteliali dei capillari cerebrali, l’espressione di tale
trasportatore nella BEE non è stata ancora pienamente confermata. Studi condotti su
ratti con una mutazione in DMT1 hanno infatti dimostrato che DMT1 non svolge un
ruolo essenziale nel trasporto di ferro attraverso la BEE [254]. Inoltre, Moos e
collaboratori [255] non sono stati in grado di identificare tale trasportatore nelle
cellule endoteliali cerebrali, che quindi potrebbero esprimere DMT1 solo a livelli molto
bassi. Quale meccanismo, oltre a DMT1, sia eventualmente utilizzato dalla BEE per
trasportare il ferro non legato a Tf rimane ancora una questione di dibattito [208].
Durante lo sviluppo, quando la BBB non è ancora completamente formata, avviene un
rapido ingresso di ferro nel sistema nervoso probabilmente derivante dal NTBI. Studi
54 condotti su cervelli di ratto in via di sviluppo hanno evidenziato un rapido influsso di
ferro in linea con l’aumentata espressione di TfR1 nei BCECs. Tale meccanismo
d’internalizzazione del ferro diventa il principale quando la BBB è completamente
sigillata e da tale momento in poi la captazione del ferro subisce un rallentamento
[206]. Tuttavia, l’assorbimento cerebrale di ferro non è regolato probabilmente solo
dai BCECs ma, come molte altre vie metaboliche, è caratterizzato da vie ridondanti
che interverrebbero nel caso in cui quella principale fosse interrotta [206].
5.6.1.3
Trasporto del ferro attraverso la barriera emato-liquorale
(BEL)
Oltre alle cellule endoteliali della BEE, un’altra via di accesso del ferro all’interno SNC
sono le cellule epiteliali del plesso coroideo [256], in cui sono presenti i trasportatori
(TfR1, DMT1 e FPN1), le proteine di deposito (Ft) e le proteine di regolazione del ferro
(IRPs e epcidina) (Tabella 5.2).
Zheng, W. and Monnot, A.D., Pharmacology & Therapeutics, 2012;13:177-188
Tabella 5.2 Principali proteine coinvolte nella regolazione del ferro: presenza nella BEE (BBB),
BEL (BCB), nel fluido cerebrospinale (CSF) e nel sangue e relative funzioni.
DMT1, FPN e TfR hanno una diversa localizzazione subcellulare nel tessuto del plesso
coroideo [257], il che potrebbe indicare come i tre trasportatori ricoprano distinti ruoli
55 nel trasporto di ferro tra i compartimenti sangue e CSF. DMT1 è distribuito in modo
polarizzato verso la membrana plasmatica apicale, mentre FPN è meno polarizzata e
presenta un profilo di espressione più diffuso nel citoplasma. TfR è localizzato
soprattutto
attorno
ai
nuclei
in
forma
di
clusters,
il
che
sembra
suggerire
un’immediata disponibilità di TfR sia sulla membrana apicale che su quella abluminale.
É interessante notare che DMT1, FPN e TfR non esistono nel nucleo.
Una volta raggiunti i capillari del plesso coroideo, la Fe2Tf e il ferro libero provenienti
dalla circolazione sistemica attraversano liberamente l’endotelio fenestrato per entrare
in contatto con la membrana abluminale dell’epitelio coroidale. A tale livello, la Fe2Tf è
assorbita mediante il processo classico di endocitosi mediata da TfR ed è trasportata
nel CSF dalla FPN. A differenza di TfR, disponibile su entrambi i lati della membrana
della superficie cellulare coroidale (sia verso il sangue che verso il CSF), DMT1 è
localizzato prevalentemente sulla membrana apicale a contatto con il CSF e tale
distribuzione polarizzata potrebbe suggerire una direzione preferenziale del flusso di
ferro attraverso la BEL. Poiché il ferro libero è presente sulla superficie cellulare di
entrambi i lati della membrana coroidale, DMT1 potrebbe veicolare selettivamente il
ferro libero dal CSF al sangue. L’efflusso di ferro mediato da DMT1 nella BEL potrebbe
quindi costituire un meccanismo di clearance tramite cui la concentrazione di ferro nel
fluido extracellulare cerebrale è mantenuta relativamente stabile. A causa del
gradiente di concentrazione del ferro tra il sangue (≈ 1.150 mg/L) e il CSF (0.02
mg/L), l’efflusso di ferro mediato da DMT1 è un processo attivo che richiede energia
[208].
La Figura 5.3 riassume l’ipotetico meccanismo di trasporto marziale nel cervello. Gli
ioni ferro presenti nella circolazione sistemica sono trasportati nel parenchima
cerebrale soprattutto attraverso la BEE. La correlazione tra la maggiore densità di
TfRs a livello dell’endotelio cerebrale nello striato e nell’ippocampo e la più elevata
concentrazione marziale in tali regioni [258] avvalora l’ipotesi che il trasporto di ferro
mediato da TfR nelle cellule endoteliali della BEE sia il principale responsabile della
regolazione dell’entità di ferro che entra nel parenchima cerebrale. Tuttavia, anche
una piccola percentuale di ferro libero è veicolata al SNC mediante DMT1 o altre
proteine carrier espresse sul lato luminale endoteliale della BEE. Una volta raggiunto il
fluido interstiziale mediante la FPN, il ferro, libero o legato alla Tf cerebrale, è
trasportato ai neuroni e alle cellule gliali oppure è rilasciato all’interno del CSF nei
ventricoli cerebrali. La concentrazione di ferro è mantenuta in equilibrio tra il fluido
interstiziale, il fluido intracellulare neuronale o gliale e il fluido cerebrospinale.
56 L’eccesso marziale nel CSF è catturato da DMT1 o da TfR nei microvilli apicali
dell’epitelio coroidale e trasportato nuovamente nel sangue. Complessivamente, è
probabile quindi che il ferro entri nel cervello attraverso la BEE ed esca dal SNC
mediante la BEL [208].
Zheng, W. and Monnot, A.D., Pharmacology & Therapeutics, 2012;13:177-188
Figura 5.3
Trasporto di ferro attraverso la BEE (BBB) e la BEL (BCB). La maggior parte delle
molecole di ferro nella circolazione sistemica è legata a Tf. A livello della BEE, il complesso Fe-Tf è
internalizzato nelle cellule endoteliali cerebrali tramite il TfR; una quota di ioni ferro liberi è invece
assorbita mediante DMT1 o altri trasportatori non ancora identificati. FPN esporta il ferro nel fluido
interstiziale dove è utilizzato dalle cellule cerebrali. Gli ioni ferro in eccesso nel fluido cerebrospinale
sono captati da DMT1 localizzato sui microvilli dell’epitelio coroidale e riportato nel sangue.
5.6.2
Espressione cerebrale dei geni associati al ferro
Diversamente dal fegato, il cervello non costituisce un deposito di ferro per
l’organismo ma immagazzina tale metallo solo per le proprie necessità. Approcci di
genetica molecolare hanno confermato l’espressione cerebrale endogena dei geni
associati al ferro e forniscono evidenze della probabile esistenza nel cervello di
meccanismi intrinseci di regolazione dell’omeostasi cerebrale di ferro. Sebbene siano
coinvolte molte proteine preposte anche alla regolazione dell’omeostasi marziale
periferica, il cervello potrebbe aver sviluppato meccanismi addizionali di regolazione
del ferro che coinvolgerebbero anche proteine non ancora caratterizzate [244].
Analisi mediante ibridazione in situ, Northern Blotting, RT-PCR e hanno fornito prove
evidenti in merito all’espressione endogena cerebrale dei trascritti genici di Tf, TfR1,
DMT1, Ft e FPN [244, 256, 259]. Sebbene la maggior parte delle cellule nell’organismo,
incluso il cervello, esprima tali proteine, la quantità di ciascuna varia ampiamente in
base al tipo cellulare e al suo stato di ferro. Nel cervello, analisi immunoistochimiche
hanno evidenziato una prevalente espressione di Tf negli oligodendrociti, di ferritina
57 nella microglia e di TfR1 nei neuroni. In generale, la maggior parte delle cellule del
SNC acquisisce il ferro mediante TfR1 e DMT1, lo accumula nella ferritina e lo esporta
tramite FPN1 [207]. Tuttavia, il metabolismo del ferro probabilmente differisce tra
neuroni, astrociti, oligodendrociti e microglia poiché ciascuno di questi tipi cellulari
possiede distinte caratteristiche metaboliche e architettoniche e regola l’omeostasi del
ferro, distribuendo e accumulando tale metallo in base alle specifiche necessità e
funzioni [207, 259]. Inoltre, le diverse componenti del SNC hanno acquisito una
specializzazione nella sintesi preferenziale dei geni associati al ferro:
•
i neuroni esprimono TfR1 [260], sebbene con una densità più bassa rispetto
alle cellule endoteliali della BEE [218] e quindi assorbono il ferro soprattutto per
endocitosi mediata da recettore. L’espressione di DMT1 [260] e del recettore della
lattoferrina [209] suggerisce anche l’uptake di una piccola minoranza di NTBI.
L’elevata presenza di DMT1 nei nuclei del ganglio basale, in particolare il nucleo
caudato, putamen e la substantia nigra, giustificherebbe gli alti livelli di ferro in tali
regioni [208].
•
Gli astrociti sono privi o presentano livelli molto bassi di TfR1 [209, 261],
internalizzano il ferro principalmente come NTBI [262] e sono i principali produttori di
Cp [251] legata da GPI. La Cp solubile, presente nel CSF a basse concentrazioni (1,5
µg/mL, circa 100 volte meno della concentrazione sierica), potrebbe derivare dalla
rottura del legame di GPI sugli astrociti.
•
Gli oligodendrociti maturi, a differenza degli analoghi immaturi, non esprimono
TfR1. Si è quindi ipotizzato che tali cellule acquisiscano il ferro dalla catena pesante
della ferritina o mediante molecole LMW [263]. Nel citoplasma, il ferro è poi
incorporato
nella
apo-Tf
prodotta
all’interno
degli
oligodendrociti
dove
è
immediatamente utilizzato per la sintesi di mielina o immagazzinato nella ferritina
[256]. La holo-Tf non è secreta dagli oligodendrociti [206] che costituiscono quindi un
sistema chiuso di regolazione del ferro. L’efestina, una ferrossidasi espressa in tutto il
SNC, è sintetizzata soprattutto dagli oligodendrociti [207].
•
I neuroni [255] e gli astrociti esprimono FPN che è affiancata dalla proteina
precursore amiloide (APP) e dalla ceruloplasmina (Cp)
entrambi con attività
ferrossidasica [206, 244].
La FPN è presente con maggiore densità nei tessuti a contatto con sangue e CSF ma è
anche ampiamente espressa in tutto il SNC e all’interno delle vescicole presinaptiche
permettendo al ferro di essere trasportato dal citoplasma fino allo spazio sinaptico e
consentendo alle membrane pre- e post-sinaptiche di essere esposte agli ioni ferrosi
58 liberi. Il ruolo del ferro all’interno delle vescicole sinaptiche è ancora sconosciuto ma
potrebbe essere coinvolto, almeno in parte, nel meccanismi di trafficking del ferro nel
SNC [263].
Diversamente dal plasma, la capacità di legame del ferro nel CSF è minima a causa
della ridotta concentrazione di Tf (0.21 – 0.28 µM) e Cp (5.8 – 6.8 nM) e degli elevati
livelli di acido ascorbico (78 µM) (che mantiene il ferro nella sua forma ridotta) e di
citrato (175 µM). In condizioni normali, le concentrazioni di ferro nel CSF eccedono la
capacità di legame di Tf che è completamente saturata nel ratto e nell’uomo con un
rapporto molare ferro:Tf di 2.07. Poiché l’affinità di legame di Tf per Fe3+ diminuisce
all’aumentare dell’acidità, il pH del fluido extracellulare cerebrale (pH 7.3) favorisce la
dissociazione del ferro dalla Tf, aumentando la percentuale di NTBI potenzialmente
internalizzabile da neuroni e cellule gliali [209].
Nel cervello, un’elevata percentuale di ferro è conservata nelle cellule gliali e
prevalentemente nella sostanza bianca, dove è legata alla ferritina nella sua forma
solubile. Il CSF presenta livelli molto più bassi rispetto a quelli plasmatici di ferritine
circolanti (6.67 pM), molecole prevalentemente non glicosilate che potrebbero essere
rilasciate da cellule morte oppure sintetizzate e secrete nel cervello dove sono
espressi anche i recettori della ferritina [209].
La Tabella 5.3 compara le concentrazioni di ferro e delle sue proteine di legame nel
siero e nel CSF.
CONCENTRAZIONE DEL FLUIDO
CONCENTRAZIONE
CEREBROSPINALE
SIERICA
Ferro non eme
0,4-1,2 µM o 0,3-0,75 µM
9-30 µM o 54-89 µM
Ferro libero
0,01-0,1 µM
Negativo
Transferrina
0,21 µM* o 0,28 µM**
25 µM***
Ferritina
6,67 pM
0,3-0,7 nM
Citrato
175 µM
≈ 90 µM
Ascorbato
≈ 78 µM
≈ 25 µM
Ceruloplasmina
5,8-6,8 nM
1,6-3,4 µM
Lattoferrina
0,075 nM
5 nM o 16 nM
Albumina
2,5 µM
0,7 mM
Gaasch, J.A. et al., Neurochem Res, 2007;32:1196-1208
Tabella 5.3 Concentrazione di ferro e delle sue molecole di legame nel fluido cerebrospinale e nel
siero. Nota: ciascuna molecola di Tf può legare 2 ioni ferro e quindi le concentrazioni effettive dei siti
di legame del ferro sono: *0,42 µM, **0,56 µM, *** 50 µM.
59 5.7
REGOLAZIONE DELL’OMEOSTASI CELLULARE DEL FERRO NEL
SNC
Numerosi tipi cellulari nell’organismo sono in grado di ridurre il loro contenuto
marziale mediante divisione cellulare. Le cellule neuronali non possono però sfruttare
tale processo poiché sono post mitotiche e devono affidarsi rigidamente a meccanismi
di omeostasi marziale per prevenire il danno ossidativo indotto dall’eccesso di ferro
[209].
Tutte le cellule del SNC esprimono sia IRP-1 che IRP-2, sebbene IRP-2 sia presente in
maggior quantità [207]. Il sovraccarico sistemico di ferro regola l’espressione
cerebrale delle proteine chiave per l’omeostasi marziale principalmente a livello posttrascrizionale come confermato dalla mancata o lieve variazione dell’espressione
genica di TfR1, Ft H, IRP2 e Cp in cuccioli di ratto dopo supplementazione diretta
[264] o indiretta (tramite la madre) di ferro [265, 266]. Il cervello, analogamente alla
periferia, risponde al sovraccarico di ferro riducendo i livelli proteici di TfR1, con
conseguente restrizione dell’assorbimento marziale, e aumentando quelli della Ft, da
cui ne deriva l’incremento dei depositi di ferro [267]. Sono state anche osservate delle
variazioni nei livelli proteici di Cp e nell’espressione genica e proteica dell’efestina ma
l’entità e la direzione dei cambiamenti differiscono tra le varie regioni cerebrali [244].
Sebbene una variante di DMT1 contenga un IRE, tale trasportatore nel cervello non
subisce
una
variazione
nell’espressione
genica
e
proteica
in
seguito
a
supplementazione di ferro dietetico, diversamente da quanto accade nell’intestino e
nel fegato. É probabile che la regolazione di DMT1 richieda, oltre al sistema IRE/IRP,
fattori cellula- o tessuto-specifici che non sono presenti nel SNC [268]. L’eccesso di
ferro comporta inoltre un aumento dell’espressione di FPN negli astrociti e nei neuroni
[209], con conseguente incremento dell’efflusso di ferro da tali cellule.
L’ipotetico ruolo dell’epcidina nella regolazione dei depositi cerebrali di ferro non è
stato ancora chiarito. Studi di espressione genica (real-time RT-PCR, ibridazione in
situ) hanno rivelato un’ampia distribuzione dei trascritti dell’epcidina nel cervello
umano e murino, sebbene tali livelli siano più bassi rispetto a quelli epatici [269, 270].
E’ ancora questione di dibattito se la BEE e la BEL limitino l’accesso dell’epcidina
periferica ma numerose evidenze suggeriscono che il cervello potrebbe possedere
meccanismi omeostatici intrinseci per l’up-regolazione dell’epcidina endogena in
risposta ad agenti stressogeni [244]. L’aumentata espressione di epcidina potrebbe
ridurre i livelli di FPN nei neuroni e negli astrociti, con conseguente diminuzione sia
del rilascio di ferro dai neuroni che dell’uptake cerebrale di tale metallo. Tale
60 meccanismo
contribuirebbe
a
proteggere
il
cervello
dall’aumento
dei
livelli
extracellulari di ferro in presenza di stimoli infiammatori e agenti stressogeni [244].
Studi di espressione genica e proteica hanno sollevato dei dubbi in merito all’esistenza
nel cervello di meccanismi regolatori della trascrizione dell’epcidina. La proteina
emojuvelina è stata identificata, seppur a concentrazioni molto basse, nel cervello di
topo mentre l’analisi RT-PCR ha escluso la presenza del trascritto per tale proteina nel
cervello murino e umano [270]. Il trascritto per il TfR2 è stato invece osservato solo
nel cervelletto [270]. L’espressione genica e proteica di HFE è confinata negli astrociti
e nelle cellule endoteliali capillari di cervelletto, corteccia e talamo, nel plesso coroideo
e nelle cellule ependimali, dove HFE co-localizza con TfR1 [244]. Tale profilo
d’espressione ha suggerito l’ipotetico contributo di HFE nella regolazione fisiologica
dell’uptake cerebrale di ferro, sebbene studi condotti su un modello murino knockout
per Hfe [271] o in topi deficienti per la β2-microglubulina, che indirizza HFE sulla
superficie cellulare [272], abbiano evidenziato l’esistenza di meccanismi compensatori
in assenza di HFE. Dalla letteratura non emergono studi in merito all’eventuale
capacità di un processo infiammatorio di aumentare l’espressione di HFE e TfR2 nel
cervello con conseguente incremento dei livelli di epcidina cerebrale endogena [244].
La Tabella 5.4 elenca le funzioni fisiologiche delle proteine responsabili del trasporto
e del deposito di ferro e le modificazioni dei loro livelli indotte dal sovraccarico
marziale.
Gaasch, J.A. et al., Neurochem Res, 2007;32:1196-1208
Tabella 5.4 Funzione delle molecole di legame del ferro e variazione nella loro concentrazione in
risposta al sovraccarico marziale.
61 6.
TOSSICITÀ DEL SOVRACCARICO DI FERRO A
LIVELLO CENTRALE
6.1
ACCUMULO FISIOLOGICO DEL FERRO NEL CERVELLO
Nell’uomo, il contenuto cerebrale di ferro è basso in tutte le regioni cerebrali alla
nascita e aumenta progressivamente con l’età. L’invecchiamento comporta un
accumulo progressivo di ferro nel cervello [273] e principalmente in aree associate ad
attività motoria, quali il nucleo rosso, il nucleo dentato, la substantia nigra e il globus
pallidus [207, 216]. Nel corpo striato, il ferro è accumulato negli oligodendrociti, negli
astrociti, e nella microglia. Le concentrazioni di ferro presenti nei gangli della base,
paragonabili a quelle epatiche, sono le più elevate di tutto l’organismo [249]. Tali
regioni cerebrali si arricchiscono anche in Ft [274] che, nell’uomo, tende ad
accumularsi dalla terza decade di vita e a co-localizzare con il ferro [273]. I fattori che
favoriscono l’accumulo regionale di ferro e la funzione di tale deposito non sono
ancora noti. E’ possibile che alcuni tipi di neuroni e/o oligodendrociti specializzati, di
astrociti o di microglia siano programmati per sintetizzare quote elevate di Ft e per
creare quindi un deposito di ferro sequestrato da Ft nel SNC. L’accumulo marziale
dipendente dall’età non è unicamente associato a patologie neurodegenerative e
quindi tali cellule ricche in ferro legato a Ft non sono dannose per l’organismo [207].
La degenerazione di un’area cerebrale ricca in ferro comporta una variazione della
composizione cellulare e del contenuto marziale di quella regione. Quando tali cellule
ricche in ferro muoiono, la microglia e/o i macrofagi provenienti dalla circolazione
periferica fagocitano i detriti cellulari aumentando quindi il loro contenuto in ferro.
Inoltre, la microglia attivata esprime elevate quantità di ferritina [207].
L’accumulo di quantità eccessive di ferro in tessuti, cellule e organelli è associato a
disordini patologici. Oltre alle classiche sindromi da sovraccarico di ferro primario o
genetico (emocromatosi) e secondario (quali le talassemie), esistono molte altri
disordini associati a livelli elevati di ferro. Numerose patologie neurodegenerative,
quali il morbo di Alzheimer, di Parkinson, di Huntington, l’encefalopatia da HIV, le
malattie dei gangli della base, la sindrome di Hallervorden Spatz e l’atassia di
Friedrich sono caratterizzate da alterazioni dell’omeostasi centrale di ferro [224].
L’accumulo cerebrale di ferro in tali patologie è stato evidenziato da colorazioni
istochimiche per il ferro, da tecniche spettroscopiche e tomografiche e dall’imaging a
risonanza magnetica (MRI), mentre analisi biochimiche hanno dimostrato il contributo
62 del ferro nella patogenesi di tali malattie [244]. Studi di genetica molecolare condotti
su modelli di patologie neurodegenerative hanno identificato dei cambiamenti
nell’espressione di geni associati al ferro [244]. Tuttavia, nessuna delle tecniche
suddette ha chiarito se le alterazioni dell’omeostasi marziale, riscontrabili nelle
patologie neurodegenerative, siano la causa primaria della degenerazione neuronale e
quindi abbiano un ruolo primario nella patogenesi di tali malattie o se insorgano come
risposta secondaria alla morte neuronale o ad altri processi tipici della patologia
degenerativa [207].
L’accumulo di ferro nel cervello potrebbe essere migliorato dal trattamento con agenti
chelanti che ridurrebbero le ossidazioni catalizzate dal ferro di DNA, proteine e lipidi
[273]. Tuttavia, le terapie più comunemente utilizzate per il trattamento di disordini
sistemici associati a livelli eccessivi di ferro (flebotomia, agenti chelanti, modificazione
della dieta) non sono ugualmente efficaci nella correzione delle alterazioni centrali
[244].
6.2
MECCANISMI DI TOSSICITÀ DA SOVRACCARICO DI FERRO A
LIVELLO CENTRALE
II mantenimento dei livelli marziali in un intervallo innocuo per l’organismo è
necessario per ovviare all’insorgenza di neurotossicità che può manifestarsi come
danno ossidativo ma anche come morte cellulare e tumorigenesi [210, 275].
Nonostante il cervello possieda rigidi meccanismi intrinseci per la regolazione dei livelli
di ferro libero, tale metallo si accumula progressivamente nel SNC dei mammiferi in
seguito ad invecchiamento o in presenza di un sovraccarico marziale corporeo e una
quota presente nel parenchima cerebrale e nel CSF rimane attivo nelle reazioni redox.
In particolare, in condizioni patologiche di sovraccarico marziale, il LIP diventa troppo
esteso da poter essere sequestrato nella Ft e i sistemi di controllo dell’omeostasi
marziale cerebrale sono sopraffatti [209]. L’eccesso di ferro può indurre danno
neuronale poiché il Fe2+, rilasciato da Ft e Tf ai valori di pH acido del fluido
extracellulare [214], unitamente al ferro del LIP, è disponibile all’interazione con
molecole quali i radicali superossido [276] e l’ascorbato [277]. Il danno cellulare
indotto dal ferro è quindi dipendente dall’incorporazione di tale metallo nella Ft [209].
Molte caratteristiche biochimiche e fisiologiche rendono il cervello dei mammiferi
particolarmente vulnerabile ai danni indotti dal ferro e dalle sue reazioni redox. Tra le
principali rientrano:
63 •
il consumo di elevati livelli di ossigeno;
•
l’eccessiva generazione di ROS (reactive oxygen species) da parte dei mitocondri
poco efficienti dei neuroni post-mitotici invecchiati;
•
la suscettibilità del SNC alla perossidazione lipidica a causa dell’elevato contenuto
cerebrale di colesterolo e di acidi grassi polinsaturi facilmente ossidabili;
•
l’abbondanza di neurotrasmettitori ossidabili (ad es. dopamina) e potenzialmente
tossici (glutammato);
•
la scarsa quantità di enzimi e composti antiossidanti [217]
L’entità della tossicità marziale è determinata dalla localizzazione cellulare di tale
metallo (citoplasmatica o lisosomiale), dalla sua forma biochimica (ferritina o
emosiderina) e dall’abilità della cellula di prevenire la generazione e la propagazione
dei ROS mediante l’attivazione di meccanismi di difesa [224]. Diversamente dal
fegato, i danni causati dall’eccesso di ferro a livello cerebrale hanno una bassa
probabilità di reversibilità poiché il cervello ha una capacità limitata di riparo e
rigenerazione cellulare [244].
6.2.1
Ferro e stress ossidativo
L’efficienza della reazione redox tra Fe2+ e Fe3+ è fondamentale per le numerose
reazioni biochimiche che coinvolgono il ferro. Tuttavia, tale abilità di scambio
elettronico rappresenta un potenziale rischio biologico all’interno della cellula, perché
in condizioni di aerobiosi il ferro può catalizzare la genesi di radicali nocivi, attraverso
la reazione di Fenton [209]. Nel dettaglio, una quantità catalitica di Fe2+ (un proossidante 5 volte più potente del Fe3+) è sufficiente a reagisce con intermedi reattivi
dell’ossigeno, inclusi il perossido d’idrogeno (H2O2) e l’anione superossido (O2-) per
generare specie radicaliche libere molto reattive quali il radicale idrossilico (OH°):
Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH° + OH- [278]
Tracce di Fe3+ possono reagire con H2O2, anche se questa reazione procede
lentamente a pH fisiologico:
Fe3+ + H2O2 → Fe2+ + O−2 + 2 H+
Sono possibili anche le seguenti reazioni:
OH° + H2O2 → H2O + H+ + O−2
O−2 + Fe3+ → Fe2+ + O2
OH° + Fe2+ → Fe3+ + OHLa riduzione del Fe3+ da parte dell’ascorbato o altri agenti riducenti cellulari rigenera
lo ione Fe2+, ovvero la forma di ferro attiva nella reazione di Fenton (Fe3+ + O2- è Fe2+
+ O2) che entra nuovamente nel ciclo di ossidazione-riduzione, chiamato ciclo redox.
64 La quantità di OH° prodotta è direttamente proporzionale all’entità di ferro reattivo
[278]. I ROS sono prodotti inevitabili della respirazione aerobica, possono essere
generati durante reazioni enzimatiche nei perossisomi, nel reticolo endoplasmico e nel
citoplasma, o dal complesso, legato alla membrana, della NADPH ossidasi, espresso
primariamente nei fagociti neutrofili e nei macrofagi ed importante per la difesa
antimicrobica dell’organismo. In un SNC in cui c’è un eccessivo accumulo di ferro, i
ROS derivanti dal ferro potrebbero facilitare: (I) la bio-attivazione di pro-tossine,
come la conversione di MPTP (1-metil 4-fenil 1,2,3,6-tetraidro-piridina) a MPP+ che
provoca la morte dei neuroni dopaminergici mediante l’inibizione della respirazione
mitocondriale [279]; (II) l’attivazione di un signaling cellulare aberrante; (III)
scompensi bio-energetici; (IV) disfunzioni dei proteosomi; (V) aggregazione proteica e
formazione di inclusioni; (VI) alterazioni elettrofisiologiche; (VII) sinaptolisi, apoptosi
e necrosi [217]. Il danno tissutale da eccessiva produzione di ROS deriva dalla
capacità di tali specie di reagire con un’ampia gamma di costituenti cellulari: i residui
aminoacidici, promuovendone l’ossidazione; il DNA, provocando la rottura dei
filamenti o favorendo la modificazione delle basi puriniche e pirimidiniche; i lipidi di
membrana, innescando una reazione a catena di radicali liberi conosciuta come
perossidazione lipidica che promuove danno e stress ossidativo severo. Studi in vitro e
in vivo hanno dimostrato che l’esposizione dei neuroni al ferro induce un aumento
dose-dipendente della perossidazione lipidica con conseguente morte cellulare per
apoptosi
e
tale
effetto
è
risultato
attenuato
dall’utilizzo
dell’agente
chelante
deferoxamina [209]. Nel cervello [280], i principali bersagli del danno ossidativo da
sovraccarico di ferro sono i complessi respiratori della membrana mitocondriale
interna. La morte degli astrociti indotta dai perossidi coinvolge la generazione dei
radicali di O2- all’interno dei mitocondri con conseguente perdita del potenziale di
membrana mitocondriale e deplezione di ATP [209, 281].
Livelli fisiologici di ROS sono indispensabili per meccanismi cellulari quali il controllo
d’infezioni o la coordinazione di processi infiammatori [282]. Sebbene le cellule siano
adeguatamente fornite di un’ampia gamma di enzimi citoprotettivi e antiossidanti,
condizioni patologiche quali la flogosi cronica, il danno da ischemia-riperfusione o la
neurodegenerazione sovrastano tali meccanismi cellulari endogeni con conseguente
generazione incontrollata di radicali liberi [224]. Un eccesso di ferro aggrava lo stato
di stress ossidativo e conseguentemente accelera la degenerazione tissutale. Gli
antiossidanti quali la superossido dismutasi, che accelera le reazioni neutralizzanti O2-,
la catalasi e la glutatione perossidasi, che decompongono direttamente H2O2,
cooperano per contrastare il danno da radicali liberi. Per contrastare gli effetti deleteri
65 dei ROS, le cellule eucariote attivano inoltre dei meccanismi di risposta, quali la
modulazione dell’espressione genica tramite stimolazione del fattore trascrizionale
NFκB. In cellule non soggette a danno ossidativo, i dimeri di NFκB (p50/p65 o p50/crel) sono sequestrati nel citoplasma da una famiglia di inibitori proteici chiamati IκB.
L’aumento cellulare dei ROS induce la rimozione per fosforilazione di IκB, con
conseguente traslocazione nel nucleo di NFκB che si lega a sequenze consenso di
DNA. Ne deriva la trascrizione di numerosi geni importanti dal punto di vista
immunologico, di citochine e dei loro recettori, di fattori di crescita e di molecole di
adesione cellulare [224].
L’eme
ossigenasi
1
(HO-1)
è
un
enzima
inducibile
che
catalizza
lo
stadio
cineticamente limitante della degradazione dell’eme a biliverdina, monossido di
carbonio e ferro. HO-1 è attivato in modo ubiquitario nelle risposte cellulari di
protezione contro lo stress ossidativo e la sua espressione è stata descritta in
microglia, astrociti e neuroni in diverse alterazioni patologiche cerebrali quali la
scrapie, il morbo di Parkinson e di Alzheimer [224].
6.2.2
Ferro e specie reattive dell’azoto
L’ossido nitrico (NO), prodotto dalla sintetasi inducibile dell’ossido nitrico (iNOS), è un
potente agente antimicrobico endogeno e la sua reazione con O2- porta alla
formazione dell’anione perossinitrito (ONOO-), una specie estremamente tossica per la
cellula. Studi in vitro hanno dimostrato che la trascrizione di iNOS è controllata dal
ferro libero intracellulare: quote elevate di ferro riducono l’espressione di tale enzima,
mentre la deplezione di tale metallo mediante chelanti del ferro (Deferoxamina) o
livelli marziali ridotti sortiscono l’effetto opposto [283]. Tale effetto è probabilmente
attribuibile alla presenza di un sito sensibile al ferro a monte del gene iNOS, definito
NF-IL6 [284].
6.3
SUSCETTIBILITÀ DELLE CELLULE CEREBRALI ALLO STRESS
OSSIDATIVO
Le cellule cerebrali, neuroni, astrociti e microglia, sono più suscettibili allo stress
ossidativo catalizzato dall’eccesso di ferro poiché possiedono meccanismi antiossidanti
relativamente bassi [285], soprattutto per quanto concerne l’attività di catalasi [209]
e i livelli di glutatione e di glutatione perossidasi.
66 L’incremento dei depositi cerebrali di ferro con l’invecchiamento [286] avviene
principalmente in regioni spesso associate a disordini neurodegenerativi [224] e
potrebbe quindi contribuire alla patogenesi di tali disturbi.
Anche gli astrociti, che forniscono protezione e supporto trofico ai neuroni, sono
suscettibili allo stress ossidativo indotto dai perossidi aumentati dal sovraccarico di
ferro con conseguente riduzione della loro funzionalità. L’induzione di NO limita gli
effetti negativi del ferro negli astrociti suggerendo l’esistenza di un’interazione tra
ferro e NO [287].
6.4
ALTRI MECCANISMI DI TOSSICITÀ DEL SOVRACCARICO DI
FERRO NEL SNC
Dixon e collaboratori [288] hanno coniato il termine “ferroptosi” per indicare una via
di morte cellulare correlata a RAS e dipendente dai livelli intracellulari di ferro. Tale
via non presenta gli elementi tipici dei processi apoptotici (attivazione di caspasi e
rilascio del citocromo c mitocondriale), non è innescata dopo chelazione del ferro o
inibizione del suo assorbimento, non è indotta dalla reazione di Fenton ma è correlata
alle attività enzimatiche ferro dipendenti. In effetti, l’accumulo inappropriato di ferro
potrebbe danneggiare una serie di proteine quali la Ca2+-ATPasi, il trasportatore del
glutammato, la Na+/K+-ATPasi e il recettore NMDA (N-methyl-D-aspartate) e ossidare
lipidi tra cui il colesterolo, le ceramidi e la sfingomielina con conseguente disfunzione
sinaptica e morte neuronale [206].
Nelle malattie neurodegenerative, il ferro interagisce con le proteine correlate alle
varie patologie, quali la β-amiloide, la tau, il prione e la α-sinucleina, accelerando, in
vitro, la loro aggregazione e aggravando, in vivo, l’induzione di stress ossidativo e
l’attivazione delle vie di morte cellulare da parte di tale proteine. Recentemente è
anche emerso il ruolo delle proteine associate alle malattie neurodegenerative nella
regolazione del metabolismo marziale: il trascritto di APP (amyloid-β precursor
protein) presenta un IRE nel suo 5’-UTR e facilita l’esportazione di ferro in vitro e in
vivo; la proteina tau media il trafficking di APP e la sua riduzione blocca l’efflusso
marziale con conseguente accumulo intracellulare di ferro; l’mRNA della α-sinucleina
mostra un IRE all’estremità 5’ non tradotta e, analogamente al prione, agisce come
una ferroreduttasi per modulare l’uptake cellulare di ferro; la mancanza della proteina
huntingtina provocherebbe una riduzione dei livelli di ferro e di produzione di
emoglobina [206].
67 6.5
SINDROMI DA SOVRACCARICO DI FERRO
Qualsiasi condizione che determina un aumentato ingresso di ferro nell'organismo
conduce inevitabilmente allo sviluppo di un sovraccarico di ferro. Con il termine
“sindrome da sovraccarico di ferro” oggi s'intende una condizione derivante da un
aumento del contenuto di ferro totale nell’organismo indipendentemente dalla
presenza di danno tissutale. Il sovraccarico di ferro può essere suddiviso secondo
diversi criteri: la causa del sovraccarico, la via di accesso del ferro all'interno
dell'organismo e la sede principale di accumulo del ferro [289].
Da un punto di vista generale il sovraccarico di ferro può essere classificato come
primitivo o secondario. In alcuni casi, la causa specifica responsabile del sovraccarico
di ferro è ben definita, mentre in altri, il meccanismo che conduce al suo sviluppo è
ancora incerto e queste forme di sovraccarico di ferro restano ignote nella loro
origine. Infine, il sovraccarico di ferro può anche essere il risultato di una
combinazione di fattori geneticamente determinati ed acquisiti.
6.5.1
Sovraccarico di ferro primitivo
Il sovraccarico di ferro primitivo è causato da mutazioni in geni primariamente
preposti alla regolazione del metabolismo marziale e del suo equilibrio (Tabella 6.1).
E’
caratterizzato
da
ridotti
livelli
di
epcidina
con
conseguente
aumento
dell’assorbimento intestinale del ferro assunto tramite la dieta e quindi dei depositi
corporei di tale metallo.
L'esempio meglio conosciuto di sovraccarico di ferro primitivo è l'emocromatosi
ereditaria, in cui il ferro è assorbito in quantità eccessiva per un difetto nel controllo
del passaggio del ferro dalla cellula intestinale al sangue.
Secondo l'OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) sono state identificate 5 forme
di emocromatosi: emocromatosi classica (HH: HFE-related hemochromatosis), o di
tipo 1; emocromatosi giovanile (JH: Juvenile Hemochromatosis) o di tipo 2, della
quale esistono due forme; emocromatosi di tipo 3 e di tipo 4 [290].
6.5.2
Sovraccarico di ferro secondario
Il termine sovraccarico di ferro secondario definisce un gruppo eterogeneo di
condizioni croniche, genetiche o acquisite, in cui l’eccesso marziale non è dovuto a un
difetto primario nel sistema di regolazione del metabolismo del ferro ma è secondario
ad altre patologie, prevalentemente l’anemia [291] (Tabella 6.2). L’accumulo
tissutale di ferro potrebbe essere dovuto o associato a difetti nella produzione di
globuli rossi (anemie diseritropoietiche), ad epatopatie croniche di varia eziologia, alla
68 somministrazione eccessiva di ferro per via parenterale
(trasfusioni, iniezioni di
preparati contenenti ferro per via venosa o intramuscolare) oppure all’aumentata
assunzione di ferro per via orale (dieta, composti contenenti ferro, aumentato
assorbimento di ferro per eritropoiesi inefficace o patologia epatica) [291]. Come già
menzionato, in alcune di queste condizioni è possibile che vi siano interazioni e
sinergismi con le cause primitive di accumulo di ferro.
HFE RELATED
HEMOCHROMATOSIS (TYPE1):
C282Y/C282Y
C282Y/H63D
Other HFE related Hemochromatosis
NON HFE RELATED
HEMOCHROMATOSIS
JUVENILE HEMOCHROMATOSIS
(TYPE2):
Type2A-Hemojuvelin mutations
Type2B-Hepcidin mutations
TRANSFERRIN RECEPTOR 2
HEMOCHROMATOSIS (TYPE3)
FERROPORTIN DISEASES
(TYPE4):
Classical
Nonclassical
Siddique, A. and Kowdley, K.V., Alimentary Pharmacology & Therapeutics 2012; 35: 876-893.
Tabella 6.1 Sindromi da sovraccarico di ferro primitive
69 IRON-LOADING ANEMIA:
Thalassemic syndrome
(β-Thalassaemia)
Sideroblastic Anemia
Chronic Hemolytic Anemia
Aplastic Anemia
Pyruvate Kinase Deficiency
CHRONIC LIVER DISEASES
Hepatitis C Infection
NAFLD
Alcoholic liver disease
Porphyria Cutanea Tarda
IATROGENIC
Red Blood Cell Transfusion
Long-term hemodialysis
MISCELLANEOUS
Aceruloplasminemia
African iron overload
Neonatal iron overload
Siddique, A. and Kowdley, K.V., Alimentary Pharmacology & Therapeutics 2012; 35: 876-893.
Tabella 6.2 Sindromi da sovraccarico di ferro secondarie
6.6
PATOLOGIA
DEL
SISTEMA
GnRH-SECERNENTE:
IPOGONADISMO
L’integrità dell’asse HPG è fondamentale per garantire la normale differenziazione
sessuale durante la vita fetale, l’insorgenza della pubertà e il mantenimento della
capacità riproduttiva nell’adulto.
Con il termine ipogonadismo s’intende una condizione caratterizzata da un’alterata
funzione gonadica che influenza negativamente la gametogenesi e/o la steroidogenesi
[4]. La disfunzione che porta all'ipogonadismo può localizzarsi a vari livelli nell'asse
HPG:
•
se
interessa
le
gonadi,
si
classifica
come
ipogonadismo
primario
o
ipergonadotropo, caratterizzato da una ridotta produzione di testosterone che
comporta un aumento nei livelli sierici delle gonadotropine LH e FSH [292];
•
se coinvolge primariamente l’ipotalamo o l'ipofisi, si parla di ipogonadismo
secondario o ipogonadotropo (HH), in cui il deficit comporta, rispettivamente,
un’assente o inappropriata secrezione di GnRH, con conseguente diminuito rilascio
70 di LH ed FSH dall’ipofisi, o direttamente una mancata o inadeguata biosintesi delle
gonadotropine ipofisarie [292, 293].
L’ipogonadismo ipergonadotropo è la forma d’ipogonadismo più frequente nell’uomo
adulto [294] e può essere una patologia congenita, come nella sindrome di Klinefelter
o acquisita in seguito ad invecchiamento o all’esposizione ad agenti gonadotossici
(chemioterapia e radioterapia) [295].
Anche l’ipogonadismo ipogonadotropo può essere di tipo congenito o acquisito. L’HH
congenito può essere a sua volta suddiviso in due categorie in base alla presenza di
un senso intatto dell’olfatto: HH anosmico (Sindrome di Kallmann) e HH isolato
normosmico congenito (o HH idiopatico (IHH)) [4, 296]. Tra le cause più comuni di HH
acquisito rientrano: a livello ipotalamico, lesioni organiche (come un tumore) oppure
modificazioni
funzionali
non
associate
ad
un
danno
visibile,
come
nell’iperprolattinemia, e, soprattutto nelle donne, perdita di peso, esercizio fisico
estenuante e/o stress di origine psichica [297]; nell’ipofisi, lesioni invasive (adenomi)
infiltrative o infettive, radiazioni, malformazioni anatomo-congenite o una resistenza
all’azione del GnRH legata a una mutazione del gene per il suo recettore [298]; più in
generale, farmaci (quali steroidi sessuali, analoghi del GnRH), trauma encefalico,
radiazioni al cervello, abuso d’alcool, assunzione illecita di droghe e patologie
sistemiche quali emocromatosi, sarcoidosi e istiocitosi X [292, 299]. La Tabella 6.3
riassume le principali cause di HH [292]. Tali patologie, congenite o acquisite, in base
all’età d’insorgenza, possono configurare un quadro di mancato, ritardato, interrotto
sviluppo puberale o una perdita dell’attività gonadica nell’adulto.
71 EZIOLOGIE DI IPOGONADISMO
IPOGONADOTROPO
CONGENITO
Sindrome di Kallmann
Ipogonadismo Ipogonadotropo idiopatico
Altre mutazioni genetiche
Sindrome di Prader Willi
ACQUISITO
Iperprolattinemia
Lesioni ipofisarie (tumore, granuloma, ascesso)
Sindrome di Cushing
Abuso di droghe (oppiacei) e alcool
Uso di steroidi anabolizzanti
Malattie gravi o croniche
Irradiazioni all’ipofisi, traumi, interventi chirurgici
SOVRACCARICO DI FERRO
La sindrome di Kallmann è la forma di HH congenito più comune. Tale malattia
genetica è caratterizzata da anosmia e da un deficit prepuberale di GnRH che
comporta la mancata produzione ipotalamica di GnRH e quindi di gonadotropine da
parte dell’adenoipofisi [300, 301]. Nel dettaglio, tale patologia deriva da un difetto
embrionale di base che consiste nella mancata migrazione dei neuroni GnRH dal
placode olfattivo all’ipotalamo e al lobo olfattorio. Esistono tre differenti forme di
sindrome di Kallmann: quelle ereditate come forme legate al cromosoma X, le
autosomiche dominanti e quelle recessive. La forma legata al cromosoma X causa il
10-15% delle sindromi di Kallmann mentre la maggior parte dei casi sono
caratterizzati da ereditarietà di tipo autosomico, indicando un’eterogeneità genetica
della patologia. Il gene KAL-1 è responsabile della forma di sindrome di Kallmann
72 ereditaria, recessiva e legata al cromosoma X. KAL-1 codifica per anosmina-1, una
proteina di adesione extracellulare di 840 aa con un ruolo centrale nell’adesione e
nella migrazione assonale dei neuroni GnRH e dei nervi olfattori verso l’ipotalamo. La
maggior parte delle mutazioni nel gene KAL-1 consiste in inserzioni o delezioni di
nucleotidi che risultano in mutazioni “frameshift” o in un codone prematuro di
terminazione. Ne deriva un’alterata migrazione dei neuroni GnRH-secernenti che, a
causa della mancata penetrazione nel telencefalo, si trovano addensati tra la lamina
cribrosa dell’etmoide e le meningi [302‐304]. In tali pazienti si evidenzia, inoltre,
un’agenesia del bulbo olfattorio dovuta a un ridotto sviluppo degli assoni dei neuroni
olfattori utilizzati dai neuroni GnRH come via migratoria. Anche i geni FGR1, GNRHR,
NELF, GPRS54, PROK-2, PROKR-2, CHD-7 e FGF-8 sono stati associati alla sindrome
di Kallmann: mutazioni a carico di uno o più di questi geni può alterare la sintesi di
GnRH [305].
Altre malattie genetiche quali la sindrome di Prader-Willi, la sindrome di LaurenceMoon-Biedl e la sindrome di Moebius sono caratterizzate da HH [299].
Nei pazienti con IHH si registrano bassi livelli di gonadotropine e di steroidi sessuali in
mancanza di anormalità anatomiche o funzionali dell’asse HPG o di mutazioni nel gene
del GnRH [4, 306].
Il meccanismo patogenetico dell’IHH coinvolge l’incapacità dei
neuroni GnRH localizzati nell’ipotalamo di differenziarsi e di svilupparsi, comportando
una secrezione di GnRH nulla o apulsatile [4].
Il trattamento ideale di pazienti con deficit di GnRH consiste nella terapia sostitutiva
mediante somministrazione pulsatile dell’ormone attraverso una pompa.
Nel 2003, due gruppi di lavoro indipendenti hanno documentato l’associazione tra il
sistema Kiss-1/GPR54 e la funzione riproduttiva, sulla base di evidenze da studi clinici
[120, 121]. Pazienti con mutazioni inattivanti nel gene GPR54, codificante per il
recettore dei peptidi del gene Kiss-1, hanno manifestato una condizione di HH con
mancata insorgenza di pubertà e infertilità e lo stesso fenotipo è stato riprodotto in
topi privi di geni funzionanti per GPR54 e Kiss-1 [307‐310]. Studi molecolari e
farmacologici hanno contribuito a caratterizzare il ruolo fisiologico dei peptidi di Kiss-1
e di GPR54 nel controllo della riproduzione [311, 312]. Le principali caratteristiche
“riproduttive” del sistema Kiss-1/GPR54, emerse da tali studi, possono essere
riassunte come segue: (i) i peptidi di Kiss-1 sono stimolatori estremamente potenti
dell’asse HPG; (ii) il sistema Kiss-1 è fondamentale per l’insorgenza della pubertà; (iii)
i peptidi di Kiss-1 esplicano la propria azione stimolatrice sull’asse riproduttivo
interagendo direttamente con i GPR54 espressi dai neuroni GnRH nell’ipotalamo; (iv) i
neuroni Kiss-1 mediano sia gli effetti di feedback positivo e negativo degli steroidi
73 sessuali, che controllano l’espressione genica ipotalamica di Kiss-1, sia i segnali
ambientali e metabolici [3, 313]. Esistono almeno tre possibili spiegazioni della
correlazione tra mutazioni di GPR54 e il mancato sviluppo sessuale: l’alterazione della
migrazione dei neuroni GnRH, la riduzione della funzione ipofisaria e di quella
ipotalamica. Le osservazioni che topi knockout per GPR54 presentano un corretto
posizionamento dei neuroni GnRH nell’ipotalamo e che mutazioni con perdita della
funzione del recettore non modificano la responsività dell’ipofisi al GnRH suggeriscono
che il problema risieda principalmente a livello ipotalamico [120]. Questa ipotesi è al
momento quella maggiormente avvalorata ed è anche sostanziata dalla presenza di
neuroni KiSS-1 a livello ipotalamico [314], dall’espressione di GPR54 a livello dei
neuroni GnRH [315, 316], dalla stretta comunicazione tra le due popolazioni neuronali
e dalla funzionalità del sistema Kiss-1/GPR54 nel modulare la secrezione di GnRH
[316].
Al momento sembra che la frequenza di mutazioni del GPR54 come causa di HH non
sia elevata, tuttavia il chiarimento del ruolo del sistema Kiss-1/GPR54 come
regolatore della fisiologia della funzione riproduttiva e della pubertà potrebbe portare
all’identificazione di altri geni coinvolti nel controllo della funzione riproduttiva.
6.6.1
Ipogonadismo ipogonadotropo associato a sovraccarico
di ferro
L’ipogonadismo è frequente nella sindrome dismetabolica da sovraccarico di ferro
(DIOS) osservata in circa il 10-20% di individui obesi europei e definita come
condizione caratterizzata da iperferritinemia, lieve sovraccarico di ferro a livello
epatico e vari lineamenti della sindrome metabolica. Più nel dettaglio si è notato come
la concentrazione del ferro a livello epatico (HIC, Hepatic Iron Concentration) sia
positivamente correlata con i livelli di SHBG (Sex Hormone Binding Globuline), una
globulina avente come principali funzioni quelle di trasportare gli ormoni steroidei nel
circolo sanguigno verso i tessuti bersaglio, di regolare la concentrazione di steroidi
biodisponibili e di influenzare il bilancio tra estrogeni ed androgeni biodisponibili. In
particolare, si è dimostrata l'esistenza di una correlazione indiretta tra HIC e livelli di
LH e testosterone biodisponibili. Questo fornisce una prova indiretta dell’associazione
tra un moderato sovraccarico di ferro e ipogonadismo [317].
Il sovraccarico di ferro solo occasionalmente comporta una disfunzione primaria delle
gonadi e quindi un ipogonadismo ipergonadotropo; nella maggior parte dei casi
74 l’eccesso di ferro si accumula a livello ipotalamico e ipofisario con conseguente danno
e induzione di HH [318].
La ferritina sierica è un prezioso indice del deposito di ferro a livello dell’ipofisi come lo
sono anche il contenuto di ferro epatico e pancreatico poiché fegato e pancreas sono
due organi con una cinetica di accumulo marziale simile a quella ipofisaria [319].
Bisogna però anche considerare che elevati livelli di ferritina non sono sempre
indicativi di uno stato di sovraccarico di ferro dato che questo parametro aumenta
anche in molte situazioni infiammatorie, nelle epatiti e patologie epatiche [318]. Non
esiste inoltre una vera e propria correlazione diretta tra la quantità di ferro
accumulato e la disfunzione d’organo [318] anche se deficienze ormonali possono
essere presenti anche nei primi stadi di alcune patologie senza che ci siano evidenze
di un avanzato sovraccarico marziale [320]. In generale, pazienti con ferritinemia
superiore di 2,500 mg/L hanno una probabilità di sviluppare ipogonadismo 2,75 volte
più alta rispetto a pazienti con ferritina sierica minore di 1,000 mg/L [321].
L’ipofisi anteriore è particolarmente predisposta agli effetti tossici da sovraccarico
marziale. Peillon e Racadot insieme a Bergeron e Kovacs sono stati i primi a
dimostrare che il ferro si deposita principalmente nelle gonadotrope piuttosto che in
altri tipi cellulari adenoipofisari. Questo spiega perché, in caso di sovraccarico
marziale, si osserva una deficienza di gonadotropine ma livelli normali degli altri
ormoni ipofisari [320, 322, 323]. I depositi di ferro nell’ipofisi portano ad un'inefficiente
produzione di gonadotropine che è dimostrata da una scarsa risposta alla stimolazione
tramite somministrazione pulsatile di GnRH [324]. Ciò distingue la disfunzione
ipofisaria da quella ipotalamica che è invece caratterizzata da un ripristino dei livelli di
gonadotropine a seguito del trattamento pulsatile con GnRH [325].
Nella patogenesi dell’HH rientra anche il possibile effetto tossico indotto dal
sovraccarico di ferro a livello del VAT, il che comporta modificazioni nella funzione
fisiologica della leptina, un ormone peptidico prodotto dalle cellule adipose che ha un
ruolo permissivo nella maturazione sessuale e nella fertilità [324].
Originariamente l’HH era considerata una patologia irreversibile determinata da un
danno d’organo permanente. Sono poi stati osservati casi di regressione sia parziale
che totale della malattia soprattutto in pazienti in cui l’HH è stato precocemente
diagnosticato e l’eccesso di ferro è stato contrastato tramite un’opportuna terapia.
Una diagnosi precoce di HH è quindi essenziale per limitare danni irreversibili anche se
è difficile da ottenere a causa di un'incompleta maturazione dell’asse HPG nei bambini
prima della pubertà [326, 327]. Il ferro inizia ad accumularsi nella prima decade di vita
75 subendo un aumento notevole durante la seconda decade ma i sintomi vengono
osservati generalmente appena prima dei 30 anni.
L’Imaging a Risonanza Magnetica (MRI) è un potente strumento in grado di
caratterizzare il volume e la concentrazione di ferro dell’ipofisi. E’ una tecnica che si
sta cercando di estendere anche a bambini con meno di 10 anni affinché si possano
prevenire le disfunzioni endocrine da sovraccarico di ferro [328].
A seconda della tipologia di sindrome da sovraccarico di ferro, in presenza di HH, la
terapia consiste in flebotomia, terapia chelante il ferro o sostituzione ormonale.
Bisogna
avere
particolare
riguardo
nell’iniziare
la
terapia
chelante
troppo
precocemente (2-5 anni di età) perché si potrebbero avere effetti deleteri sulla
crescita del bambino [324].
76 7.
SCOPO DEL LAVORO
Il ferro è un micronutriente indispensabile per l’organismo poiché interviene come
cofattore in processi biochimici fondamentali quali il trasporto di ossigeno, il
metabolismo energetico, la sintesi e il riparo di DNA [329]. Inoltre, il suo contributo
alla sintesi di neurotrasmettitori, alla formazione di mielina e ad altre funzioni
neuronali cruciali conferisce al ferro un ruolo essenziale per il normale sviluppo e
funzionamento del sistema nervoso centrale (SNC) [250, 259]. Tuttavia, l’accumulo
nei tessuti di quantità eccessive di ferro libero, non opportunamente sequestrato in
forma non reattiva da chaperones o all’interno della ferritina, è potenzialmente tossico
per l’ambiente cellulare [330]. Infatti, in condizioni aerobiche, tale metallo catalizza la
generazione e la propagazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) mediante la
reazione di Fenton con conseguente danno ossidativo a carico di lipidi di membrana,
proteine e acidi nucleici [276, 331]. Gli organi maggiormente colpiti dal sovraccarico
marziale sono il fegato, il pancreas, la tiroide, il cuore, le gonadi, le articolazioni, il
sistema endocrino, la cute e il SNC, le cui cellule (neuronali o meno) sono
notoriamente carenti di difese antiossidanti [332]. In particolare, un aumento del
contenuto di ferro in specifiche regioni cerebrali può favorire l'insorgenza di malattie
neurodegenerative [273, 333, 334] e di endocrinopatie, inclusi l’ipogonadismo
ipogonadotropo (HH), il deficit di crescita e il ritardo dello sviluppo puberale.
Studi precedentemente condotti dal nostro gruppo di lavoro [1] hanno evidenziato
come il sovraccarico dietetico di ferro (IED – “Iron-Enriched Diet”) in topi C57BL/6J
riproduca la sindrome dismetabolica da sovraccarico di ferro (DIOS) per quanto
concerne l’aumentato rilascio di epcidina e l’influenza negativa sul metabolismo
glucidico (iperglicemia a digiuno, insulino-resistenza) e lipidico (ipertrigliceridemia a
digiuno) con un’azione primaria a livello del tessuto adiposo viscerale (VAT).
L’accumulo di ferro in tale sito ha ridotto la massa e la dimensione adipocitaria, ha
compromesso l’attivazione del signaling insulinico (aumento di resistina, induzione di
Socs3, “Suppressor of Cytokine Signaling 3”, e riduzione del rapporto pAkt/Akt) e ha
indotto uno stato di stress ossidativo e del reticolo endoplasmatico [1].
In diverse condizioni patologiche quali il diabete mellito di tipo 2 (T2D), la sindrome
metabolica (MetS) [335‐341], l’emocromatosi ereditaria [342], le talassemie [328] e la
DIOS [317] è emerso un parallelismo tra perturbazione della funzione metabolica e
77 compromissione
dell’asse
riproduttivo
con
insorgenza
di
ipogonadismo
prevalentemente ipogonadotropo.
Per tale ragione, scopo principale di questo lavoro di tesi è stato lo studio della
capacità del sovraccarico marziale di compromettere, oltre alla già indagata funzione
metabolica,
anche
quella
riproduttiva,
unitamente
all’analisi
dei
meccanismi
molecolari alla base della fisiopatologia dell’eccesso marziale. Tra le probabili sedi
anatomiche oggetto della perturbazione (asse HPG: ipotalamo-ipofisi-gonadi), la
nostra
attenzione
si
è
focalizzata
prevalentemente,
ma
non
esclusivamente,
sull’ipotalamo poiché, a differenza dell’ipofisi, il suo ruolo primario ed esclusivo
nell’insorgenza di HH non è stato ancora del tutto chiarito [343‐345]. Poiché
l’ipotalamo non è ovviamente esplorabile nell’uomo, per perseguire il nostro scopo, ci
siamo avvalsi di due modelli sperimentali in logica traslazionale: il modello murino di
DIOS
già
precedentemente
caratterizzato
[1]
e,
come
ulteriore
lente
di
ingrandimento, le cellule GN-11, rappresentative di neuroni GnRH immaturi e
migratori e le cellule GT1-7, neuroni maturi e GnRH secernenti.
Poiché dalla letteratura non emergono evidenze in merito all’analisi dell’accumulo
selettivo di ferro nell’ipotalamo, ci siamo approcciati allo studio sul modello in vivo
ponendoci degli obiettivi intermedi. Nello specifico, abbiamo indagato:
•
la capacità delle cellule ipotalamiche (neuronali o meno) di accumulare ferro di
origine alimentare e di rispondere al sovraccarico marziale sistemico mediante
modulazione dei geni responsivi al ferro; tali analisi sono state condotte anche nei
testicoli;
•
l’abilità dell’eccesso ferro di attivare il pathway infiammatorio e di indurre stress
ossidativo e del reticolo endoplasmatico nell’ipotalamo in toto;
•
l’effetto del sovraccarico marziale sui meccanismi neuroendocrini ipotalamici
coinvolti nel controllo della riproduzione e del comportamento alimentare;
l’indagine della compromissione della funzione riproduttiva è stata condotta anche
nell’ipofisi;
•
la modulazione da parte dell’eccesso di ferro di specifiche vie di segnale
(MAPK/ERK1/2, PI3K/Akt e AMPK) nell’ipotalamo.
I modelli cellulari in vitro ci hanno consentito di realizzare un fenotipo estremo di
sovraccarico marziale ipotalamico che esclude l’impedimento al libero passaggio di
ferro da parte della barriera emato-encefalica (BEE). Tali sistemi sono stati creati al
fine di comprendere i reali meccanismi molecolari attivati dall’eccesso di ferro nei
neuroni ipotalamici coinvolti nella regolazione della funzione riproduttiva. Inoltre,
abbiamo deciso di avvalerci di neuroni immortalizzati, immaturi e migratori, o
78 neuroblasti, con l’obiettivo di indagare l’ipotetico ruolo dell’eccesso di ferro nella
perturbazione della migrazione dei neuroni GnRH dal placode olfattorio all’ipotalamo
durante la vita embrionale. Tali considerazioni potrebbero essere traslate al processo
di neurogenesi che avviene nel cervello di mammiferi adulti in due determinate
regioni cerebrali: la zona sottogranulare del giro dentato verso lo strato di cellule
granulari dell’ippocampo e dalla zona sottoventricolare del ventricolo laterale fino ai
bulbi olfattori attraverso un cosiddetto flusso migratorio rostrale [346].
Nello specifico, gli studi in vitro sono stati condotti allo scopo di investigare:
•
l’efficienza di captazione neuronale del ferro, l’impatto sulla vitalità cellulare e la
risposta al sovraccarico marziale mediante modulazione dei geni sensibili al ferro;
•
l’influenza del sovraccarico di ferro sull’abilità migratoria dei neuroni GnRH
immaturi;
•
l’abilità dei chelanti del ferro di antagonizzare e/o prevenire il fenotipo patologico
determinato dal sovraccarico marziale;
•
la modulazione di specifiche vie di segnale (MAPK/ERK1/2, PI3K/Akt e AMPK) da
parte del ferro e il loro effettivo coinvolgimento nel processo migratorio;
•
la promozione di uno stato infiammatorio o l’induzione di stress ossidativo o del
reticolo endoplasmatico da parte delle condizioni sperimentali utilizzate.
79 8.
8.1
MATERIALI E METODI
REAGENTI
Il citrato di ammonio ferrico (FAC), il lipopolisaccaride (LPS) e il fattore di necrosi
tumorale α (TNFα) sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (Milano, Italia), mentre la
Deferoxamina Mesilato (Desferal®, DFO) da Biofutura Pharma (Milano, Italia). U0126,
inibitore potente, specifico e non-competitivo della via di segnale di MEK1/2 (mitogenactivated protein kinase/extracellular-signal-regulated kinase (MAPK/ERK1/2) kinase
1/2), utilizzato in vitro alla dose di 10 µM, è stato comprato da Tocris Biosciences
(Bristol, UK) analogamente al Composto C (Dorsomorphin dihydrochloride), inibitore
potente, selettivo, reversibile e ATP-competitivo della via di AMPK (adenosine 5'monophosphate-activated protein kinase), utilizzato in coltura alla concentrazione di
10 µM. LY-294,002, inibitore potente, altamente specifico e reversibile di PI3K/Akt
(phosphatidylinositol 3-kinase), impiegato alla dose di 10, è stato acquistato da
Sigma-Aldrich.
8.2
ANIMALI
Tutte le procedure condotte su animali sono state effettuate in ottemperanza alle
normative, nazionali e internazionali, vigenti in materia (Decreto Legislativo n. 116 del
27 gennaio 1992 attuativo della direttiva comunitaria, Direttiva C.E.E. n. 86/609 del
24 novembre 1986 “in materia di protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali
o ad altri fini scientifici”; Legge 6 agosto 2013, n. 96, articolo 13 in materia di "Delega
al Governo per il recepimento delle direttive europee e l'attuazione di altri atti
dell'Unione europea - Legge di delegazione europea 2013"). Topi maschi del ceppo
C57BL/6J (C57black6J) dell’età di 5 settimane e dal peso medio di 17 g sono stati
acquistati dalla Charles River (Charles River, Calco, Italia). Al loro arrivo, gli animali
sono stati suddivisi in sei gabbie, contenenti ognuna 5 topi, e mantenuti nello
stabulario del DISFeB (Dipartimento di Scienze Farmacologiche e Biomolecolari,
Università degli Studi di Milano, Milano) in condizioni standard di temperatura (2224°C) e luce (cicli luce/buio di 12 ore) e con accesso ad libitum ad acqua e cibo per
tutta la durata del trattamento. Dopo una settimana di acclimatazione alle condizioni
dello stabulario, per escludere eventuali contaminazioni nell’assegnazione ai diversi
gruppi di trattamento dietetico, i 30 topi sono stati associati casualmente, mediante
un metodo di randomizzazione, a 2 diversi regimi alimentari per un periodo di 9
(primo esperimento) e 11 (secondo esperimento) settimane. Nello specifico:
80 •
un gruppo è stato alimentato con una dieta in pellet a normale contenuto di ferro:
topi controllo (n=15);
•
un gruppo è stato nutrito con una dieta in pellet contenente il 3% di ferro
carbonile (IED – “Iron Enriched Diet”): topi IED (n=15).
Il peso di ciascun topo e l’assunzione di cibo per gabbia sono stati registrati
settimanalmente.
La misurazione della glicemia basale è stata effettuata tramite glucometro (AccuChek, Roche Diagnostics AVIVA, Mannheim, Germania) dopo prelievo di sangue dal
plesso venoso retro-orbitale con un capillare di vetro. A tal fine, i topi, mantenuti a
digiuno dalla sera precedente, sono stati anestetizzati in una gabbia di induzione
mediante una miscela di ossigeno e isoflurano (anestesia gassosa) che non influisce
sui parametri biochimici analizzati. L’analisi è stata condotta dopo 5 e 8 settimane di
dieta IED.
Al termine del periodo di trattamento alimentare previsto (9 e 11 settimane), i topi
sono
stati
sacrificati
mediante
decapitazione
sotto
anestesia
(miscela
ossigeno/isofluorano) tra le ore 10:00 e le ore 12:00 del mattino. Il sangue è stato
raccolto dopo decapitazione dal tronco dell’animale e, trascorse 2 ore a temperatura
ambiente, il siero è stato separato mediante centrifugazione (15 minuti a 2000 rpm a
temperatura ambiente) e stoccato a -80°C fino all’esecuzione dei dosaggi ormonali.
Dal cervello sono stati isolati gli ipotalami e le ipofisi, mentre dalla periferia, sono
state raccolte le gonadi. L’ipotalamo è stato estratto considerando i seguenti limiti: un
taglio coronale in prossimità del margine posteriore del chiasma ottico, in modo da
includere l’area preottica (POA) (rostralmente), un taglio coronale a livello del
margine posteriore dei corpi mammillari (caudalmente) e tagli parasagittali lungo le
fissure ipotalamiche. Tutti i tessuti sono stati immediatamente congelati in azoto
liquido e conservati a -80°C fino al processamento. I cervelli di 3 topi controllo e 3
topi IED sono stati prelevati interi dal cranio, congelati su ghiaccio secco e quindi
conservati a -80°C fino al sezionamento per l’ibridazione in situ.
8.3
COLTURE CELLULARI
Le linee cellulari immortalizzate di origine murina GN-11 (gentilmente fornite da Dr.
S. Radovick, Children's Hospital, Division of Endocrinology, Boston, MA) e GT1-7
(gentilmente fornite da Dr. R. I. Weiner, Reproductive Endocrinology Center,
University of California, San Francisco, CA), rappresentative, rispettivamente, di
neuroni GnRH immaturi e maturi, sono state coltivate in monostrato in un incubatore
a 37°C con atmosfera umidificata e in presenza del 5% di CO2. Il terreno di coltura
81 utilizzato per tali linee cellulari è il DMEM (Dulbecco’s Minimum Essential Medium;
Sigma-Aldrich) arricchito in D-glucosio (4,5 g/L) e addizionato con rosso fenolo
(0,0159 g/L), L-glutamina (0,584 g/L), piruvato di sodio (1 mM; Biochrom KG,
Berlino, Germania), streptomicina (100 µg/mL; Sigma-Aldrich), penicillina (100
UI/mL; Sigma-Aldrich) e siero fetale bovino (FBS) (10%) (Gibco, Grand Island, NY).
Tale terreno di coltura è stato sostituito ogni 3 giorni fino al raggiungimento della
confluenza cellulare. A questo punto, le cellule sono state raccolte con tripsina/EDTA
allo 0.05/0.02% in PBS (tampone fosfato salino) senza Ca2+ e Mg2+ (Sigma-Aldrich) e
sono state seminate per propagazione in piastre Petri con diametro di 100 mm e
contenenti 12 mL di terreno di coltura alle densità di 0.1x106 per le cellule GN-11 e
3.5x106 per le cellule GT1-7.
8.4
DETERMINAZIONE DEL CONTENUTO TISSUTALE E CELLULARE
DI FERRO TRAMITE SPETTROMETRIA DI ASSORBIMENTO ATOMICO
Il contenuto di ferro nell’ipotalamo, nelle gonadi e nelle cellule GN-11 e GT1-7 è stato
quantificato mediante spettrometria di assorbimento atomico. Tale tecnica analitica,
usata per l’analisi degli elementi in tracce (soprattutto metalli) in diverse matrici, si
basa sul principio dell'assorbimento atomico: l'elemento in esame viene atomizzato e
bersagliato
con
radiazioni
di
lunghezza
d'onda
opportuna;
per
effetto
dell'assorbimento atomico, l'intensità del raggio diminuisce e l'attenuazione può
essere correlata alla concentrazione dell'elemento nel campione.
L’accumulo di ferro nell’ipotalamo e nelle gonadi di topi IED in confronto a topi
controllo
è
stato
determinato
dopo
11
settimane
di
trattamento.
Prima
del
processamento i suddetti campioni, mantenuti a -80°C, sono stati seccati in stufa a
100°C per 2 ore.
L’accumulo marziale nelle cellule GN-11 e GT1-7 è stato determinato dopo
incubazione con FAC alla dose di 200 µM nel medium di crescita (DMEM + 10% FBS).
Al termine del trattamento, le cellule sono state lavate 3 volte con PBS, raccolte
mediante scraper in PBS e contate al microscopio ottico con il metodo di esclusione
del Trypan Blue. Le cellule vive che, contrariamente a quelle morte, hanno una
membrana citoplasmatica intatta, escludono i coloranti quali il Trypan Blue, l'eosina e
lo ioduro di propidio, che non penetrano nel citoplasma. Per questo motivo, in
presenza di Trypan Blue, le cellule vive mantengono il citoplasma chiaro mentre quelle
morte, permeabili al colorante, si colorano interamente di blu. Le cellule raccolte sono
state quindi centrifugate a 1200 rpm per 5 minuti e, una volta aspirato il surnatante,
si è congelato il pellet secco a -20°C.
82 I campioni tissutali e cellulari sono stati quindi sottoposti ad un'analisi quantitativa del
ferro totale intracellulare utilizzando lo spettrometro di assorbimento atomico.
La concentrazione di ferro totale è stata espressa come µg/100 mg di tessuto secco
per ipotalamo e gonadi e come µg/106 cellule per le GN-11 e le GT1-7.
8.5
SAGGIO DI VITALITA’ CELLULARE
L’effetto del ferro (FAC) sulla vitalità delle cellule GN-11 è stato determinato mediante
due tecniche:
•
il sistema ATPlite™ 1step (Luminescence ATP Detection Assay System)
(PerkinElmer, Monza, Italia) che consente di quantificare le cellule vitali in
coltura basandosi sulla quantificazione indiretta dell’ATP (Adenosina Trifosfato)
presente;
•
metodo
di
esclusione
del
Trypan
Blue
tramite
il
contatore
di
cellule
le
cellule
automatizzato Luna™ (Logos Biosystems, Inc., Annandale, VA, USA).
8.5.1
L'ATP
ATPlite™ 1step
è
un
marker
di
vitalità
cellulare
perché
si
trova
in
tutte
metabolicamente attive e la sua concentrazione cala rapidamente quando le cellule
vanno incontro a necrosi o apoptosi. ATPlite™ 1step è un saggio in luminescenza che
sfrutta la capacità dell’enzima luciferasi di ossidare, in presenza di ATP, la luciferina
generando luce.
Luciferasi (Mg2+)
ATP + D-Luciferina + O2
Ossiluciferina + AMP + PPi + CO2 + luce
Per poter eseguire il saggio, le GN-11 sono state seminate in una micropiastra da 96
pozzetti (20000 cellule per pozzetto) e, il giorno seguente, FAC è stato aggiunto o
meno al terreno di crescita alle concentrazioni di 20, 50, 100 e 200 µM per 4 e 24 ore.
Al termine del trattamento, la micropiastra è stata portata a temperatura ambiente e
la soluzione contenente l’enzima Luciferasi e la D-Luciferina è stata aggiunta a ciascun
pozzetto. Dopo opportuna miscelazione al riparo dalla luce, si è proceduto alla
misurazione della luminescenza emessa (espressa in CPS, Counts per Second), che è
direttamente proporzionale al contenuto di ATP. Confrontando i valori di CPS delle
cellule trattate con quello delle cellule controllo (no FAC) è stato quindi possibile
evidenziare l’eventuale effetto del ferro sulla vitalità delle cellule GN-11.
83 8.5.2
Contatore di cellule automatizzato LunaTM
Il contatore di cellule automatizzato LunaTM è uno strumento che misura la
concentrazione (espressa in cellule/mL) delle cellule totali, delle cellule vive e di quelle
morte in un dato campione. Tale apparecchio effettua direttamente una stima della
vitalità cellulare, visualizza un'immagine del campione cellulare oggetto della conta (le
cellule vive vengono cerchiate in verde, quelle morte in rosso) e rappresenta un
istogramma della distribuzione delle dimensioni cellulari. Il riconoscimento delle
cellule vive da quelle morte si basa sull'utilizzo del colorante Trypan Blue.
Per indagare l'eventuale compromissione della vitalità cellulare da parte di FAC, le
cellule GN-11 sono state seminate in multiwell da 6 pozzetti a una densità di 0,3 M
per pozzetto e, dopo 24 ore, sono state esposte a FAC 200 µM o 500 µM per 3 o 24
ore. Trascorso il periodo d’incubazione, le cellule sono state raccolte con 200 µL di
tripsina/EDTA allo 0.05/0.02% in PBS senza Ca2+ e Mg2+, inattivata con 600 µL di
DMEM 10% FBS. Sono stati poi miscelati 10 µL di tale sospensione cellulare con 10 µL
di trypan blue, avendo cura di non mantenere le cellule a contatto con trypan blue più
di 3 minuti prima della conta. 10/12 µL della sospensione così ottenuta sono stati
quindi rapidamente introdotti nella cameretta di conta, che è stata poi inserita
nell'apposita fessura dell'apparecchio. L’immagine del campione cellulare visualizzata
sul display dello strumento è stata messa a fuoco in modo da mettere in risalto il
contrasto tra il citoplasma chiaro e la membrana blu delle cellule vive. Si è proceduto
quindi con conta automatizzata delle cellule e con la lettura della vitalità espressa
dallo strumento come percentuale delle cellule vive rispetto alle cellule totali.
8.6
8.6.1
ESTRAZIONE DI RNA TOTALE DA TESSUTI E DA CELLULE
Ipotalamo
L’estrazione dell’RNA totale dall’ipotalamo intero è stata effettuata mediante il kit
commerciale NucleoSpin® RNA/Protein (Macherey-Nagel, Düren, Germania). La
peculiarità di questo kit è la possibilità di isolare sia RNA che proteine da un’unica
porzione di campione ed è quindi utile nel processamento di tessuti di ridotte
dimensioni, quali appunto gli ipotalami.
I campioni di ipotalamo intero (6–11 mg), conservati a -80°C in All-Protect® Tissue
Reagent (Quiagen) o a secco, sono stati omogeneizzati mediante TissueLyser II
(Quiagen) per 3 minuti a 30 Hertz in 350 µl di buffer RP1, contenente guanidina
tiocianato e inibitori specifici di RNasi e proteasi, con l’aggiunta di 3,5 µL di βmercaptoetanolo (condizioni denaturanti e riducenti). Successivamente, ciascun
campione è stato trasferito in colonnine munite di membrana e filtrato per
84 centrifugazione a 11000 x g per 1 minuto. Al filtrato sono stati aggiunti 350 µL di
etanolo al 70% in modo da consentire, mediante ulteriore centrifugazione a 11000 x g
per 30 secondi, il legame selettivo degli acidi nucleici (RNA e DNA) alla membrana di
ulteriori colonnine fornite dal kit e il rilascio della soluzione etanolica contenente la
componente proteica del campione. Considerata la maggiore degradabilità dell’RNA, si
è proceduto dapprima con la sua purificazione, mantenendo le proteine in ghiaccio.
Innanzitutto, la membrana è stata privata dei sali mediante aggiunta del buffer MDB
(Membrane Desalting Buffer, contenente meno del 10% di guanidina tiocianato e di
etanolo) per facilitare la successiva digestione del DNA con una soluzione contenente
rDNasi. La membrana è stata quindi lavata con due diversi buffer: RA2, contenente
guanidina tiocianato con meno del 25% di etanolo, in grado di inattivare le rDNasi;
RA3, una soluzione di lavaggio. Infine, l’RNA puro è stato eluito in condizioni ioniche
blande con 40 µl di acqua RNasi-free.
8.6.2
Ipofisi, gonadi, cellule GN-11 e GT1-7
L’RNA totale è stato estratto e purificato da gonadi, ipofisi e da cellule mediante il kit
RNeasy Mini (Qiagen, Milano, Italia). Questa tecnologia combina la selettività di
legame di una membrana a base di silice, che trattiene molecole di RNA più lunghe di
200 nucleotidi (mRNA), con la velocità della tecnologia microspin. A seconda del
campione biologico analizzato sono state utilizzate diverse procedure per la fase
iniziale di lisi e omogeneizzazione nel buffer RLT addizionato di β-mercaptoetanolo,
una soluzione contenente guanidina-tiocianato, con forte potere denaturante e
riducente, che inattiva eventuali RNasi assicurando così la purificazione di RNA intatto.
I tessuti animali sono stati mantenuti a -80°C fino all’aggiunta del buffer di lisi (350
µL buffer RLT + 3,5 µL di β-mercaptoetanolo) al campione ancora congelato in modo
da prevenire la degradazione dell’RNA. Le ipofisi, processate interamente, sono state
disgregate e omogeneizzate mediante sonicatore (4 cicli, power 60%). Frazioni da 30
mg di gonadi, tagliate su una lastra di ghiaccio secco, sono state invece frantumate e
omogeneizzate mediante TissueLyser II (Qiagen) per 3,30 minuti a 30 Hertz. Il lisato
del tessuto ipofisario e gonadico è stato quindi centrifugato per 3 minuti alla massima
velocità per rimuovere eventuali sostanze insolubili.
Entrambe le linee cellulari, seminate in Petri da 60 mm, sono state lisate direttamente
tramite raccolta con scraper nel buffer RLT (600 µL + 6 µL di β-mercaptoetanolo). Il
lisato cellulare così ottenuto è stato omogeneizzato mediante passaggio per almeno 5
volte attraverso un ago da 20 gauge adattato su una siringa libera da RNasi.
85 Le fasi successive sono state utilizzate indistintamente per cellule e tessuti animali.
Per creare le condizioni di legame ottimali per gli acidi nucleici alla membrana di silice
delle colonnine fornite dal kit (RNeasy Spin Column), un volume di etanolo al 70%
(350 o 600 µL) è stato aggiunto al lisato. Tale soluzione, opportunamente miscelata, è
stata trasferita nelle colonnine e quindi centrifugata per 15 secondi a 10.000 rpm.
Tramite centrifugazione, gli acidi nucleici (più lunghi di 200 nucleotidi) sono stati
trattenuti dalla membrana che ha invece rilasciato una soluzione etanolica contenente
proteine ed impurezze. Dopo un lavaggio con 350 µL di Buffer RW1, il DNA è stato
digerito tramite aggiunta di una soluzione contenente DNasi (Qiagen). I lavaggi
successivi con i buffer RW1 (350 µL) e RPE (500 µL per 2 volte) hanno consentito
rispettivamente di inattivare la DNasi e di purificare l’RNA rimasto legato alla
membrana. Per rimuovere eventuali residui di buffer RPE e di etanolo, le colonnine
sono state centrifugate per tempi e velocità maggiori prima di eluire l’RNA in 30 µL (o
più a seconda del campione) di acqua RNasi-free (condizioni ioniche blande).
8.6.3
Quantizzazione spettrofotometrica dell’RNA totale
L'RNA è stato quantizzato mediante un biofotometro (Eppendorf, Milano, Italia)
misurando il valore dell'assorbanza a 260 nm (lunghezza d’onda a cui assorbono gli
acidi nucleici) e a 280 nm (lunghezza d’onda a cui assorbono sia gli acidi nucleici che
le proteine). La concentrazione di RNA è stata stimata assumendo che un'assorbanza
a 260 nm pari a 1 corrisponda a 40 µg/mL di RNA. La purezza dell’RNA isolato è stata
apprezzata grazie al rapporto tra l'assorbanza a 260 nm e l’assorbanza a 280 nm: un
valore compreso tra 1.7 e 2 rappresenta un buon grado di purezza.
I campioni sono stati conservati a -80°C fino al momento dell’utilizzo.
8.7
RETROTRASCRIZIONE
–
REAZIONE
A
CATENA
DELLA
POLIMERASI (RT-PCR; Reverse Transcription – Polymerase
chain reaction)
La tecnica RT-PCR è stata utilizzata per la valutazione dell’espressione genica del
recettore della transferrina (TfR) e della ferritina H (FtH) nelle cellule GN-11 e GT1-7,
per l’analisi dello splicing alternativo di XBP-1 (X-box binding protein-1) nell’ipotalamo
e nelle GN-11 ed infine per la determinazione delle temperature di appaiamento
ottimali per i primers impiegati nella PCR quantitativa in tempo reale (vedi in seguito).
L’amplificazione mediante PCR del gene ad espressione costitutiva 18S (subunità
ribosomiale 18S) è stata effettuata come controllo del buon esito di ciascuna RT.
86 Il cDNA (DNA complementare) per ogni campione è stato sintetizzato a partire da 1
µg di RNA totale mediante la reazione di RT con il kit iScriptTM Reverse Transcription
Supermix for RT-qPCR (Bio-Rad, Milano, Italia). La RT è stata condotta in un volume
totale di 20 µL contenenti, oltre all’RNA, la “RT supermix” (5X), a sua volta composta
da:
•
trascrittasi inversa: iScript MMLV-RT, RNaseH+
•
inibitore delle RNasi: utilizzato al fine di bloccare l’azione degli enzimi
responsabili della degradazione dell’RNA
•
dNTPs: desossiribonucleotidi trifosfato
•
random primers: primers formati da sequenze di sei nucleotidi che legandosi
all’RNA permettono l’aggancio e dunque l’attività della trascrittasi inversa
•
buffer: tampone che garantisce le condizioni ottimali per la reazione di RT
•
MgCl2: catalizzatore dell’attività enzimatica
•
stabilizzatori.
Per la reazione sono stati preparati due set di campioni di RNA:
•
nel primo è stata aggiunta la “RT supermix” descritta sopra (+ RT)
•
nel secondo è stata utilizzata la “RT Supermix no-RT control”, contenente tutte
le componenti della “RT supermix” eccetto la trascrittasi inversa, al fine di
constatare l'eventuale contaminazione da DNA genomico (- RT).
In tutte le RT è stato anche introdotto un campione di acqua come controllo interno
negativo.
1 µL di cDNA o DNA templato è stato quindi sottoposto alla reazione di PCR (PCR
tempo finale) con il kit GoTaq® Green Master Mix (Promega, Milano, Italia). La PCR è
stata condotta in un volume totale di 25 µL contenenti, oltre al cDNA (50 ng), i
primers senso e antisenso (1 µM ciascuno) (Sigma-Aldrich), l’acqua priva di nucleasi e
la GoTaq® Green Master Mix (2X), a sua volta composta da:
•
l’enzima DNA Taq polimerasi di derivazione batterica (Thermus Aquaticus)
•
dNTPs
•
buffer di reazione (pH 8.5): tampone che garantisce le condizioni ottimali per la
reazione di PCR
•
MgCl2
•
due coloranti (blu e giallo): consentono di monitorare la corsa elettroforetica su
gel d’agarosio (loading dyes)
•
composto che aumenta la densità del campione e permette il caricamento
diretto in gel d’agarosio.
87 Le condizioni specifiche per le reazioni di RT-PCR, effettuate in un termociclatore
(GeneAmp PCR System 2700 e 9700; Applied Biosystem, Monza, Italia), sono indicate
nelle Tabelle 8.1 e 8.2. Le sequenze dei primers e le relative temperature di
appaiamento sono riportate in Tabella 8.3.
I prodotti amplificati di ciascuna PCR sono stati risolti mediante elettroforesi su gel
d’agarosio al 2% (4% per XBP-1) in tampone TBE 1X e successivamente visualizzati,
per la presenza di etidio bromuro, mediante l’utilizzo di un transilluminatore UV.
Ci si è inoltre avvalsi di un DNA-marker (Sigma-Aldrich) con un ambito dimensionale
compreso tra 50 e 3000 bp, scelto in base alla dimensioni dei prodotti amplificati di
nostro interesse.
TRASCRIZIONE
INATTIVAZIONE
INVERSA
ENZIMA
25°C
42°C
85°C
5 minuti
30 minuti
5 minuti
STEP
IBRIDAZIONE
TEMPERATURA
TEMPO
Tabella 8.1 Condizioni per la reazione di RT
STEP
DENATURAZIONE
INIZIALE
TEMPERATURA
95°C
TEMPO
5 minuti
STEP
CICLI PCR: 13 per 18S, 40 per tutti gli altri geni
DENATURAZIONE
APPAIAMENTO
ESTENSIONE
TEMPERATURA
94°C
Tabella 8.3
72°C
TEMPO
1 minuto
1 minuto
1 minuto
STEP
ESTENSIONE
FINALE
TEMPERATURA
72°C
TEMPO
10 minuti
Tabella 8.2 Condizioni per la reazione di PCR
88 8.8
PCR
QUANTITATIVA
IN
TEMPO
REALE
(qPCR;
Real-time
quantitative PCR)
1 µL di cDNA è stato sottoposto alla reazione di qPCR mediante intercalanti
fluorescenti (metodo SYBR Green) o reporter a sonde fluorescenti (metodo TaqMan)
con il sistema CFX96 C1000 Touch™ Real-Time PCR (Bio-Rad). Tutte le reazioni sono
state eseguite in triplicato e in piastre da 96 pozzetti. Per ogni set di primer o per
ciascuna sonda, sono stati inclusi un controllo negativo privo di cDNA (acqua) e i
campioni – RT, in modo da escludere ogni possibile fonte di contaminazione. Il gene
codificante per la proteina ribosomiale 18S è stata utilizza come controllo interno. Il
calcolo dei livelli di espressione relativa degli mRNA di interesse è stata effettuata con
il metodo ΔΔCt.
8.8.1
SYBR Green
Le reazioni sono state eseguite in un volume totale di 10 µL contenenti, oltre al
templato di DNA (50 ng), i primers senso e antisenso (300 nM per il gene di
espressione costitutiva 18S o 500 nM per tutti gli altri geni) (Sigma-Aldrich), l’acqua
priva di nucleasi e la iTaq™ Universal SYBR® Green supermix (2X) (Bio-Rad), a sua
volta composta da: antibody-mediated hot-start iTaq™ DNA polimersi, dNTPs, MgCl2,
colorante SYBR® Green I, potenziatori, stabilizzanti e coloranti passivi interni di
riferimento (ROX e fluoresceina). Le sequenze dei primers e le relative temperature di
appaiamento sono elencati in Tabella 8.3.
8.8.2
TaqMan
Le reazioni sono state condotte in un volume totale di 20 µL contenenti, oltre a 1 µL di
cDNA (50 ng):
•
10 µL di SsoFast™ Probes Supermix (Bio-Rad) composta da antibody-mediated
hot-start Sso7d-fusion polymerase, dNTPs, MgCl2, potenziatori e stabilizzanti
•
1 µL della sonda specifica (20X) costituita da un fluorocromo reporter (6carbossi-fluoresceina, FAM) all’estremità 5’ e da un quencher non fluorescente
al terminale 3’ con un minor groove binder (MGB) (custom TaqMan MGB
probes, Life Technologies, Inc., Milano, Italia). Le sonde disegnate e comprate
sono
state:
GnRH1
Mm01315605_m1,
IL-6
Mm00446180_m1,
Kiss1
Mm03058560_m1, NPY Mm03048253_m1, POMC Mm00435874_m1, TNFα
Mm00443258_m1, 18S Hs99999901_s1.
•
8 µL di acqua priva di nucleasi.
89 Le condizioni specifiche per le reazioni di qPCR con il metodo TaqMan sono state:
attivazione della polimerasi e denaturazione del DNA a 95°C per 2 minuti, 40 cicli di
amplificazione
suddivisi
in
denaturazione
a
95°C
per
10
secondi
e
in
appaiamento/estensione a 60°C per 30 secondi.
GENE
T°
18S
57°C
TfR
57°C
FtH
57°C
Epcidina
57°C
CHOP
57°C
SOD2
57°C
XBP-1
64°C
GnRH
57°C
Kiss1
54°C
GPR54
55°C
LHβ
59°C
FHSβ
59°C
PRIMERS
FOR: 5’-CTCGCTCCTCTCCTACTTGG-3’
REV: 5’-CCATCGAAAGTTGATAGGGC-3’
FOR: 5’-TCGCTTATATTGGGCAGACC-3’
REV: 5’-CCATGTTTTGACCAATGCTG-3’
FOR: 5’-CGAGATGATGTGGCTCTGAA-3’
REV: 5’-GTGCACACTCCATTGCATTC-3’
FOR: 5’-CAGCAGAACAGAAGGCATGA-3’
REV: 5’-AGATGCAGATGGGGAAGTTG-3’
FOR: 5’-GTCCCTAGCTTGGCTGACAGA-3’
REV: 5’-TGGAGAGCGAGGGCTTTG-3’
FOR: 5’-TCTGGCCAAGGGAGATGTTA-3’
REV: 5’-CCTCCAGCAACTCTCCTTTG-3’
FOR: 5’-TGAGAACCAGGAGTTAAGAACACGC-3’
REV: 5’-TTCTGGGTAGACCTCTGGGAGTTCC-3’
FOR: 5’-GGCCGGCATTCTACTGCTG-3’
REV: 5’-CTGCCTGGCTTCCTCTTCA-3’
FOR: 5’-AGCTGCTGCTTCTCCTCTGT-3’
REV: 5’-GCATACCGCGATTCCTTTT-3’
FOR: 5’-CAGTCCCAGGACACAATCCT-3’
REV: 5’-ACCAATGAGTTTCCGACCAG-3’
FOR: 5’-TGGCCGCAGAGAATGAGTTC-3’
REV: 5’-CTCGGACCATGCTAGGACAGTAG-3’
FOR: 5’-ATGGATTGTTCCAGGCAGAC-3’
REV: 5’-TCACTGCATGTGAGGGAAAG-3’
Tabella 8.3 Sequenze e temperature di appaiamento dei primers per RT-PCR e per
qPCR
90 8.9
STUDIO DELLA MIGRAZIONE DELLE CELLULE GN-11 (CAMERA
DI BOYDEN)
Gli esperimenti di migrazione cellulare sono stati condotti utilizzando la camera di
Boyden (Neuro Probe, Gaithersburg, MD). Nel presente lavoro si è analizzata solo la
chemiotassi (migrazione
direzionata
delle
cellule
verso
regioni a
più
elevata
concentrazione di fattori chemotattici) delle GN-11.
La camera di Boyden consta di tre componenti distinte:
•
La porzione inferiore, in materiale acrilico, presenta 48 pozzetti chiusi sul fondo in
cui è stato inserito l’agente chemoattrattore in esame (FBS 1%) (28 µL)
•
La porzione intermedia è costituita da una membrana porosa di policarbonato con
pori di 8 µm di diametro e distribuiti casualmente su tutta la superficie (Neuro
Probe, Gaithersburg, MD). Prima dell’utilizzo, tale membrana è stata lavata una
volta in acido acetico 0,5 M e quindi due volte in PBS senza Ca2+ e Mg2+. Per
migliorare l’adesività delle cellule durante il processo migratorio, la membrana è
stata lasciata a contatto con una soluzione di gelatina sterile (0,2 mg/mL in PBS
senza Ca2+ e Mg2+) per almeno 72 ore a 4°C. Per garantire la tenuta delle varie
parti della camera, un separatore di silicone, sempre con 48 pozzetti, è stato
posizionato sulla membrana.
•
La porzione superiore, anch’essa in materiale acrilico, presenta 48 pozzetti aperti
sul fondo in cui è stata aggiunta la sospensione cellulare (50 µL) opportunamente
trattata.
Per studiare gli effetti del trattamento con FAC, a diverse concentrazioni e per tempi
diversi, sulla migrazione cellulare, le cellule GN-11, dopo opportuno trattamento, sono
state raccolte in tripsina/EDTA allo 0.05/0.02% in PBS senza Ca2+ e Mg2+, sottoposte
ad un lavaggio in DMEM privo di FBS e con lo 0,1% di BSA (albumina di siero bovino;
Sigma – Aldrich) e risospese nello stesso terreno alla densità di 0.1*106 cellule/50 µL
prima di essere introdotte nella parte superiore della camera di Boyden. Per indagare
se le vie di segnale di MAPK/ERK1/2, AMPK e Akt, la cui attivazione è modulata dal
ferro,
fossero
effettivamente
coinvolte
nell’inibizione
ferro-dipendente
della
migrazione stimolata dall’1% di FBS, le GN-11, mantenute in terreno completo di
crescita fino a confluenza, sono state raccolte, lavate e risospese come indicato sopra.
La sospensione (0.1*106 cellule/50 µL in DMEM/BSA 0,1%) è stata aliquotata in tubini
sterili, incubata per 30 minuti con gli inibitori descritti sopra (sezione “Sostanze”),
tutti alla concentrazione di 10 µM, trattata con FAC 200 µM per 1 ora e quindi caricata
nella parte superiore della camera di Boyden.
91 Una volta assemblata, la camera è stata chiusa con delle viti e quindi posta in
incubatore a 37°C con atmosfera umidificata e in presenza del 5% di CO2 per 1 ora e
45 minuti. Al termine dell’incubazione, la camera è stata smontata e la membrana di
policarbonato è stata recuperata con delle pinze. Le cellule, che sono rimaste adese al
lato della membrana direttamente a contatto con l’agente chemiotattico e che quindi
rappresentano le cellule migrate attraverso i pori, sono state fissate in metanolo
assoluto freddo per 1 minuto. Le cellule rimaste sul lato della membrana a contatto
con la porzione superiore della camera, rappresentative di cellule non migrate, sono
state bagnate con PBS senza Ca2+ e Mg2+ e quindi eliminate tramite strofinamento con
uno scraper. Le cellule fissate sono state quindi colorate con due soluzioni contenute
nel kit Diff-Quick (Biomap, Milano, Italia) e l’eccesso di colorante è stato rimosso con
acqua milliQ prima di collocare la membrana su un vetrino da istologia. Per l’analisi
quantitativa, le cellule sono state osservate con un obiettivo 20X o 40X al microscopio
ottico in campo chiaro. Per ciascun pozzetto si sono contate le cellule presenti in tre
campi casuali e si è calcolato il numero medio di cellule migranti per mm2, espresso
come percentuale rispetto al controllo positivo (FBS 1% posto uguale a 100%).
8.10 ESTRAZIONE
DI
PROTEINE
DALL’IPOTALAMO
E
DALLE
CELLULE GN-11
8.10.1
Ipotalamo
Per precipitare e purificare le proteine da campioni ipotalamici interi è stata
conservata la soluzione etanolica del primo eluato ottenuto con il kit NucleoSpin®
RNA/Protein (Macherey-Nagel) (vedi sopra). Nel dettaglio, 150 µL di tale eluato sono
stati prelevati e addizionati di un egual volume di buffer PP (protein precipitator).
Dopo un’incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente, il pellet ottenuto per
centrifugazione è stato lavato in 500 µL di etanolo al 50%, ricentrifugato e, dopo
rimozione del surnatante, lasciato essiccare a temperatura ambiente per 30 minuti. Il
pellet è stato quindi risospeso in 100 µl di PSB-TCEP (protein solving buffer – tris(2carboxyethyl)phosphine) e scaldato a 95 – 98°C per 3 minuti al fine di ottenere una
completa riduzione e denaturazione delle proteine.
La concentrazione delle proteine così ottenute è stata quantificata mediante il kit
Protein Quantification Assay (Macherey-Nagel). La curva standard è stata costruita
preparando diluizioni seriali di BSA in H2O a partire da uno stock di BSA in PSB a
concentrazione nota (1 mg/mL). Dopo aggiunta del reagente di quantificazione (QR)
fornito dal kit, la densità ottica degli standard e dei campioni è stata letta mediante
92 uno spettrofotometro ad una lunghezza d’onda di 570 nm (Wallac Victor 3 1420
Multilabel Counter, PerkinElmer).
8.10.2
GN-11
Per studiare l’effetto di FAC sulle vie di trasduzione del segnale di ERK1/2, AMPK e
Akt, le cellule GN-11 sono state seminate in Petri da 60 mm. Una volta raggiunto
l’80% circa di confluenza, le cellule sono state mantenute per tutta la notte in DMEM
privo di FBS (starvation), trattate con FAC 200 µM per 5 – 180 minuti e per 24 ore e
quindi raccolte per le seguenti analisi.
Dopo due lavaggi con PBS con Ca2+ e Mg2+ caldo (37°C), le cellule sono state lisate
con 200 µL di M-PER (Mammalian Protein Extraction Reagent, Thermo Scientific,
Rockford, Il) contenente l’1% di inibitore di proteasi (Complete Mini EDTA-free,
Proteasi Inhibitor Cocktail Tablets; Roche Diagnostics, Mannheim, Germania) e
fosfatasi (PhosSTOP, Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets; Roche Diagnostics) per
10 minuti in agitazione a temperatura ambiente. La sospensione cellulare è stata
quindi centrifugata per 10 minuti a 14,000 rcf a 4°C ed il surnatante, contenente
l’estratto proteico citoplasmatico e nucleare, è stato recuperato per le seguenti analisi.
La concentrazione proteica dei campioni è stata quantificata con il metodo dell’acido
bicinconinico
(Pierce™
BCA
Protein
Assay
Kit,
Thermo
Scientific)
utilizzando
concentrazioni note di BSA in M-PER (stock 2 mg/mL) per la costruzione di una curva
standard. La densità ottica degli standard e dei campioni è stata letta ad una
lunghezza d’onda di 550 nm utilizzando un lettore di micropiastre (ELX 800, BioTek,
Winooski, VT). Le concentrazioni dei campioni sono state poi interpolate secondo
un’equazione polinomiale quadratica del tipo y=a+bx+cx2.
8.11 SEPARAZIONE DELLA FRAZIONE PROTEICA CITOPLASMATICA
DA QUELLA NUCLEARE
L’estrazione e la separazione della frazione proteica citoplasmatica da quella nucleare
di uno stesso campione di cellule GN-11 è stata effettuata tramite il kit commerciale
NE-PER™ (Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents; Thermo Scientific) secondo
le istruzioni riportate dal produttore. Nello specifico, le cellule GN-11 sono state
seminate in Petri da 100 mm e, raggiunto l’80% di confluenza, incubate o meno per
24 ore in presenza di FAC (200 µM), TNFα (10 ng/ml) o LPS (1 µg/ml). Al termine del
trattamento, le cellule sono state raccolte in tripsina/EDTA allo 0.05/0.02% in PBS
senza Ca2+ e Mg2+ e centrifugate a 1200 rcf per 5 minuti a 4°C. Il pellet cellulare è
stato sospeso in PBS, centrifugato a 500 rcf per 5 minuti a 4°C e quindi solubilizzato e
93 omogeneizzato in una quantità, dipendente dal suo volume, di CER I freddo
addizionato dell’1% di inibitori delle proteasi (Sigma-Aldrich). Dopo un'incubazione di
15 minuti in ghiaccio è stato aggiunto un opportuno volume di CER II freddo e la
soluzione così ottenuta è stata miscelata e incubata per 2 minuti in ghiaccio.
L'aggiunta di CERI e CERII ha consentito la distruzione della membrana cellulare e il
rilascio selettivo del contenuto proteico citoplasmatico. Tramite centrifugazione a circa
16000 rcf per 8 minuti a 4°C è stato possibile precipitare i nuclei ancora intatti ed
isolare il surnatante rappresentativo dell'estratto citoplasmatico. Il pellet insolubile
contenente i nuclei è stato quindi risospeso in NER freddo, un reagente in grado di
liberare il contenuto nucleare, addizionato dell’1% di inibitore delle proteasi (SigmaAldrich). La sospensione è stata lasciata in ghiaccio per 60 minuti, miscelata con il
vortex alla massima velocità ogni 10 minuti e quindi centrifugata a circa 16000 rcf per
10 minuti a 4°C al fine di recuperare l'estratto proteico nucleare contenuto nel
surnatante.
La concentrazione proteica delle frazioni così ottenute è stata quantificata con il kit
Pierce™ BCA Protein Assay (Thermo Scientific, Rockford, Il).
Mediante analisi Western Blotting è stata valutata la capacità di FAC e TNFα di indurre
la traslocazione e l’attivazione di NF-κB nel nucleo.
8.12 ANALISI WESTERN BLOT
La preparazione del campione, la corsa elettroforetica su gel e il trasferimento delle
proteine su membrana di nitrocellulosa è stato effettuato mediante il sistema di
elettroforesi NuPAGE® (Invitrogen™, Life Technologies). Gli estratti proteici (20 µg)
sono stati risospesi in acqua SALF, nel NuPAGE® Reducing Agent (10X) (Novex®, Life
Technologies) contenente ditiotreitolo (DTT, 500 mM) e nel NuPAGE® LDS (lithium
dodecyl sulfate) Sample Buffer (4X) (Novex®, Life Technologies) e quindi riscaldati
per 10 minuti a 70°C. In questo modo l’elettroforesi è stata condotta in condizioni
denaturanti e riducenti e la separazione è avvenuta in base al peso molecolare. I
campioni e un marker di peso molecolare (7 µL) (Novex® Sharp Protein Standard,
Novex®, Life Technologies) sono stati risolti mediante elettroforesi su gel pre-cast di
acrilamide-bisacrilamide (SDS-PAGE) in gradiente 4-12% e dello spessore di 1,5 mm
(NuPAGE® Novex® Bis-Tris Gels, Novex®, Life Technologies). La corsa elettroforetica è
stata effettuata in un tampone salino (NuPAGE® MES SDS Running Buffer; Novex®,
Life Technologies) con l’aggiunta, solo nella camera più interna (spazio delimitato tra
due gel o tra un gel e l’adattatore di plastica) della cella elettrolitica o catodo, di
un’antiossidante (NuPAGE® Novex®, Life Technologies) con la funzione di mantenere
94 le proteine in uno stato ridotto. L’elettroforesi è stata condotta applicando un
voltaggio costante di 200 Volt per 35 minuti. Le proteine sono state quindi trasferite
su una membrana di nitrocellulosa con porosità di 0.2 µm (iBlot® Transfer Stacks,
Invitrogen™, Life Technologies) mediante il sistema a secco dell’iBlot (iBlot® Gel
Transfer Device; Invitrogen™, Life Technologies) utilizzando il programma numero 3
per 7 minuti e 40 secondi. Dopo opportuni lavaggi in TBST/0.1% Tween 20 (trisbuffered tween-20) (NaCl, Tris base, HCl e 0.1% di tween 20) e il bloccaggio con una
soluzione al 5% di BSA in TBST per 1 ora e 30 minuti, per evitare che l'anticorpo leghi
siti di legame aspecifici, si è proceduto all'incubazione, per tutta la notte a 4°C, con
l'anticorpo primario diluito nella soluzione di BSA o latte al 5%. Il giorno successivo,
dopo opportuni lavaggi in TBST, la membrana è stata incubata, per 1 ora e 30 minuti
a temperatura ambiente, con l'anticorpo secondario coniugato alla perossidasi di
rafano in una soluzione di latte al 5%. Dopo ulteriori lavaggi, si è proceduto alla
visualizzazione delle regioni immunoreattive mediante esposizione della membrana ai
substrati
chemiluminescenti
Clarity
Western
ECL
(Bio-Rad)
per
5
minuti.
L’acquisizione delle immagini è stata effettuata tramite il sistema ChemiDoc XRS (BioRad). L’intensità ottica delle bande ottenute è stata calcolata tramite il programma
Image Lab 3.0 (Bio-Rad).
Per analizzare i livelli di espressione di diverse proteine negli stessi campioni caricati
sul medesimo gel, la stessa membrana è stata processata con più anticorpi dopo
strippaggio per 10 minuti a temperatura ambiente con la soluzione Newblot® Nitro
Stripping Buffer (LI-COR; Carlo Erba Reagents, Milano, Italia) e procedendo con le fasi
di bloccaggio, di immunoblotting e di rilevazione del segnale.
Le caratteristiche degli anticorpi utilizzati sono riportate in Tabella 8.4.
95 NOME
kDa
ANTICORPO 1°
ANTICORPO 2°
pERK1/2°
42 - 44
1:150
1:6000
(anti-mouse)
ERK1/2°
42 - 44
1:1000
1:9000
(anti-rabbit)
pAkt*
60
1:1000
1:8000
(anti-rabbit)
Akt*
60
1:1000
1:8000
(anti-rabbit)
pAMPK*
62
1:1000
1:8000
(anti-rabbit)
AMPK*
62
1:1000
1:8000
(anti-rabbit)
pNF-κB p65*
65
1:1000
1:8000
(anti-rabbit)
NF-κB p65*
65
1:2000
1:8000
(anti-rabbit)
Istone H3*
17
1:1000
1:5000
(anti-rabbit)
55
1:2000
1:8000
(anti-mouse)
Tubulina
+
Tabella 8.4 Diluizioni degli anticorpi utilizzati in WB (°Santa Cruz Biotechnology,
Inc., Dallas, Texas, USA; *Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA;
+
Sigma-Aldrich)
8.13 ANALISI IMMUNOCITOCHIMICA
La localizzazione di NF-κB nelle cellule GN-11 è stata anche valutata tramite
immunofluorescenza (IFL). Le cellule sono state seminate su vetrini poli-L-lisinati
(Sigma-Aldrich) del diametro di 12 mm alla densità di 0.15x105 cellule/pozzetto e
sono state cresciute in multiwell da 4 pozzetti fino al raggiungimento della confluenza
ottimale. Dopo trattamento con FAC alla dose di 200 µM per 24 ore, le cellule sono
state lavate rapidamente con PBS (senza Ca2+ e Mg2+, 0,01M pH 7,4)
e
immediatamente fissate in paraformaldeide al 4% per 5 minuti a 4°C. Le cellule
fissate sono state permeabilizzate per 20 minuti con una soluzione allo 0,2% di Triton
X100 in PBS, bloccate per 20 minuti con una soluzione di siero normale al 10% in PBS
e 0,1% di Triton X100 (siero normale di asino, Santa Cruz Biotechnology, Inc), e
incubate con una soluzione diluita dell’anticorpo primario (1:50 anti-NF-κB-p65 in una
soluzione allo 0,1% di Tryton X100 e 0,5% di BSA in PBS, Santa Cruz Biotechnology,
Inc.) per tutta la notte a 4°C. Dopo opportuni lavaggi, le cellule sono state incubate
per un’ora in una soluzione diluita dell’anticorpo secondario specifico (1:200 anticorpo
di asino anti-IgG di ratto, marcato con Alexa Fluor 488F (ab’)2, Molecular Probes,
Eugene, OR). Dopo ulteriori lavaggi, le cellule sono state incubate per 15 minuti a
temperatura ambiente con il 4’-6-diammino-2-fenilindolo (DAPI, 1:5000, SigmaAldrich, Milano, Italia), un colorante nucleare. I vetrini sono stati quindi montati su
96 vetrini coprioggetto con Mowiol® (Sigma-Aldrich, Milano, Italia) e le immagini sono
state acquisite con un microscopio a fluorescenza mediante fotocamera digitale.
8.14 ANALISI STATISTICA DEI DATI
L'analisi statistica è stata condotta con il programma GraphPad Prism 5.0 (San Diego,
CA). I dati sono espressi come media dei valori ottenuti ± deviazione standard (DS) o
errore standard della media (SEM). La lettera “n” indica il numero di replicati in
ciascun esperimento. La significatività delle differenze tra i gruppi oggetto di analisi è
stata valutata con il test t di Student non appaiato, in caso di coppie di parametri
indipendenti, o con l’analisi della varianza (ANOVA) ad una via, seguita dal post-test
di Dunnet o di Tukey, per comparazioni multiple. La significatività è stata attribuita
per valori di p < 0,05.
97 9.
9.1
9.1.1
RISULTATI
MODELLI SPERIMENTALI: MESSA A PUNTO E CRITICITÀ
Scelta del modello murino di sovraccarico marziale
Dalla letteratura emerge l’utilizzo di tre principali tipologie di modelli animali, in
particolare murini, per riprodurre le sindromi da sovraccarico di ferro:
1)
animali con depositi marziali patologici dovuti a quantità eccessive di ferro
esogeno, rappresentativi di un sovraccarico secondario;
2)
animali geneticamente modificati, per mimare le sindromi primarie da eccesso
marziale;
3)
modelli naturali con insorgenza spontanea di sovraccarico marziale, (non
identificati nei roditori) [347].
Il nostro studio, focalizzato sugli effetti dell’eccesso di ferro sulle diverse componenti
dell’asse riproduttivo (ipotalamo – ipofisi – gonadi), con particolare attenzione
all’ipotalamo, nasce come estensione sperimentale della caratterizzazione periferica e
metabolica di un modello murino di sindrome dismetabolica da sovraccarico di ferro
(DIOS – “Dysmetabolic Iron Overload Syndrome”) [1]. Poiché la DIOS è una
condizione associata a sovraccarico secondario di ferro, si è deciso di utilizzare topi
appartenenti alla prima delle suddette categorie. A loro volta, i modelli murini con
sovraccarico esogeno di ferro sono raggruppabili in due categorie in base alla via di
somministrazione di tale metallo:
1)
i modelli di eccesso marziale dietetico o enterale, ottenuti mediante l’aggiunta
di ferro carbonile, ferrocene o citrato di ammonio ferrico alla dieta standard;
2)
i modelli di sovraccarico marziale parenterale, generati tramite l’iniezione di
chelati del ferro, quali il ferro-destrano, il ferro-sorbitolo o il nitrilotriacetato
ferrico.
Sebbene tali modelli differiscano per l’entità di accumulo di ferro e per le conseguenti
caratteristiche fisiopatologiche, essi costituiscono dei sistemi sperimentali validi per
l’indagine dei meccanismi molecolari alla base della fisiopatologia dell’eccesso
marziale [348].
Dalla letteratura non emerge la prevalenza di un particolare ceppo murino wild-type
per lo studio delle sindromi da sovraccarico di ferro. Poiché il nostro primo obiettivo è
stato l’identificazione degli effetti dell’eccesso marziale sul fenotipo biochimico e
metabolico, la nostra scelta è ricaduta su topi wild-type del ceppo C57BL/6J (C57
black 6J), animali “inbred” altamente suscettibili allo sviluppo di insulino-resistenza
98 (IR) e obesità. Tutti gli esperimenti condotti fino ad oggi hanno previsto l’utilizzo di
soli topi maschi adulti al fine di caratterizzare un iniziale quadro fisiopatologico
escludendo le variabilità derivanti dalle fluttuazioni cicliche della funzione riproduttiva
nella femmina adulta [313]. Non sono stati presi in considerazione topi in età prepuberale.
Per indurre un sovraccarico marziale cronico di entità paragonabile a quello dei
pazienti affetti da DIOS [349], abbiamo replicato il modello proposto da Pigeon e
collaboratori [350]. Nel dettaglio, i topi sono stati alimentati con una dieta in pellets
arricchita con 3% di ferro carbonile (IED – “Iron Enriched Diet”), una polvere di ferro
elementare (ridotto), prodotta mediante il processo di carbonilazione, virtualmente
pura e costituita da particelle di dimensioni molto piccole e uniformi con elevata
biodisponibilità [351]. La bassa tossicità del ferro carbonile deriva dal suo particolare
profilo di assorbimento. Per essere assorbito, il ferro carbonile necessita della
preventiva ossidazione e solubilizzazione da parte dell’acido cloridrico dello stomaco;
di conseguenza, la percentuale assorbita è limitata dalla velocità di produzione
dell’acido gastrico e dal rilascio del ferro solubilizzato dallo stomaco all’intestino.
Diversamente dal ferro ferroso, assorbito rapidamente dopo l’assunzione, la bassa
velocità di solubilizzazione del ferro carbonile comporta un suo più graduale
assorbimento e minimizza la sua tossicità [352‐354]. I pazienti che assumono ferro
carbonile tollerano una dose 10 – 150 volte più elevata della dose standard del solfato
ferroso e presentano effetti collaterali pressoché analoghi [354, 355]. Studi di tossicità
del ferro carbonile condotti nei ratti hanno mostrato che la dose a cui tutti gli animali
sopravvivono (LD0) è di 10000 – 15000 mg Fe/kg, mentre la dose letale (LD100) è di
50000 – 60000 mg Fe/kg [352]. Diversi gruppi di ricerca hanno dimostrato che la
somministrazione cronica di una dieta arricchita con il 3% di ferro carbonile comporta
nei roditori una notevole siderosi epatica, senza fibrosi, cirrosi [356‐358] e lesioni
tumorali [350] e riproduce l’aspetto di un fegato umano con emocromatosi [359].
L’incremento dei depositi di ferro nel fegato è positivamente correlato sia alla quantità
di ferro carbonile introdotto con la dieta che alla durata del trattamento [350].
Una prima serie di esperimenti, volti alla caratterizzazione del fenotipo biochimico e
metabolico
di
tale
modello
murino
di
sovraccarico
marziale,
ha
previsto
la
somministrazione della dieta IED a partire dalla VI settimana di vita dell’animale per
un periodo di 16 settimane. A supporto della validità di tale modello sperimentale si
collocano la sideremia, il dosaggio di ferro intraepatico (HIC – “Hepatic Iron
Concentration”), che sono risultati paragonabili a quelli di pazienti affetti da DIOS, i
99 livelli sierici ed epatici di epcidina e l’analisi semiquantitativa e qualitativa istologica
del ferro tramite colorazione di Perls nel fegato e nel tessuto adiposo viscerale (VAT)
[1]. Poiché è emerso che il fenotipo patologico, in termini di alterazione dell’omeostasi
marziale, s’instaura nell’animale già dopo 2 mesi di dieta arricchita con il 3% di ferro
carbonile [1], in analogia agli studi condotti da Pigeon [350], gli esperimenti
successivi, incentrati sulla caratterizzazione degli effetti marziali sull’asse riproduttivo,
si sono protratti per 9 o 11 settimane.
9.1.1.1
Fenotipo metabolico
I primi studi condotti sul modello murino di sovraccarico marziale qui illustrato hanno
evidenziato una correlazione tra elevati depositi tissutali di ferro e l’alterazione del
metabolismo glucidico e lipidico [1]. L’induzione di un fenotipo dismetabolico da parte
della dieta IED è stata confermata mediante misurazione dei valori di glicemia basale
dopo digiuno prolungato per tutta la notte. Dopo 5 settimane di IED, i topi hanno
mostrato un aumento del 76% dei valori di glicemia a digiuno rispetto ai controlli
(controlli: 84,00 ± 2,18 mg/dL; IED: 147,70 ± 20,39 mg/dL; p=0,011) e tale divario
si è mantenuto anche dopo 8 settimane di IED (controlli: 77,50 ± 4,16 mg/dL; IED:
122,00 ± 11,31 mg/dL; p=0,0042) (Figura 9.1, A. B.).
A
B
5 settimane
8 settimane
200
150
150
Glicemia basale
(mg/dL)
Glicemia basale
(mg/dL)
*
100
50
0
**
100
50
0
Controlli
n=6 per gruppo
*p=0,011 (test t)
IED
Controlli
IED
n=6 per gruppo
**p=0,0042 (test t)
Figura 9.1
Glicemia basale misurata dopo digiuno prolungato per tutta la notte in topi controllo
e IED dopo 5 (pannello A) e 8 (pannello B) settimane di trattamento. I dati sono espressi come
media ± DS. Il numero di animali e il valore di p, determinato tramite test t, sono riportati sotto a
ciascun grafico.
100 9.1.1.2
Parametri morfometrici
La IED è stata ben tollerata dal nostro modello animale e non ha provocato evidenti
anormalità anatomiche o di sviluppo ad eccezione del peso. Si è infatti registrata una
riduzione significativa del peso corporeo dei topi IED rispetto ai topi controllo già dopo
la I settimana di dieta (Tabella 9.1). La differenza ponderale è aumentata
progressivamente nel corso del trattamento fino a raggiungere un massimale di 5,41
g dopo 11 settimane di IED (Tabella 9.1, Figura 9.2). Questo effetto della dieta
arricchita con il 3% di ferro carbonile era già stato documentato da altri studi [350, 360]. Nel nostro caso, la minore assunzione di cibo da parte dei topi IED (5,85 g in
media in meno rispetto ai controlli) ha sicuramente contribuito al ridotto incremento
di peso (Tabella 9.2).
Peso corporeo (g)
Settimane
Controlli
IED
(dall’inizio (Media ± DS) (g) (Media ± DS) (g)
della dieta)
(n=5)
(n=5)
Δ
(Controlli - IED) (g)
Valore di p
1
18,79 ± 1,406
16,29 ± 1,891
2,50
0,04493
2
20,40 ± 1,324
17,18 ± 1,697
3,22
0,01009
3
21,79 ± 1,300
17,59 ± 1,637
4,19
0,00204
4
22,32 ± 1,378
17,63 ± 1,612
4,69
0,00113
5
22,69 ± 1,148
18,49 ± 1,530
4,20
0,00117
6
23,22 ± 1,352
18,48 ± 1,745
4,74
0,00135
7
23,85 ± 1,247
19,13 ± 1,787
4,72
0,00129
8
24,66 ± 1,244
19,21 ± 1,660
5,45
0,00037
9
10
24,46 ± 1,168
24,64 ± 1,080
19,38 ± 1,795
19,48 ± 1,706
5,09
5,16
0,00072
0,00045
11
25,29 ± 1,256
19,88 ± 1,519
5,41
0,00028
Tabella 9.1 Peso corporeo di topi controllo e IED registrato settimanalmente dalla prima
settimana di dieta fino al termine del trattamento. La tabella riporta anche la differenza ponderale
tra topi controllo e IED ad ogni settimana e il valore di p associato (test t).
101 Peso corporeo
27.5
Peso (g)
25.0
**
22.5
20.0
**
** **
**
****** ******
Controlli
IED
*
*
17.5
15.0
12.5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11
Settimane
Figura 9.2
Peso corporeo di topi controllo e IED misurato settimanalmente. La settimana 0
indica il peso dei topi all’arrivo in stabulario.
I dati sono espressi come media ± DS (n=5 per gruppo); *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 vs i
rispettivi Controlli (test t).
Controlli (n=5)
IED (n=5)
Settimane
Cibo assunto Media ± DS Cibo assunto Media ± DS
Valore di p
(dall’inizio
(g)
(g)
per topo (g)
per topo (g)
della dieta)
1
22,46
23,84 ± 0,972
17,43
17,99 ± 0,976 p<0,0001
2
23,17
19,03
3
23,56
19,08
4
24,13
19,73
5
23,69
18,08
6
22,55
17,93
7
23,74
17,45
8
23,62
17,18
9
24,58
16,42
10
25,23
17,35
11
25,48
18,23
Tabella 9.2 Cibo assunto in media da ciascun topo settimanalmente e complessivamente durante
tutta la durata del trattamento. Il valore di p è riferito alla differenza tra le quantità di cibo assunte
complessivamente tra i due gruppi (test t).
Per indagare se la dose e la durata del trattamento con ferro potessero indurre delle
alterazioni anatomiche e macroscopiche sull’asse riproduttivo, abbiamo innanzitutto
valutato la presenza di un’eventuale ipotrofia gonadica. Al momento del sacrificio
(dopo 11 settimane di IED), si è proceduto all’isolamento dei testicoli e alla
determinazione del peso e della lunghezza del diametro maggiore di tali organi. Se
102 considerati in modo assoluto, sia il peso (controlli: 0,21 ± 0,018 g; IED: 0,16 ± 0,022
g; p=0,0064) che la lunghezza (controlli: 7,73 ± 0,45 mm; IED: 6,1 ± 0,42 mm;
p=0,0096) delle gonadi sono stati significativamente ridotti dalla dieta IED dopo 11
settimane di trattamento (Figura 9.3, A. B.). Poiché la riduzione del peso corporeo
nei topi IED non è ascrivibile a una restrizione dietetica ma solo ad una spontanea
minore assunzione di cibo, abbiamo normalizzato i valori assoluti dei parametri
testicolari per il peso corporeo dell’animale a sua volta rapportato alla quantità di cibo
assunta. In questo modo, si è mantenuta una riduzione significativa nel peso
(controlli: 0,21 ± 0,011 g; IED: 0,14 ± 0,018 g; p=0,0002) e nella lunghezza del
diametro medio (controlli: 7,45 ± 0,28 mm; IED: 5,27 ± 0,32 mm; p=0,0009) dei
testicoli nei topi IED rispetto ai controlli (Figura 9.3, C. D.).
A
0.23
0.20
**
0.17
0.14
Controlli
IED
n=5 per gruppo
**p=0,0064 (test t)
C
Peso gonadi
normalizzato (g)
9.5
8.5
7.5
**
6.5
5.5
4.5
Controlli
IED
n=15 per gruppo (ogni punto è la media
dei valori di una gabbia da 5 topi ciascuna)
**p=0,0096 (test t)
D
0.27
0.24
0.21
0.18
***
0.15
0.12
Controlli
n=5 per gruppo
***p=0,0002 (test t)
IED
Diametro maggiore
gonadi
normalizzato (mm)
Peso gonadi (g)
0.26
Diametro maggiore
Gonadi (mm)
B
9.5
8.5
7.5
6.5
***
5.5
4.5
Controlli
IED
n=15 per gruppo (ogni punto è la media
dei valori di una gabbia da 5 topi ciascuna)
***p=0,0009 (test t)
Figura 9.3
Parametri testicolari in topi controllo e IED dopo 11 settimane di trattamento:
i pannelli A e B rappresentano, rispettivamente, i valori assoluti di peso (g) e lunghezza del
diametro maggiore (mm); i pannelli C e D illustrano, rispettivamente, il peso (g) e lunghezza del
diametro maggiore (mm) normalizzati per il rapporto tra il peso di ciascun animale e il cibo assunto.
I dati sono espressi come media ± DS. La numerosità degli animali e il valore di p, calcolato
mediante test t, sono riportati sotto a ciascun grafico.
103 9.1.2
Scelta del modello in vitro di sovraccarico marziale
La creazione di due linee cellulari di neuroni GnRH immortalizzati, le GN e le GT1, ha
facilitato l’approccio allo studio della biologia di tali neuroni in vivo. Questa indagine è
stata a lungo ostacolata dalle caratteristiche peculiari dei neuroni GnRH, quali la
differenza tra il sito di origine e quello di differenziazione e proliferazione, il processo
migratorio durante le prime fasi di sviluppo embrionale, la bassa numerosità e la
distribuzione sparsa a livello ipotalamico [361]. Questi due modelli cellulari derivano
da un tumore indotto dopo trasfezione con un gene ibrido costituito dalla regione
codificante per l’oncogene T-antigen del virus SV-40 (simian virus-40) sotto il
controllo del promotore del gene umano (le GN) o di ratto (le GT) per il GnRH. In
particolare, le GN sono generate da un tumore sviluppatosi a livello del placode
olfattorio di topo [362], il sito di partenza della migrazione dei neuroni GnRH
attraverso il bulbo olfattorio [24, 300]; diversamente, le GT1 originano da una
dispersione di cellule di un tumore ipotalamico di topo [363, 364], la sede definitiva
dei neuroni GnRH al termine del processo migratorio.
Nei nostri studi, abbiamo utilizzato rispettivamente i subcloni GN-11 e GT1-7. Queste
due linee cellulari sono distinte per morfologia e fenotipo funzionale:
•
le GN-11 presentano una forma bipolare e crescono in modo omogeneo senza
formare cluster; poiché sono cellule del bulbo olfattorio corrispondono a neuroni
immaturi e con spiccata abilità migratoria [24, 300, 365, 366] (Figura 9.4, A.);
•
le
GT1-7
sono
cellule
poligonali,
ramificate
e
crescono
in
colonie
interconnettendosi mediante i processi neuritici durante la crescita in coltura; la
loro origine ipotalamica ne conferisce i requisiti tipici dei neuroni completamente
differenziati, post-migratori, e GnRH-secernenti [365, 366], i cui corpi cellulari
presentano strutture citoplasmatiche ben sviluppate, granuli secretori di GnRH ed
alti livelli di mRNA codificante per tale ormone [364] (Figura 9.4, B.).
Le differenti caratteristiche biochimiche ed elettrofisiologiche di queste due linee
cellulari permettono quindi di avere a disposizione due modelli di neuroni GnRH
immortalizzati a due stadi evolutivi differenti e sfruttabili per scopi distinti:
•
le GN-11, “GnRH-committed”, per lo studio della migrazione neuronale;
•
le
GT1-7,
“GnRH-secreting”,
per
l’analisi
della
secrezione
dell’ormone
decapeptidico GnRH [366].
Entrambe le linee cellulari possono essere anche considerate come modelli di neuroni
ipotalamici indipendentemente dalla loro capacità di secernere o meno il GnRH [367].
104 Per generare un modello ipotalamico in vitro di sovraccarico marziale, le GN-11 e le
GT1-7 sono state trattate con il Citrato di Ammonio Ferrico (Fe3+, FAC – “Ferric
Ammonium Citrate”), un complesso di ferro ferrico solubile, a basso peso molecolare
[368] e rapidamente internalizzabile dalle cellule [369]. FAC rappresenta un buon
surrogato di accumulo marziale, nella forma di NTBI (“Non-Transferrin Bound Iron”),
nelle cellule in coltura [368, 369] e nelle cellule cerebrali in vivo [214]. Il NTBI è la
forma potenzialmente tossica per l’ambiente cellulare poiché è libero di partecipare
alla reazione di Fenton con conseguente generazione e propagazione di specie
radicaliche dell’ossigeno (ROS) [330]. L’intervallo di concentrazioni marziali a cui
potrebbero essere sottoposte le cellule ipotalamiche in diverse condizioni fisiologiche e
patologiche in vivo è di 10 µM – 1 mM [370]. In effetti, le concentrazioni di ferro
legato alla transferrina (Tf) nel plasma sono comprese nell’intervallo 9 – 30 µM
mentre quelle nella corteccia cerebrale sono circa 650 µM e possono raggiungere 1 –
8.5 mM in condizioni patologiche severe [214]. Per tale ragione, le dosi di FAC
utilizzate nel nostro modello sperimentale in vitro sono comprese tra 100 µM e 1 mM.
A
GN-11
B
GT1-7
Figura 9.4
Cellule GN-11 (pannello A) e GT1-7 (pannello B) mantenute nel terreno di crescita
(DMEM + 10% FBS)
9.2
9.2.1
QUANTIFICAZIONE DEL CONTENUTO CELLULARE DI FERRO
Ipotalamo
Dall’analisi mediante spettrometria di assorbimento atomico è emerso come il
contenuto di ferro totale nell’ipotalamo di topi IED (6,37 ± 1,91 µg/100 mg di tessuto
secco) non abbia subito variazioni rispetto a quello di topi controllo (6,37 ± 2,28
µg/100 mg di tessuto secco) dopo 11 settimane di dieta IED (Figura 9.5, A.). Lo
105 stesso regime alimentare aveva provocato un sostanziale incremento nei livelli
marziali epatici (controlli: 27 ± 21 µg/100 mg di tessuto secco; IED: 501 ± 277
µg/100 mg di tessuto secco; p=0,0004) e del VAT (controlli: 1,2 ± 0,38 µg/100 mg di
tessuto secco; IED: 13,9 ± 1,2 µg/100 mg di tessuto secco; p<0,0001) negli
esperimenti condotti a livello periferico sullo stesso modello sperimentale dal nostro
gruppo di lavoro (grafici non mostrati) [1].
9.2.2
GN-11 e GT1-7
Il contenuto di ferro totale nelle colture cellulari ipotalamiche in condizioni basali è
stato
determinato
mediante
spettrometria
di
assorbimento
atomico.
I
valori
intracellulari marziali delle GN-11 dopo mantenimento per 24 ore nel loro medium di
crescita (DMEM + 10% FBS - “Fetal Bovine Serum”) sono circa due volte più elevati
rispetto a quelli delle GT1-7 nelle stesse condizioni, come indicato dal loro specifico
contenuto di ferro: 0,013 ± 0,018 µg/106 cellule (203,7 µg/L) per le GN-11 e 0,0077
± 0,46 µg/106 cellule (103,5 µg/L) per le GT1-7 (Figura 9.5, B. C. barre nere).
Per determinare la capacità di queste cellule di accumulare ferro, FAC è stato aggiunto
al terreno di crescita alla dose di 200 µM per 24 ore. In entrambe le linee cellulari si è
assistito a un aumento significativo del ferro totale intracellulare sebbene l’accumulo
sia stato molto più marcato nelle cellule GN-11. Infatti, le concentrazioni marziali nelle
GN-11 hanno subito un aumento di 10 volte (0,13 ± 0,52 µg/106 cellule o 3043,2
µg/L; p<0,0001) mentre nelle GT1-7 di circa 5 volte (0,042 ± 0,46 µg/106 cellule o
382,7 µg/L; p<0,001) (Figura 9.5, B. C. barre bianche).
L’accumulo marziale selettivo in entrambi i modelli cellulari suggerisce che tali sistemi
in vitro siano in grado di soddisfare i meccanismi fisiologici alla base della captazione
del ferro [371].
9.2.3
Ipofisi
Le ridotte dimensioni delle ipofisi di topo e la necessità di conservare tale tessuto per
analisi di espressione genica (vedi in seguito) non hanno consentito di dosare il
contenuto intracellulare di ferro mediante spettrometria di assorbimento atomico.
9.2.4
Gonadi
Le gonadi dei topi IED hanno evidenziato la capacità di accumulare il ferro di origine
alimentare come emerge dall’aumento dello specifico contenuto marziale dopo 11
106 settimane di dieta IED (9,80 ± 0,82 µg/100 mg di tessuto secco) rispetto ai topi
controllo (6,57 ± 0,83 µg/100 mg di tessuto secco; p=0,0087) (Figura 9.5, D.).
IPOTALAMO
Contenuto di ferro
(!g/100 mg di
tessuto secco)
A
6
3
0
Controlli
GN-11
B
Contenuto di ferro
(!g/106cellule)
9
0.150
IED
n=3 per gruppo
p=1,0 (ns, test t)
GT1-7
C
****
0.125
0.100
0.075
0.050
***
0.025
0.000
-
n=3 per gruppo
****p<0,0001
(test t)
FAC
200 !M
24 ore
D
-
***p<0,001
(test t)
GONADI
12
Contenuto di ferro
(!g/100 mg di
tessuto secco)
FAC
200 !M
24 ore
n=3 per gruppo
**
9
6
3
0
Controlli
IED
n=3 per gruppo
**p=0,0087 (test t)
Figura 9.5
Dosaggio del contenuto di ferro mediante spettrometria di assorbimento atomico:
(A) nell’ipotalamo di topi controllo e IED dopo 11 settimane di dieta; in cellule (B) GN-11 e (C) GT17 incubate o meno con FAC 200 µM per 24 ore; (D) nelle gonadi di topi controllo e IED dopo 11
settimane di dieta. I dati sono espressi come media ± DS. La numerosità e il valore di p, calcolato
mediante test t sono riportati sotto a ciascun grafico. ns: non significativo.
107 9.3
TOSSICITÀ DEL FERRO A LIVELLO CELLULARE
Gli studi di tossicità cellulare sono stati condotti solo nelle GN-11 poiché è emerso che
tali cellule contengono livelli basali di ferro più elevati delle GT1-7 e ne assorbono una
maggiore quantità dopo trattamento con FAC. Le GN-11 sono quindi potenzialmente
più a rischio di tossicità derivante dalla maggior quota di ferro captato.
9.3.1
GN-11
Per determinare se l’accumulo di NTBI potesse indurre alterazioni nella vitalità delle
cellule GN-11, queste ultime sono state incubate per 3 e 24 ore con FAC alle
concentrazioni di 200 e 500 µM. La vitalità è stata misurata con due diversi metodi:
•
il sistema ATPlite™ 1step (Luminescence ATP Detection Assay System) che
consente di quantificare le cellule vitali in coltura basandosi sulla quantificazione
indiretta dell’ATP presente;
•
metodo di esclusione del Trypan Blue tramite il contatore di cellule automatizzato
Luna
TM
.
L’accumulo cellulare di ferro non è stato accompagnato da una riduzione della vitalità
come indicato, con il primo dei suddetti metodi, dall’assenza di variazioni nel
contenuto di ATP (Figura 9.6, A. B.) e, con il secondo test, dal numero invariato di
cellule vive e morte (Figura 9.6, C. D.) a tutte le dosi e le tempistiche di FAC testate
in rapporto alle rispettive cellule controllo (no FAC).
Per apportare un’ulteriore prova dell’assenza di tossicità del FAC nelle GN-11, è stata
analizzata la morfologia di tali cellule al microscopio ottico dopo trattamento con FAC
200 µM e 500 µM per 24 ore nel terreno di crescita. Come si evince dalla Figura 9.7,
A. B. C, la presenza di FAC nel medium non ha indotto cambiamenti di morfologia né
segni di sofferenza rispetto alle analoghe cellule non trattate.
108 GN-11
9!105
8!105
7!105
6!105
5!105
FAC [!M]
--
200
200
500
500
B
Luminescenza in CPS
(Counts per second)
Luminescenza in CPS
(Counts per second)
A
8!105
7!105
6!105
5!105
4!105
FAC [!M]
-
200
-
200
3 ore
24 ore
n=4 per gruppo
ns (ANOVA)
n=4 per gruppo
ns (ANOVA)
C
D
105
105
Vitalità (%)
Vitalità (%)
500
500
100
95
90
85
FAC [!M]
100
95
90
85
-
200
500
FAC [!M]
-
200
3 ore
500
24 ore
n=2 per gruppo
ns (ANOVA)
n=2 per gruppo
ns (ANOVA)
Figura 9.6
Determinazione della vitalità delle cellule GN-11 dopo esposizione a FAC 200 µM o
500 µM per 3 ore (pannelli A, C) o 24 ore (pannelli B, D) mediante due diverse tecniche: il
sistema ATPlite™ 1step (Luminescence ATP Detection Assay System) (pannelli A, B) o il metodo di
esclusione del Trypan Blue con il contatore di cellule automatizzato LunaTM (pannelli C, D). I dati
sono espressi come media ± DS. La numerosità e il valore di p, determinato mediante ANOVA, sono
riportati sotto a ciascun grafico. ns: non significativo.
GN-11
A
B
C
Figura 9.7
Valutazione mediante microscopio ottico della morfologia delle cellule GN-11 in
condizioni basali (pannello A) e dopo trattamento con FAC alla dose di 200 µM (pannello B) e 500
µM (pannello C) per 24 ore. Le immagine riportate sono un esempio rappresentativo di 3 diversi
esperimenti.
109 9.4 ESPRESSIONE GENICA DEL RECETTORE DELLA TRANSFERRINA
(TfR), DELLA FERRITINA H (FtH) E DI EPCIDINA
9.4.1
Ipotalamo
La sintesi dell’mRNA del recettore della transferrina (TfR), della ferritina H (FtH) e di
epcidina nell’ipotalamo è stata accertata mediante RT-qPCR ed i livelli di espressione
sono stati rapportati a quelli epatici. Come si evince dalla Tabella 9.3, la quantità di
mRNA del TfR e della FtH nell’ipotalamo è paragonabile a quella nel fegato mentre, a
conferma di studi in letteratura condotti sul topo [225, 269], la sintesi ipotalamica di
epcidina è notevolmente ridotta rispetto a quale epatica. Per tale ragione si è deciso di
focalizzare la nostra attenzione solo su TfR e FtH.
GENE
FEGATO
IPOTALAMO
TfR
100 ± 1,20
107,6 ± 3,4
FtH
100 ± 1,06
93,4 ± 1,9
Epcidina
100 ± 0,08
6,9 ± 1,9
Tabella 9.3 Livelli di espressione degli mRNA di TfR, FtH e epcidina nell’ipotalamo e nel fegato.
I dati (media ± SEM, n=3 per gruppo) sono espressi come differenza tra i cicli (Ct) dei geni di
interesse e i Ct del gene costitutivo 18S. L’espressione genica ipotalamica è rapportata a quella
epatica posta uguale a 100%.
9.4.2
GN-11 e GT1-7
Poiché dalla letteratura non emergono evidenze in merito all’utilizzo delle linee
cellulari GN-11 e GT1-7 per lo studio degli effetti del sovraccarico marziale, abbiamo
indagato se vi fossero i presupposti molecolari per l’utilizzo di tali modelli cellulari per
il nostro studio con il ferro. Nello specifico, mediante analisi RT-PCR, è stata valutata
l’espressione genica del TfR e della FtH nelle cellule GN-11 e GT1-7 mantenute nel
consueto medium di crescita (DMEM + 10% FBS). I campioni contenenti gli RNA totali
sono stati sottoposti, inizialmente, a reazione di trascrizione inversa (RT) e,
successivamente, ad amplificazione del cDNA ottenuto. L’espressione del gene
costitutivo 18S, indicata da un prodotto amplificato di 250 paia di basi (bp), è stata
utilizzata per confermare il buon esito della reazione di retrotrascrizione. In tutti i
campioni analizzati, l’espressione di TfR e di FtH è stata dimostrata dalla presenza di
prodotti amplificati rispettivamente di 242 e 199 bp. Il corretto funzionamento della
reazione RT-PCR e l’assenza di contaminazioni sono stati accertati dalla mancata
presenza di bande nel controllo negativo, ovvero privo di cDNA (H2O) (Figura 9.8).
110 Sulla base dei presenti risultati, si è quindi dedotto che, da un punto di vista genico, le
cellule GN-11 e GT1-7 esprimono le proteine essenziali per l’internalizzazione (TfR) e
il deposito intracellulare di ferro (FtH). Tali linee cellulari rappresentano quindi dei
buoni “tools” traslazionali per lo studio degli effetti centrali (ipotalamo) del
TfR
242 bp
FtH
199 bp
H2 O
GT1
-7
GN
-11
mw
H2 O
GT1
-7
11
GN-
GT1
-7
GN-
mw
11
sovraccarico marziale.
18S
250 bp
Figura 9.8
Analisi RT-PCR dell’espressione genica del TfR e della FtH nelle cellule GN-11 e GT17. L’immagine mostra anche il trascritto del gene costitutivo 18S. Mw: marker di peso molecolare.
H2O: campione contenente la miscela di reazione ad eccezione del campione di cDNA (controllo
negativo).
9.4.3
Gonadi
Mediante RT-qPCR è stata anche confermata l’espressione genica di TfR, FtH e
epcidina nel tessuto testicolare (vedi sezione seguente Figura 12, A. B. C.)
9.5
MODULAZIONE DEI GENI SENSIBILI AL FERRO (TfR, FtH e,
nelle gonadi, epcidina)
Quando i livelli marziali eccedono le necessità cellulari e tissutali, il sistema IRE/IRP
(“Iron-Responsive Element/Iron-Regulatory Protein”) minimizza la captazione di ferro
mediante
riduzione
dell’espressione
del
TfR
e
favorisce
l’immagazzinamento
dell’eccesso di ferro nella Ft (Ferritina) incrementandone la sintesi. L’organismo
risponde al sovraccarico marziale anche aumentando la concentrazione di epcidina
che, a sua volta, degrada la ferroportina con conseguente riduzione dell’assorbimento
di ferro dietetico e promozione della ritenzione di ferro nei macrofagi [329].
111 9.5.1
Ipotalamo
In analogia con studi in letteratura incentrati sugli effetti del sovraccarico di ferro
sull’espressione cerebrale di geni specifici correlati al metabolismo marziale [264‐266, 372], nel nostro modello murino, non si sono osservati cambiamenti nei livelli dei
trascritti ipotalamici per il TfR (p=0,261) e la FtH (p=0,245) nei topi IED rispetto ai
controlli (Figura 9.9, A. B.). L’analisi RT-qPCR è stata condotta su campioni di RNA
totale estratto da ipotalami interi di topi alimentati con IED per 9, 11 e 16 settimane
(questi ultimi sono gli animali su cui sono stati condotti i primi esperimenti per la
caratterizzazione
del
fenotipo
metabolico)
[1]. In tal modo è stata esclusa
l’eventualità che il trattamento per 9 e 11 settimane non fosse stato sufficiente per
indurre modificazioni centrali dello stato di ferro. Poiché i 3 diversi periodi di
trattamento hanno mostrato il medesimo andamento si è deciso di riunirli in un unico
gruppo rispettivamente per i topi controllo e per i topi IED.
IPOTALAMO
A
TfR
B
FtH
140
120
mRNA FtH/rRNA 18S
(% del controllo)
mRNA TfR/rRNA 18S
(% del controllo)
120
100
80
60
40
20
0
100
80
60
40
20
0
Controlli
n=14 Controlli, n=16 IED
p=0,261 (ns, test t)
IED
Controlli
IED
n=14 Controlli, n=16 IED
p=0,245 (ns, test t)
Figura 9.9
Effetti della manipolazione dietetica del ferro sul metabolismo marziale ipotalamico.
Analisi RT-qPCR dell’espressione genica del TfR (pannello A) e della FtH (pannello B) in ipotalami
interi di topi controllo (barre nere) e IED (barre bianche) dopo 9, 11 e 16 settimane di trattamento.
I 3 diversi periodi di trattamento sono stati riuniti in un solo gruppo rispettivamente per i topi
controllo e IED poiché caratterizzati dal medesimo andamento. I livelli di ciascun gene d’interesse
sono normalizzati su quelli della subunità ribosomiale 18S (gene costitutivo). I dati (media ± SEM)
sono espressi come percentuale del controllo (topi controllo), posto uguale a 100%. Il numero di
animali per ciascun gruppo e il valore di p, ottenuto mediante test t, sono indicati sotto a ciascun
grafico. ns: non significativo.
112 9.5.2
GN-11 e GT1-7
Mediante analisi RT-qPCR, è stata indagata la capacità delle cellule GN-11 e GT1-7 di
rispondere alla variazione della concentrazione di ferro nel medium di crescita tramite
la modulazione della trascrizione genica delle proteine coinvolte nella regolazione
dell’omeostasi marziale (TfR e FtH).
L’aggiunta di FAC alle dosi di 200 µM e 500 µM nel medium delle cellule GN-11 per 24
ore ha determinato una riduzione dell'espressione genica del TfR (FAC 200 µM: -58%,
p<0,0001; FAC 500 µM: -47%, p<0,0001) e, al contrario, un incremento dei livelli di
mRNA della FtH (FAC 200 µM: +83%, p<0,05; FAC 500 µM: +151%, p<0,01)
(Figura 9.10, A. B.).
GN-11
B
TfR
120
100
80
60
****
40
****
20
0
FAC [!M]
-
200
500
24 ore
n=6 per gruppo
****p<0,0001 vs Controllo (ANOVA)
mRNA FtH/rRNA 18S
(% del controllo)
mRNA TfR/rRNA 18S
(% del controllo)
A
FtH
**
300
250
*
200
150
100
50
0
FAC [!M]
-
200
500
24 ore
n=6 per gruppo
*p<0,05, **p<0,01 vs Controllo (ANOVA)
Figura 9.10 Effetti dell’aumento della concentrazione di ferro sull’omeostasi marziale delle cellule
GN-11. Analisi RT-qPCR della modulazione dell’mRNA del TfR (pannello A) e della FtH (pannello B)
nelle cellule GN-11 dopo trattamento (barre bianche) o meno (barre nere) con FAC alle dosi di 200 e
500 µM per 24 ore. I livelli di ciascun gene d’interesse sono normalizzati su quelli della subunità
ribosomiale 18S (gene costitutivo). I dati (media ± SEM) sono espressi come percentuale del
controllo (cellule non trattate), posto uguale a 100%. Il numero di campioni per ciascun trattamento
e il valore di p, determinato tramite ANOVA, sono indicati sotto a ciascun grafico.
L’aggiunta di FAC 200 µM al medium delle GT1-7 per 24 ore ha portato ad un
notevole calo nell’espressione dell'mRNA del TfR (-75,32%, p<0,0001) e un
contemporaneo aumento di quello della FtH (+92,5%, p=0,047) (Figura 9.11, A.
B.). A parità di dose di ferro (FAC 200 µM), le GT1-7 si sono mostrate più responsive
delle GN-11 nella modulazione dei geni del TfR e della FtH.
113 GT1-7
B
TfR
120
100
80
60
40
****
20
0
FAC [!M]
-
200
mRNA FtH/rRNA 18S
(% del controllo)
mRNA TfR/rRNA 18S
(% del controllo)
A
300
250
*
200
150
100
50
0
FAC [!M]
-
200
24 ore
24 ore
n=6 per gruppo
****p<0,0001 vs Controllo (test t)
FtH
n=6 per gruppo
*p=0,047 vs Controllo (test t)
Figura 9.11 Effetti dell’aumento della concentrazione di ferro sull’omeostasi marziale delle cellule
GT1-7. Analisi RT-qPCR dell’espressione genica del TfR (pannello A) e della FtH (pannello B) nelle
cellule GT1-7 dopo trattamento (barre bianche) o meno (barre nere) con FAC alla concentrazione di
200 µM per 24 ore. I livelli di ciascun gene d’interesse sono normalizzati su quelli della subunità
ribosomiale 18S (gene costitutivo). I dati (media ± SEM) sono espressi come percentuale del
controllo (cellule non trattate), posto uguale a 100%. Il numero di campioni per ciascun trattamento
e il valore di p, determinato mediante test t, sono indicati sotto a ciascun grafico.
9.5.3
Gonadi
L’analisi RT-qPCR condotta sull’RNA estratto dalle gonadi dopo 9 e 11 settimane di
trattamento non ha mostrato variazioni nell’espressione genica di TfR (p=0,131), Fth
(p=0,517) ed epcidina (p=0,184) tra topi IED e controllo (Figura 9.12, A. B. C),
analogamente a quanto osservato nell’ipotalamo.
114 GONADI
A
TfR
B
120
mRNA FtH/rRNA 18S
(% del controllo)
mRNA TfR/rRNA 18S
(% del controllo)
120
100
80
60
40
20
0
FtH
Controlli
100
80
60
40
20
0
IED
n=6 per gruppo
p=0,131 (ns, test t)
Controlli
IED
n=6 per gruppo
p=0,517 (ns, test t)
Epcidina
mRNA Epcidina/rRNA 18S
(% del controllo)
C
120
100
80
60
40
20
0
Controlli
IED
n=6 per gruppo
p=0,184 (ns, test t)
Figura 9.12 Effetti della manipolazione dietetica del ferro sul metabolismo marziale nelle gonadi.
Analisi RT-qPCR dell’espressione genica del TfR (pannello A), della FtH (pannello B) e di epcidina
(pannello C) nei testicoli di topi controllo (barre nere) e IED (barre bianche) dopo 9 e 11 settimane
di trattamento. I 2 diversi periodi di trattamento sono stati riuniti in un solo gruppo rispettivamente
per i topi controllo e IED poiché caratterizzati dal medesimo andamento. I livelli di ciascun gene
d’interesse sono normalizzati su quelli della subunità ribosomiale 18S (gene costitutivo). I dati
(media ± SEM) sono espressi come percentuale del controllo (topi controllo), posto uguale a 100%.
Il numero di animali usati in ciascun gruppo e il valore di p, determinato tramite test t, sono indicati
sotto a ciascun grafico. ns: non significativo.
115 9.6
EFFETTO
DELL'ACCUMULO
MARZIALE
SULLA
CAPACITÀ
MIGRATORIA DELLE CELLULE GN-11
Il GnRH è l’ormone ipotalamico chiave nel controllo della funzione riproduttiva.
L’iniziazione della cascata riproduttiva in tutte le specie di mammiferi richiede il
completamento, durante l’età embrionale, di un complesso programma di sviluppo
che consiste nella migrazione dei neuroni GnRH dai placodi olfattori, lungo i nervi
olfattori
e
attraverso
il
compartimento
nasale,
nel
prosencefalo
ed
infine
nell’ipotalamo dove promuovono la competenza riproduttiva [23, 24, 373, 374].
Mediante il saggio di microchemiotassi della camera di Boyden, è stato testato
l’effetto del ferro sulla capacità migratoria delle cellule GN-11, un validato modello per
studi di migrazione cellulare [373, 375]. In assenza di fattori chemiotattici, le GN-11
hanno mostrato una motilità spontanea molto esigua (dati non mostrati). Al contrario,
una maggiore risposta migratoria è stata indotta dall'esposizione di tali cellule all'1%
di FBS, un potente agente chemiotattico [365, 366]. Per tale ragione, la migrazione
delle GN-11 indotta dall’1% di FBS è stata considerata come controllo interno
positivo, in termini di percentuale di cellule migrate.
Le cellule GN-11 sono state pretrattate per 24 ore con diverse concentrazioni (100,
200, 500, 1000 µM) di FAC e quindi esposte per 1 ora e 45 minuti all’1% di FBS nella
camera di Boyden. L’aggiunta di FAC ha determinato una riduzione dose-dipendente
della chemomigrazione indotta da FBS a partire da una concentrazione pari a 200 µM
(-17%, p<0,01) raggiungendo il massimo di inibizione alla dose di 500 µM (-24%,
p<0,01). Il trattamento con concentrazioni più elevate di FAC non ha comportato
un’ulteriore diminuzione della migrazione stimolata dall’1% di FBS (Figura 9.13, A.).
Poiché tale lavoro di tesi ha previsto l’indagine del contributo di specifiche vie di
segnale sull’inibizione, FAC-dipendente, delle cellule GN-11 esposte all’1% di FBS
(vedi in seguito), si è reso necessario valutare l’effetto di dosi crescenti di FAC con
tempi d’incubazione più brevi prima del caricamento nella camera di Boyden. Il
pretrattamento delle cellule GN-11 per 1 ora con FAC alle concentrazioni di 200, 500 e
1000 µM, prima del caricamento nella camera di Boyden a contatto con l’1% di FBS,
ha comportato un’inibizione della migrazione FBS-indotta con un profilo analogo
rispetto a quello ottenuto dopo pretrattamento per 24 ore con FAC alle medesime dosi
(FAC 200 µM vs Controllo: -34%, p<0,001; FAC 500 µM vs Controllo: -38%,
p<0,001; FAC 1000 µM vs Controllo: -14%, p<0,01) (Figura 9.13, B).
Successivamente, le GN-11 sono state pretrattate per 24, 48 e 72 ore con FAC 200
µM e quindi esposte per 1 ora e 45 minuti all’1% di FBS, come chemoattrattore. FAC
116 ha inibito la chemomigrazione stimolata da FBS in modo tempo-dipendente e tale
riduzione è risultata significativa a partire da 24 ore (-23%, p<0,01), per raggiungere
la massima percentuale di inibizione a 72 ore (-36%, p<0,001) (Figura 9.13, C.).
L’effetto antimigratorio indotto dal trattamento con ferro è stato confermato
dall’associazione in rapporto molare 1:1 del FAC (200 µM) con un agente chelante del
ferro esadentato, il DFO (deferoxamina mesilato) (200 µM), per 24 ore. Tale
associazione ha annullato l'effetto inibitorio del ferro sulla migrazione FBS-indotta
delle cellule GN-11, ripristinando livelli migratori simili a quelli delle cellule controllo
non trattate. Come atteso, la deprivazione del contenuto di ferro normale delle cellule
GN-11, mediante incubazione con solo DFO alla dose di 200 µM per 24 ore, ha
dimezzato la migrazione basale, indotta da 1% di FBS, delle cellule GN-11 (-49%;
p<0,001) (Figura 9.13, D.).
117 B
120
100
100
**
**
80
**
60
40
20
**
80
***
***
60
40
20
0
FAC [!M]
120
Migrazione indotta
da FBS 1%
(% del controllo)
Migrazione indotta
da FBS 1%
(% del controllo)
A
0
-
100 200
500 1000
FAC [!M]
-
Pretrattamento di 24 ore
200
500
1000
Pretrattamento di 1 ora
n=10 per gruppo
**p<0,01, ***p<0,001 vs Controllo
(ANOVA)
n=8 per gruppo
**p<0,01 vs Controllo (ANOVA)
*
120
**
*
***
100
D
Migrazione indotta
da FBS 1%
(% del controllo)
Migrazione indotta
da FBS 1%
(% del controllo)
C
80
60
40
120
80
60
40
20
0
0
FAC [200 !M] -
+
24
-
+
48
-
+
72
*
100
20
Pretrattamento
[ore]
***
FAC [200 µM]
-
+
-
+
DFO [200 µM]
-
-
+
+
Pretrattamento di 24 ore
n=6 per gruppo
*p<0,05, **p<0,01 ***p<0,001 (ANOVA)
n=6 per gruppo
*p<0,05, ***p<0,001 (ANOVA)
Figura 9.13 Analisi mediante camera di Boyden della risposta chemiotattica delle cellule GN-11 al
trattamento con FAC. Le cellule GN-11 sono state sottoposte ai seguenti trattamenti: dosi crescenti
di FAC (100 – 1000 µM) per 24 ore (pannello A) o per 1 ora (pannello B); FAC 200 µM per tempi
crescenti (24 – 72 ore) (pannello C); DFO (200 µM) da solo o in associazione con FAC (200 µM) per
24 ore (pannello D). Successivamente le cellule GN-11 sono state esposte nella camera di Boyden
all’agente chemioattrattore (DMEM con l’1% di FBS) per 1 ora e 45 minuti. I dati (media ± SEM in 3
diversi esperimenti) sono espressi come percentuale del controllo (cellule non trattate esposte a
DMEM 1% FBS, barre nere) posto uguale a 100%. Il numero di campioni per ciascun trattamento e i
valori di p, determinati mediante ANOVA, sono riportati sotto a ciascun grafico.
118 9.7
EFFETTO
DEL
SOVRACCARICO
MARZIALE
SULLA
MODULAZIONE DEL SIGNALING NELLE CELLULE GN-11
Poiché il ferro ha mostrato un effetto inibitorio sulla chemomigrazione stimolata da
FBS delle cellule GN-11, si è voluto indagare il concomitante pattern di attivazione di
specifiche vie intracellulari di trasduzione del segnale. In particolare, tale analisi si è
focalizzata sulla cinetica di attivazione delle vie di ERK1/2 (Extracellular-SignalRegulated Kinase 1/2), Akt e AMPK (5’-AMP-activated protein kinase) poiché, da
nostri precedenti studi, era emerso il diverso coinvolgimento di tali vie nel processo
migratorio delle cellule GN-11 [373, 375].
Le cellule GN-11 sono state mantenute in medium deprivato di siero per 15 ore e,
successivamente, trattate con FAC (200 µM) per tempi compresi tra 5 minuti e 24
ore. Ai tempi indicati, le cellule sono state raccolte e gli estratti proteici totali sono
stati immunoblottati con anticorpi anti-fosfo (p) ERK1/2, anti-pAkt e anti-pAMPK e
quindi con anticorpi anti-ERK1/2, anti-Akt e anti-AMPK. I valori ottenuti per le
proteine
fosforilate sono
stati normalizzati rispetto
a
quelli registrati per le
corrispondenti proteine basali che sono risultate costitutivamente espresse in tale
linea cellulare. L’analisi Western Blotting ha evidenziato la capacità di FAC di modulare
la fosforilazione e quindi l’attivazione di ERK1/2, Akt e AMPK con profili differenti.
Nello specifico:
•
ERK1/2 ha subito una rapida (5 minuti) fosforilazione che è aumentata
gradualmente dopo 10 e 20 minuti di incubazione con FAC. Nei tempi
successivi (30, 60 e 180 minuti) i livelli di pERK si sono progressivamente
ridotti fino al ritorno a valori basali a 24 ore. Non sono stati identificati
cambiamenti significativi nei livelli basali di ERK1/2 (Figura 9.14, A.).
•
pAkt aumenta dopo 10, 20 e 60 minuti di trattamento con FAC e non subisce
variazioni significative negli altri tempi di incubazione analizzati (5, 30, 180
minuti e 24 ore). Non è stata osservata alcuna modificazione nei livelli basali di
Akt (Figura 9.14, B.).
•
La fosforilazione di AMPK ha mostrato un profilo di attivazione diverso rispetto
a ERK1/2 e Akt: si è registrata una diminuzione dei valori di pAMPK dopo 20,
30, 60 e 180 minuti di incubazione con FAC e tale effetto si è mantenuto anche
dopo 24 ore. I livelli basali di espressione di AMPK non sono stati modificati
(Figura 9.14, C.).
119 kDa
44
A
pERK
42
44
ERK
42
FAC
[200 !M]
-
+
+
+
+
+
+
Tempo di
incubazione
[minuti/ore]
-
5’
10’
20’
30’
60’
3h
OD pERK/ERK
(% del controllo)
600
**
500
-
+
24h 24h
**
**
400
*
300
200
100
0
Tempo di
incubazione
[minuti/ore]
-
5’ 10’ 20’ 30’ 60’ 3h
Controllo
24h 24h
FAC 200 !M
*p<0,05, **p<0,01 vs Controllo
kDa
B
pAkt
60
Akt
60
FAC
[200 !M]
-
+
+
Tempo di
incubazione
[minuti/ore]
-
5’
10’ 20’
+
OD pAkt/Akt
(% del controllo)
300
+
+
+
30’
60’
3h
-
+
24h 24h
*
200
*
*
100
0
Tempo di
incubazione
[minuti/ore]
-
5’ 10’ 20’ 30’ 60’ 3h
Controllo
24h 24h
FAC 200 !M
*p<0,05 Controllo
120 kDa
C
pAMPK
62
AMPK
62
FAC
[200 !M]
-
+
+
Tempo di
incubazione
[minuti/ore]
-
5’
10’ 20’
+
+
+
+
30’
60’
3h
-
+
24h 24h
OD pAMPK/AMPK
(% del controllo)
125
100
75
*
*
*
*
50
*
25
0
Tempo di
incubazione
[minuti/ore]
-
5’ 10’ 20’ 30’ 60’ 3h
Controllo
24h 24h
FAC 200 !M
*p<0,05 Controllo
Figura 9.14 Effetto del trattamento con FAC 200 µM sulla fosforilazione (p) di ERK1/2 (pannello
A), Akt (pannello B) e AMPK (pannello C) nelle cellule GN-11. Tutti gli esperimenti e le analisi
statistiche descritte in questa figura sono state condotte come segue: le cellule sono state deprivate
di siero per 15 ore e quindi esposte o meno a FAC 200 µM per 5 – 60 minuti, 3 ore e 24 ore. 20 µg
di estratto proteico di ciascun campione sono stati analizzati mediante Western Blotting. L’analisi
densitometrica è relativa a 5 esperimenti indipendenti di cui è mostrato un blot rappresentativo. I
dati (media ± SEM) sono espressi come percentuale del controllo (cellule non trattate, barre nere)
posto uguale a 100%. I valori di p, ottenuti tramite ANOVA, sono indicati sotto a ciascun grafico. I
livelli di pERK1/2 (pannello A), pAkt (pannello B) e pAMPK (pannello C) sono stati normalizzati,
rispettivamente, su quelli di ERK1/2, Akt e AMPK.
9.8
VIE
DI
SEGNALE
COINVOLTE
NELL'INIBIZIONE
FERRO-
DIPENDENTE DELLA CHEMOMIGRAZIONE DELLE CELLULE GN-11
Abbiamo quindi valutato se effettivamente le vie di segnale di ERK1/2, Akt e AMPK,
che abbiamo dimostrato essere modulate dal ferro, fossero coinvolte nella riduzione
della migrazione delle cellule GN-11 indotta da FAC. A tal scopo è stata condotta
un’altra serie di saggi di chemomigrazione in presenza degli inibitori selettivi di
MEK1/2 (U0126 10 µM), di PIK3/Akt (LY-294,002 10 µM) e di AMPK (Composto C 10
µM) in associazione o meno con FAC alla dose di 200 µM.
121 Nel dettaglio, le cellule GN-11 sono state pretrattate o meno con i suddetti inibitori
per 30 minuti, incubate con FAC 200 µM in associazione o meno con gli stessi inibitori
per 1 ora, e successivamente caricate nella camera di Boyden a contatto con l’1% di
FBS per 1 ora e 45 minuti.
I risultati ottenuti sono riassunti in figura 9.15:
•
L’esposizione al solo inibitore di ERK1/2 ha ridotto significativamente la migrazione
delle GN-11 stimolata da FBS (-30% vs Controllo, p<0,0001) anche se in modo
minore rispetto al solo FAC (-39% vs Controllo, p<0,0001). Il trattamento delle
GN-11 con U0126 in associazione a FAC ha inibito la migrazione FSB-indotta delle
GN-11 (-39% vs Controllo, p<0,0001) analogamente al solo FAC.
•
L’incubazione con il solo inibitore di Akt ha diminuito la migrazione FBS-indotta
delle GN-11 (-42% vs Controllo, p<0,0001) in modo simile al solo FAC (-39% vs
Controllo, p<0,0001). L'associazione di FAC con LY-294,002 ha amplificato
ulteriormente l’inibizione della migrazione FBS-indotta delle GN-11 (-56% vs
controllo, p<0,0001) rispetto al trattamento con solo FAC. In particolare, tale
riduzione è risultata essere del 28% in meno rispetto al trattamento con solo FAC
(p<0,0001) e del 24% in meno rispetto al solo LY-294,002 (p<0,01).
•
Il trattamento con il solo inibitore della via di AMPK ha determinato un calo
consistente della migrazione FBS-indotta delle GN-11 (-78% vs Controllo;
p<0,0001) e della stessa entità di quello provocato dall’associazione di FAC con il
Composto C (-80% vs Controllo, p<0,0001). L’aggiunta dell’inibitore di AMPK sia
da solo sia con FAC ha ridotto la migrazione stimolata da FBS delle GN-11 in modo
più consistente rispetto al solo FAC (-39% vs Controllo, p<0,0001; Composto C vs
FAC: -64%, p<0,0001; FAC + Composto C vs FAC: -68%, p<0,0001).
•
L’associazione di U0126, LY-294,002 e Composto C ha diminuito drasticamente la
migrazione rispetto al controllo (-97%; p<0,0001) e al solo FAC (-95%;
p<0,0001). Tale riduzione è stata ulteriormente amplificata dal co-trattamento
degli inibitori con FAC (-99% vs Controllo; p<0,0001; -98% vs FAC; p<0,0001).
Gli inibitori utilizzati, sia da soli che in combinazione, non hanno portato a morte
cellulare, come indicato dal saggio di colorazione con trypan-blue (dato non
mostrato).
122 Migrazione indotta
da FBS 1%
(% del controllo)
120
100
80
****
60
°
**** +
****
40
**** ^^
°°°°
****
°°°°
****°°°°
****
20
°°°° °°°°
********
0
FAC 500 !M
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
U0126 10 !M
-
-
+
+
-
-
-
-
+
+
LY-294,002 10 !M
-
-
-
-
+
+
-
-
+
+
COMPOSTO C 10 !M
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
****p<0,0001 vs Controllo
°p<0,05, °°°°p<0,0001 vs FAC
+p<0,05 vs U0126
^^p<0,01 vs LY294
(ANOVA)
Figura 9.15 Coinvolgimento delle vie di segnale di ERK1/2, Akt e AMPK nell’inibizione FAC-
dipendente della migrazione FBS-indotta delle GN-11. Il saggio è stato condotto mediante camera di
Boyden. Le cellule GN-11 sono state pretrattate o meno per 30 minuti con U0126 (inibitore selettivo
di MEK1/2), LY-294,002 (inibitore selettivo di PI3K/Akt) o Composto C (inibitore selettivo di AMPK)
(tutti alla dose di 10 µM), trattate o meno con FAC 200 µM per 1 ora prima dell’esposizione al
chemoattrattore (DMEM con 1% di FBS) nella camera di Boyden per 1 ora e 45 minuti. I dati (media
± SEM di 10 determinazioni in 3 diversi esperimenti) sono espressi come percentuale del controllo
(cellule non trattate esposte a DMEM 1% FBS, barra nera) posto uguale a 100%. I valori di p,
determinati mediante ANOVA, sono riportati sotto al grafico.
9.9
EFFETTO DELL’ESPOSIZIONE A DOSI ECCESSIVE DI FERRO
SUL PATHWAY INFIAMMATORIO IN VIVO E NELLE CELLULE GN-11
9.9.1
Ipotalamo
I primi studi volti alla caratterizzazione degli effetti periferici e sistemici del
sovraccarico dietetico di ferro non hanno evidenziato la presenza d’infiammazione nel
fegato e nel VAT sebbene tali organi abbiano mostrato accumulo selettivo di ferro e
123 danno ossidativo (dati non mostrati) [1]. La mancata attivazione del signaling
infiammatorio a livello sistemico è stata anche confermata da invariati livelli sierici di
TNFα (“Tumor Necrosis Factor α”) nei topi IED rispetto ai controlli (dati non mostrati)
[1].
Nell’ipotalamo, l’analisi mediante RT-qPCR non ha evidenziato alcun cambiamento
nell’espressione
genica
della
citochina
pro-infiammatoria
interleuchina-6
(IL-6)
(p=0,752) dopo 9 e 16 settimane di dieta IED (i 2 diversi periodi di trattamento sono
stati riuniti in un solo gruppo rispettivamente per i topi controllo e IED poiché
caratterizzati dal medesimo andamento). Lo stesso trattamento ha invece provocato
un incremento significativo nei livelli dell’mRNA del TNFα (+102%, p=0,0139)
(Figura 9.16, A. B.).
IPOTALAMO
A
IL-6
B
250
mRNA TNF!/rRNA 18S
(% del controllo)
mRNA IL-6/rRNA 18S
(% del controllo)
125
100
75
50
25
0
TNF!"
Controlli
n=10 per gruppo
p=0,752 (ns, test t)
IED
*
200
150
100
50
0
Controlli
IED
n=8 Controlli; n=7 IED
*p=0,0139 (test t)
Figura 9.16 Effetto della manipolazione dietetica dello stato di ferro sull’espressione genica
ipotalamica di citochine pro-infiammatorie. Analisi RT-qPCR dei livelli di mRNA di IL-6 (pannello A)
e TNFα (pannello B) in ipotalami interi di topi controllo (barre nere) e IED (barre bianche) dopo 9 e
16 settimane di trattamento. I 2 diversi periodi di trattamento sono stati riuniti in un solo gruppo
rispettivamente per i topi controllo (barre nere) e IED (barre bianche) poiché caratterizzati dal
medesimo andamento. I livelli di ciascun gene di interesse sono normalizzati su quelli della subunità
ribosomiale 18S (gene costitutivo). I dati (media ± SEM) sono espressi come percentuale del
controllo (topi controllo), posto uguale a 100%. Il numero di animali usati in ciascun gruppo e il
valore di p, determinato tramite test t, sono indicati sotto a ciascun grafico. ns: non significativo.
124 9.9.2
GN-11
In assenza di uno stimolo pro-infiammatorio, il fattore trascrizionale NF-kB è
sequestrato nel citoplasma dall’interazione con le proteine inibitorie IkB che,
mascherando il segnale di localizzazione nucleare, impediscono la sua traslocazione
nel nucleo. La fosforilazione e la degradazione della proteina inibitoria IkB sono
necessarie per l’attivazione di NF-kB a cui fa seguito il rilascio e la omo- o
eterodimerizzazione dei cinque membri della famiglia NF-kB. In questo modo, i dimeri
di NF-kB sono in grado di traslocare nel nucleo e stimolare la trascrizione di numerosi
geni tra cui quelli coinvolti nel processo infiammatorio. L’eterodimero tra le subunità
p50 e p65 è quello più frequentemente riscontrato. La fosforilazione di p65 a livello
della serina in posizione 536 (Ser536) è indotta da una serie di stimoli proinfiammatori e favorisce l’aumentata trascrizione dei geni target di NF-kB.
Per verificare che la linea cellulare ipotalamica scelta per tale studio attivasse la via di
IKKβ-NF-κB in risposta a noti stimoli pro-infiammatori, le cellule GN-11 sono state
trattate per 24 ore con TNFα (10 ng/ml) o LPS (1 µg/ml) aggiunti nel medium di
crescita (DMEM 10% FBS). Al termine delle 24 ore, le cellule sono state processate in
modo da separare la frazione proteica citoplasmatica da quella nucleare tramite il kit
NE-PER. Gli estratti proteici del compartimento nucleare e citoplasmatico sono stati
immunoblottati
con
l’anticorpo
anti-pNF-κB
p65
(Ser536)
(p-p65Ser-536),
e
successivamente con l’anticorpo anti-NF-κB p65, entrambi specifici per la subunità
p65 dei dimeri di NF-κB. L’efficienza di separazione della frazione citoplasmatica da
quella nucleare è stata accertata mediante la presenza delle bande corrispondenti alla
tubulina solo nel citoplasma e di quelle specifiche per l’istone H3 esclusivamente nel
nucleo. L’analisi Western Blotting ha mostrato come TNFα, ma non LPS, abbia indotto
la traslocazione della subunità p65 dal citoplasma al nucleo (Figura 9.17). Lo stesso
risultato è stato ottenuto in uno studio condotto sull’analogo maturo delle GN-11, le
cellule neuronali ipotalamiche GT1-7 [367]. Poiché esistono evidenze secondo cui p65
potrebbe traslocare nel nucleo senza promuovere l’attivazione trascrizionale, abbiamo
anche indagato se TNFα inducesse l’attivazione post-trascrizionale di p65 mediante
fosforilazione. L’aumentata presenza nel nucleo della subunità p65 fosforilata a livello
della serina 536 dopo trattamento con TNFα è stata indicativa della capacità di tale
fattore di promuovere sia la traslocazione di p65 dal citoplasma al nucleo che la sua
attivazione (Figura 9.17). Una volta accertato che le cellule GN-11 sono in grado di
rispondere a noti stimoli pro-infiammatori mediante attivazione della via di IKKβ-NFκB, il passo successivo è stato quello di valutare il medesimo processo dopo
trattamento per 24 ore con FAC alla concentrazione di 200 µM nel medium di crescita
125 (DMEM 10% FBS). Come emerge dalla Figura 9.17, l’incubazione con FAC non ha
indotto la traslocazione della subunità p65 nel nucleo e, di conseguenza, non ha
promosso la sua attivazione nucleare mediante fosforilazione su Ser536.
kDa
NFkB
65
pNFkB
65
Istone H3
17
Tubulina
55
FAC 200 !M
24 ore
-
+
-
-
+
-
-
+
-
-
+
-
TNF! 10 ng/ml
24 ore
-
-
+
-
-
+
-
-
-
-
-
-
LPS 1 !g/ml
24 ore
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
+
Citoplasma
Nucleo
Citoplasma
Nucleo
Figura 9.17 Effetto di FAC, TNFα e LPS sulla traslocazione nucleare e sull’attivazione per
fosforilazione di NF-κB nelle cellule GN-11. Le cellule sono state trattate o meno con FAC 200 µM o
con TNFα 10 ng/ml o con LPS 1 µg/ml per 24 ore. La localizzazione subcellulare della subunità p65
di NF-κB e la sua attivazione per fosforilazione (pNF-κB) sono state esaminate mediante Western
Blotting dopo separazione della frazione proteica citoplasmatica da quella nucleare. La qualità della
separazione dei due compartimenti è stata confermata mediante la presenza delle bande specifiche
per la tubulina (55 kDa) solo nella frazione citoplasmatica e di quelle specifiche per l’istone H3 (17
kDa) solo nel nucleo. I blot riportati sono un esempio rappresentativo di 3 esperimenti indipendenti.
L’incapacità del sovraccarico marziale di attivare NF-κB nelle cellule GN-11 è stata
confermata mediante analisi immunocitochimica (immunofluorescenza, IFL) condotta
su cellule intatte. Nelle GN-11 trattate con FAC alla dose di 200 µM per 24 ore nel
consueto medium di crescita (DMEM 10% FBS) (Figura 9.18, B.), l’intesa colorazione
corrispondente all’IFL di NF-κB non presenta una localizzazione prevalentemente
nucleare, bensì è analoga a quella osservabile nelle cellule non trattate (Figura 9.18,
A.). Il medesimo risultato è stato osservato aumentando il dosaggio del ferro a 500
µM (Figura 9.18, C.). Omettendo l’anticorpo primario non si è osservato alcun
segnale (dati non mostrati).
126 A
DAPI
NF-!B
Merge
DAPI
NF-!B
Merge
DAPI
NF-!B
Merge
B
C
Figura 9.18 Analisi immunocitochimica (immunofluorescenza, IFL) della traslocazione nucleare di
NF-κB nelle cellule GN-11. Le cellule sono state trattate (pannelli B e C) o meno (pannello A,
cellule non trattate) con FAC 200 µM (pannello B) o con FAC 500 µM (pannello C) per 24 ore. La
localizzazione subcellulare della subunità p65 di NF‐κB è stata esaminata mediante IFL. In assenza
dell’anticorpo primario non è stato osservato alcun segnale (dato non mostrato).
Nel nostro modello in vitro di sovraccarico di ferro, abbiamo anche indagato i segnali a
valle dipendenti dal signaling di NF-κB e, in particolare, l’espressione dell’mRNA
codificante per IL-6 e TNFα. L’analisi RT-qPCR ha mostrato una tendenza all’aumento
nei livelli di espressione genica di IL-6 dopo incubazione per 24 ore con FAC 200 µM
nel
medium
di
crescita
(DMEM
10%
FBS).
Tale
incremento
si
è
rivelato
statisticamente significativo con una dose di FAC di 500 µM (+175%, p<0,01)
(Figura 9.19, A.). Il trattamento per 24 ore con FAC 200 µM nel terreno di crescita
(DMEM 10% FBS) non ha indotto modificazioni nell’mRNA di TNFα (p=0,497) (Figura
9.19, B.).
127 GN-11
A
IL-6
**
350
300
250
200
150
100
50
150
100
50
0
0
FAC [!M]
TNF!"
200
mRNA TNF!/rRNA 18S
(% del controllo)
mRNA IL-6/rRNA 18S
(% del controllo)
B
-
200
500
24 ore
n=6 per gruppo
**p<0,01 vs Controllo (ANOVA)
FAC [!M]
-
200
24 ore
n=3 per gruppo
p=0,497 (ns, test t)
Figura 9.19
Effetto del sovraccarico marziale sull’espressione genica delle citochine proinfiammatorie nelle cellule GN-11. I livelli di mRNA di IL-6 (pannello A) e TNFα (pannello B) sono
stati determinati mediante RT-qPCR dopo trattamento (barre bianche) o meno (barre nere) delle
cellule GN-11 con FAC alle dosi di 200 µM (per entrambe le citochine) o 500 µM (solo per IL-6) per
24 ore. I livelli di ciascun gene d’interesse sono normalizzati su quelli della subunità ribosomiale 18S
(gene costitutivo). I dati (media ± SEM) sono espressi come percentuale del controllo (cellule non
trattate), posto uguale a 100%. Il numero di campioni per ciascun trattamento e il valore di p,
determinato tramite ANOVA (per IL-6) o test t (per TNFα), sono indicati sotto a ciascun grafico.
9.10 EFFETTO DELLA MANIPOLAZIONE DELLO STATO DEL FERRO
SULLO STRESS OSSIDATIVO E DEL RETICOLO ENDOPLASMATICO IN
VIVO E NELLE CELLULE GN-11
Come ampiamente documentato dalla letteratura, il ferro è un metallo di transizione
in grado di promuovere la generazione dei ROS (Specie Reattive dell’Ossigeno) che
reagiscono con lipidi e proteine inducendo danno tissutale.
Abbiamo quindi voluto indagare se il sovraccarico marziale inducesse stress ossidativo
e/o del reticolo endoplasmatico (RE). Il primo è valutabile mediante incremento
dell’espressione genica di SOD2 (Superossido Dismutasi 2), un enzima della matrice
mitocondriale interna deputato alla neutralizzazione del radicale superossido (prodotto
durante la fosforilazione ossidativa nel mitocondrio) mediante sua conversione a
perossido d’idrogeno [376]. Il secondo tipo di stress, derivante dall’accumulo e
128 dall’aggregazione di proteine non ripiegate (misfolded) o mal ripiegate (unfolded) nel
lume del RE, scatena une serie di processi cellulari denominati collettivamente come
“risposta delle proteine mal ripiegate” (unfolded protein response, UPR) [377]. La fase
iniziale dell’UPR, in cui la cellula attiva meccanismi atti a ripristinare la capacità del RE
di ripiegare le proteine (segnali di sopravvivenza cellulare), è identificabile sia
mediante aumento dell’mRNA di XBP-1 (X-box binding protein-1) che tramite
incremento dello splicing endoribonucleasico di 26 nucleotidi intronici dall’mRNA di
XBP-1 ad opera di IRE1 (Inositol Requiring Enzyme 1) [378]. La variante di splicing
generata (sXBP-1) trasloca nel nucleo dove determina la trascrizione di geni
indispensabili per il ripristino dell’omeostasi del RE, quali le proteine chaperones
[379]. Una condizione persistente di stress del RE, in cui l’UPR promuove l’attivazione
di segnali pro-apoptotici, è ricavabile dall’aumentata trascrizione genica di CHOP
(CAAT/enhancer binding protein (C/EBP) homologous protein), il principale fattore di
trascrizione che promuove la morte cellulare per apoptosi [380].
9.10.1
Ipotalamo
I primi studi condotti sul nostro modello murino di sovraccarico dietetico di ferro
hanno evidenziato la capacità di tale metallo di accumularsi nel fegato e nel VAT
promuovendo stress ossidativo e del RE (dati non mostrati) [1].
Abbiamo quindi indagato se anche l’ipotalamo potesse essere soggetto a tali
perturbazioni da parte della IED. Mediante analisi RT-qPCR non è stata osservata
alcuna variazione nell’espressione genica di SOD2 (p=0,0947) tra topi IED e controllo,
il che denota la mancata induzione di stress ossidativo a livello centrale dopo 9 e 16
settimane di IED (i 2 diversi periodi di trattamento sono stati riuniti in un solo gruppo
rispettivamente
per
i
topi
controllo
e
IED
poiché
caratterizzati
dallo
stesso
andamento) (Figura 9.20, A.). Al contrario, la dieta IED ha aumentato in modo
significativo i livelli di mRNA di CHOP (+31%, p=0,0383), senza però modificare lo
splicing alternativo dell’mRNA di XBP-1 (Figura 9.20, B. C.), indicando la capacità
del ferro di promuovere stress del RE e, più specificamente, di attivare segnali proapoptotici nell’ipotalamo.
129 IPOTALAMO
SOD2
A
150
mRNA CHOP/rRNA 18S
(% del controllo)
125
mRNA SOD2/rRNA 18S
(% del controllo)
CHOP
B
100
75
50
25
0
Controlli
125
100
75
50
25
0
IED
n=11 Controlli, n=15 IED
p=0,0947 (ns, test t)
C
*
Controlli
IED
n=4 Controlli, n=5 IED
*p=0,0383 (test t)
XBP-1
350 bp
300 bp
IED
Controlli
Figura 9.20 Effetto della dieta IED sui segnali di stress ossidativo (SOD2) e del RE (CHOP e XBP-
1) in ipotalami interi. Analisi RT-qPCR dell’espressione genica di SOD2 (pannello A) e di CHOP
(pannello B) in ipotalami interi di topi controllo (barre nere) e IED (barre bianche) dopo 9 e 16
settimane di trattamento. I 2 diversi periodi di trattamento sono stati riuniti in un solo gruppo
rispettivamente per i topi controllo e IED poiché caratterizzati dal medesimo andamento. I livelli di
ciascun gene di interesse sono normalizzati su quelli della subunità ribosomiale 18S (gene
costitutivo). I dati (media ± SEM) sono espressi come percentuale del controllo (topi controllo),
posto uguale a 100%. Il numero di animali usati in ciascun gruppo e il valore di p, determinato
tramite test t, sono indicati sotto a ciascun grafico. ns: non significativo. Il pannello C rappresenta
l’analisi RT-PCR dello splicing dell’mRNA di XBP-1. La separazione elettroforetica è stata condotta su
gel d’agarosio al 4%: una banda a 326 bp rappresenta la forma priva di splicing mentre la banda a
300 bp è la forma che ha subito splicing. L’immagine della corsa elettroforetica è un esempio
rappresentativo di 3 esperimenti indipendenti.
9.10.2
GN-11
Le condizioni sperimentali impiegate per indurre sovraccarico marziale hanno
comportato un incremento dose-dipendente dello stress ossidativo, come indicato
dall’aumentata
espressione
genica
di
SOD2
dopo
incubazione
con
FAC
alle
concentrazioni di 200 µM (+51%, p<0,05) e 500 µM (+89%, p<0,01) per 24 ore nel
medium di crescita (Figura 9.21, A).
130 Il
medesimo
trattamento
non
ha
mostrato
alcuna
variazione
nell’espressione
dell’mRNA di CHOP e nell’entità di splicing alternativo dell’mRNA di XBP-1 (Figura
9.21, B. C.). Tale effetto neutrale denota l’incapacità di FAC, alle dosi da noi utilizzate
di 200 – 500 µM per 24 ore, di generare uno stato di stress a livello del RE e quindi di
attivare l’UPR.
GN-11
A
SOD2
B
120
**
200
*
150
100
50
mRNA CHOP/rRNA 18S
(% del controllo)
mRNA SOD2/rRNA 18S
(% del controllo)
250
0
FAC [!M]
CHOP
100
80
60
40
20
0
-
200
500
FAC [!M]
24 ore
-
200
500
24 ore
n=6 per gruppo
*p<0,05, **p<0,01 (ANOVA)
C
n=6 per gruppo
p>0,05 (ns, ANOVA)
XBP-1
350 bp
300 bp
FAC [!M]
24 ore
-
200
500
Figura 9.21
Effetto dell’aumento della concentrazione di ferro nel medium delle GN-11 sui
marker di stress ossidativo (SOD2) e del reticolo endoplasmatico (CHOP e XBP-1).
Analisi RT-qPCR dell’espressione genica di SOD2 (pannello A) e CHOP (pannello B) nelle cellule
GN-11 dopo trattamento (barre bianche) o meno (barre nere) con FAC alle dosi di 200 e 500 µM per
24 ore. I livelli di ciascun gene di interesse sono normalizzati su quelli della subunità ribosomiale
18S (gene costitutivo). I dati (media ± SEM) sono espressi come percentuale del controllo (cellule
non trattate), posto uguale a 100%. Il numero di campioni per ciascun trattamento e il valore di p,
ottenuto tramite ANOVA, sono indicati sotto a ciascun grafico. ns: non significativo. Il pannello C
rappresenta l’analisi RT-PCR dello splicing dell’mRNA di XBP-1. La separazione elettroforetica è stata
condotta su gel d’agarosio al 4%: una banda a 326 bp rappresenta la forma priva di splicing mentre
la banda a 300 bp è la forma che ha subito splicing. L’immagine della corsa elettroforetica è un
esempio rappresentativo di 3 esperimenti indipendenti.
131 9.11 EFFETTO DEL SOVRACCARICO MARZIALE SUI MECCANISMI
NEUROENDOCRINI
COINVOLTI
NEL
CONTROLLO
DELLA
RIPRODUZIONE E DEL COMPORTAMENTO ALIMENTARE
Il sovraccarico cronico di ferro potrebbe comportare un accumulo di tale metallo nella
porzione
ipotalamo–ipofisaria
alterazione
della
funzionalità
dell’asse
dei
riproduttivo,
neuroni
GnRH
con
conseguente
(Ormone
di
danno
Rilascio
o
delle
Gonadotropine) e/o delle cellule gonadotrope. Tale deposito selettivo di ferro potrebbe
contribuire all’insorgenza d’ipogonadismo ipogonadotropo (HH) [381], una delle
endocrinopatie più frequentemente riscontrate in pazienti con talassemia e con
emocromatosi ereditaria [328, 342, 382]. Dalla letteratura emergono poche evidenze
in merito al rapporto di causalità primaria ed esclusiva tra una disfunzione ipotalamica
indotta dall’eccesso di ferro e l’ipogonadismo [344, 345]. Per tale ragione abbiamo
voluto indagare l’eventuale presenza di un’alterazione ipotalamica a livello del sistema
Kiss1-GPR54 (Recettore Accoppiato a Proteina G 54) e dei neuroni GnRH nel nostro
modello murino di sovraccarico alimentare di ferro.
9.11.1
Ipotalamo
L’analisi mediante RT-qPCR dell’RNA estratto da ipotalami interi ha evidenziato un
aumento significativo (+34%; p=0,0096) dei livelli di mRNA del GnRH dopo dieta IED
per 9, 11 e 16 settimane (i 3 diversi periodi di trattamento sono stati riuniti in un solo
gruppo rispettivamente per i topi controllo e IED poiché caratterizzati dal medesimo
andamento) (Figura 9.22, A.).
La kisspeptina, peptide prodotto dal gene Kiss-1, e il suo recettore GPR54 sono dei
componenti chiave nella regolazione neuroendocrina della riproduzione in quanto
promuovono l’attivazione della secrezione del GnRH. Tale ruolo cruciale del signaling
Kiss1/GPR54 è stato avvalorato dalla recente (2003) identificazione di delezioni o
mutazioni inattivanti nel gene GPR54 in pazienti affetti da forme familiari o sporadiche
di ipogonadismo ipogonadotropo idiopatico (o isolato) (IHH) [120, 121]. Nel nostro
modello murino di sovraccarico alimentare di ferro, non è stata osservata alcuna
variazione nell’espressione genica di Kiss1 (p=0,542) e GPR54 (p=0,768) analizzata
mediante RT-qPCR su ipotalami interi (Figura 9.22, B. C.).
132 IPOTALAMO
A
GnRH
mRNA GnRH/rRNA 18S
(% del controllo)
150
**
100
50
0
Controlli
IED
n=11 per gruppo
**p=0,0096 (test t)
B
Kiss1
C
120
mRNA GPR54/rRNA 18S
(% del controllo)
mRNA Kiss-1/rRNA 18S
(% del controllo)
125
100
75
50
25
0
GPR54
100
80
60
40
20
0
Controlli
n=12 Controlli, n=13 IED
p=0,542 (ns, test t)
IED
Controlli
IED
n=12 per gruppo
p=0,768 (ns, test t)
Figura 9.22 Valutazione della perturbazione della componente ipotalamica dell’asse riproduttivo e
dei suoi principali stimolatori da parte del sovraccarico alimentare di ferro. L’espressione genica
ipotalamica di GnRH (pannello A), Kiss-1 (pannello B) e GPR54 (pannello C) è stata determinata
mediante RT-qPCR in ipotalami interi di topi controllo (barre nere) e IED (barre bianche) dopo 9, 11
e 16 settimane di trattamento. I 3 diversi periodi di trattamento sono stati riuniti in un solo gruppo
rispettivamente per i topi controllo e IED poiché caratterizzati dal medesimo andamento. I livelli di
ciascun gene di interesse sono normalizzati su quelli della subunità ribosomiale 18S (gene
costitutivo). I dati (media ± SEM) sono espressi come percentuale del controllo (topi controllo),
posto uguale a 100%. Il numero di animali usati in ciascun gruppo e i valori di p, ottenuti tramite
test t, sono indicati sotto a ciascun grafico. ns: non significativo.
133 L’iniziale caratterizzazione periferica del nostro modello animale aveva evidenziato
come la dieta IED comportasse un ridotto incremento ponderale (Figura 9.2), una
diminuita massa di VAT, stimata dal minor peso di grasso perigonadico (controlli: 0,56
± 0,08 g; IED: 0,13 ± 0.04 g; p<0,0001), [1] e un calo dei livelli sierici di leptina
(controlli: 5,4 ± 3 ng/mL; IED: 2,4 ± 2 ng/mL; p=0,033) [1] (Figura 9.23, A. B.).
GRASSO PERIGONADICO
A
6.0
Leptina sierica (ng/mL)
0.6
0.5
0.4
Peso (g)
LEPTINA SIERICA
B
0.3
0.2
****
0.1
0
Controlli
5.0
4.0
2.0
1.0
0
IED
n=15 per gruppo
****p<0,0001 (test t)
*
3.0
Controlli
IED
n=15 per gruppo
*p=0,033 (test t)
Figura 9.23 Variazione di peso (g) del grasso perigonadico (pannello A) e dei livelli di leptina
sierica (ng/mL) (pannello B) in topi controllo (barre nere) e IED (barre bianche) dopo 16 settimane
di trattamento [1]. Il numero di animali utilizzati e il valore di p, determinato mediante test t, sono
indicati sotto a ciascun grafico.
Alla luce di tali risultati, unitamente alla presenza di un fenotipo dismetabolico e di
una condizione di IR che insorge primariamente a livello del VAT [1], è parso utile
anche valutare l’espressione genica ipotalamica del Neuropeptide Y (NPY) e della
Proopiomelanocortina
(POMC),
peptidi
bifunzionali
preposti
al
controllo
del
metabolismo energetico, dell’appetito e della funzionalità riproduttiva. Come atteso, la
dieta IED ha aumentato i livelli di espressione genica ipotalamica di NPY (+ 158%,
p=0,046) e, al contrario, ha ridotto, seppur in modo non significativo, quelli di POMC
(-52%, p=0,247), il che è indicativo dell’attivazione di uno stato oressigenico
nell’ipotalamo (Figura 9.24, A. B.).
134 IPOTALAMO
NPY
A
300
250
200
150
100
50
0
150
*
mRNA POMC/rRNA 18S
(% del controllo)
mRNA NPY/rRNA 18S
(% del controllo)
350
Controlli
n=4 per gruppo
*p=0.046 (test t)
POMC
B
IED
100
50
0
Controlli
IED
n=4 per gruppo
p=0,247 (ns, test t)
Figura 9.24 Effetto della manipolazione alimentare dello stato di ferro sulla sintesi ipotalamica dei
neuropeptidi preposti alla regolazione del metabolismo energetico e della funzione riproduttiva.
L’espressione genica di NPY (pannello A) e POMC (pannello B) in ipotalami interi di topi controllo
(barre nere) e IED (barre bianche) è stata condotta tramite RT-qPCR dopo 16 settimane di
trattamento. I livelli di ciascun gene di interesse sono normalizzati su quelli della subunità
ribosomiale 18S (gene costitutivo). I dati (media ± SEM) sono espressi come percentuale del
controllo (topi controllo), posto uguale a 100%. Il numero di animali usati in ciascun gruppo e il
valore di p, ottenuto tramite test t, sono indicati sotto a ciascun grafico. ns: non significativo.
9.11.2
GN-11 e GT1-7
Sebbene le cellule GN-11 siano rappresentative di neuroni GnRH immaturi, esistono
evidenze in letteratura in merito al loro utilizzo per studi di espressione genica e
secrezione dell’ormone decapeptidico. La quota di GnRH secreto dalle GN-11 è
ovviamente molto più bassa rispetto a quella osservata nelle GT1-7 [383, 384].
Per confermare i risultati ottenuti in vivo in merito all’espressione genica del GnRH, la
stessa analisi è stata quindi condotta su entrambi i nostri modelli traslazionali in vitro
di neuroni GnRH. Nel dettaglio, le linee cellulari sono state incubate con FAC per 24
ore e l’RNA totale estratto è stato sottoposto a reazione di trascrizione inversa e,
successivamente, ad amplificazione del c-DNA ottenuto.
Nessuna variazione nei livelli dell’mRNA del GnRH è stata osservata nelle cellule GN11 dopo trattamento con FAC (200 µM) per 24 ore, neppure aumentando la dose a
500 µM (Figura 9.25, A.).
135 L’applicazione di FAC 200 µM al medium delle GT1-7 per 24 ore ha portato invece ad
un aumento, seppur non significativo, dell’espressione genica del GnRH (+37,6%,
p=0,206) (Figura 9.25, B.).
GnRH
A
GN-11
B
175
mRNA GnRH/rRNA 18S
(% del controllo)
mRNA GnRH/rRNA 18S
(% del controllo)
120
150
100
125
80
100
60
40
20
0
FAC [!M]
GT1-7
75
50
25
0
-
200
500
FAC [!M]
-
24 ore
n=6 per gruppo
p>0,05 (ns, ANOVA)
200
24 ore
n=6 per gruppo
p=0,206 (ns, test t)
Figura 9.25
Analisi RT-qPCR dell’espressione genica del GnRH nelle cellule GN-11 (pannello A) e
GT1-7 (pannello B) dopo trattamento (barre bianche) o meno (barre nere) per 24 ore con FAC alle
dosi di 200 µM in entrambe le linee cellulari e 500 µM solo nelle GN-11. I livelli di ciascun gene di
interesse sono normalizzati su quelli della subunità ribosomiale 18S (gene costitutivo). I dati (media
± SEM) sono espressi come percentuale del controllo (cellule non trattate), posto uguale a 100%. Il
numero di campioni per ciascun trattamento e il valore di p, calcolato tramite test ANOVA (per le
GN-11) e il test t (per le GT1-7) sono indicati sotto a ciascun grafico.
9.11.3
Ipofisi
Per indagare se le nostre condizioni sperimentali fossero in grado di compromettere
l’asse riproduttivo a livello dell’ipofisi, abbiamo valutato l’espressione genica ipofisaria
delle subunità β degli ormoni follicolo-stimolante (FSH) e luteinizzante (LH). A
differenza della α, che è comune alle due gonadotropine, la subunità β è quella che le
contraddistingue. Il sovraccarico dietetico di ferro per un periodo di 9 e 11 settimane
non ha indotto variazioni nei livelli del trascritto dell’FSH (p=0,745), gonadotropina
notoriamente meno responsiva dell’LH alla pulsatilità del GnRH (Figura 9.26, A.). Si
è invece osservata una tendenza alla riduzione, seppur non significativa (p=0,156),
nell’espressione genica dell’LH in risposta al carico marziale (Figura 9.26, B.). I 2
136 diversi periodi di trattamento sono stati riuniti in un solo gruppo rispettivamente per i
topi controllo e IED poiché caratterizzati dal medesimo andamento.
IPOFISI
FSH!
B
LH!
140
120
120
100
mRNA LH!/rRNA 18S
(% del controllo)
mRNA FSH!/rRNA 18S
(% del controllo)
A
100
80
60
40
20
0
Controlli
n=16 controlli, n=17 IED
p=0,745 (ns, test t)
IED
80
60
40
20
0
Controlli
IED
n=16 controlli, n=17 IED
p=0,156 (ns, test t)
Figura 9.26 Valutazione della perturbazione della componente ipofisaria dell’asse riproduttivo da
parte del sovraccarico alimentare di ferro. I livelli di mRNA di FSHβ (pannello A) e LHβ (pannello
B) in ipofisi di topi controllo (barre nere) e IED (barre bianche) dopo 9 e 11 settimane di
trattamento sono stati analizzati tramite RT-qPCR. I 2 diversi periodi di trattamento sono stati riuniti
in un solo gruppo rispettivamente per i topi controllo e IED poiché caratterizzati dal medesimo
andamento. I livelli di ciascun gene di interesse sono normalizzati su quelli della subunità
ribosomiale 18S (gene costitutivo). I dati (media ± SEM) sono espressi come percentuale del
controllo (topi controllo), posto uguale a 100%. Il numero di animali usati in ciascun gruppo e il
valore di p, ottenuto tramite test t, sono indicati sotto a ciascun grafico. ns: non significativo.
9.12 EFFETTO DEL SOVRACCARICO DIETETICO DI FERRO SULLA
MODULAZIONE DEL SIGNALING NELL’IPOTALAMO
L’analisi delle vie intracellulari di trasduzione del segnale è stata condotta mediante
Western Blotting sull’estratto proteico totale di ipotalami interi dopo 9, 11 e 16
settimane di IED. Poiché si sono ottenuti risultati sovrapponibili nei 3 diversi periodi di
trattamento, si è deciso di unirli in un unico gruppo rispettivamente per i topi controllo
e IED. È necessario tener presente che i risultati ottenuti sono un insieme dei
contributi dei vari nuclei ipotalamici e delle diverse popolazioni, neuronali o meno, che
coesistono a livello ipotalamico. Indagini future verteranno sull’analisi del signaling di
137 specifici nuclei ipotalamici isolati mediante tecniche specifiche quali la “Laser capture
microdissection”.
La IED non ha influenzato la via di ERK1/2 (p=0,351) (Figura 9.27, A.).
kDa
A
44
pERK
42
44
ERK
42
Controlli
IED
OD pERK/ERK
(% del controllo)
125
100
75
50
25
0
Controlli
IED
n=8 controlli; n=9 IED
p=0,351 (ns, test t)
Si è invece registrato un aumento significativo del rapporto pAkt/Akt (+18%,
p=0,0472), contrariamente a quanto osservato nel VAT (Figura 9.27, B.).
B
kDa
pAkt
60
Akt
60
Controlli
IED
*
OD pAkt/Akt
(% del controllo)
125
100
75
50
25
0
Controlli
IED
n=12 controlli; n=13 IED
*p=0,0472 (test t)
138 Anche la via di trasduzione del segnale di AMPK è attivata dalla IED (+25%,
p=0,0241) a differenza di quanto avviene nel fegato (Figura 9.27, C.).
C
kDa
pAMPK
62
AMPK
62
Controlli
IED
150
*
OD pAMPK/AMPK
(% del controllo)
125
100
75
50
25
0
Controlli
IED
n=12 controlli; n=13 IED
*p=0,0241 (test t)
Figura 9.27 Effetto del sovraccarico dietetico di ferro di 9, 11 e 16 settimane sulla fosforilazione
(p) di ERK1/2 (pannello A), Akt (pannello B) e AMPK (pannello C) in ipotalami interi. 20 µg di
estratto proteico di ciascun campione sono stati analizzati mediante Western Blotting. L’analisi
densitometrica è relativa a 3 esperimenti indipendenti di cui è mostrato un blot rappresentativo. I
dati (media ± SEM) sono espressi come percentuale del controllo (cellule non trattate, barre nere)
posto uguale a 100%. Il numero di animali utilizzati e i valori di p, ottenuti tramite test t, sono
indicati sotto a ciascun grafico. I livelli di pERK1/2 (pannello A), pAkt (pannello B) e di pAMPK
(pannello C) sono stati normalizzati, rispettivamente, su quelli di ERK1/2, Akt e AMPK.
139 10. DISCUSSIONE
ASSOCIAZIONE TRA SOVRACCARICO MARZIALE, FENOTIPO DISMETABOLICO
E ALTERAZIONE DELLA FUNZIONE RIPRODUTTIVA
Evidenze epidemiologiche nell’uomo e studi sperimentali in modelli animali e in vitro
hanno evidenziato una chiara associazione tra aumento dei depositi tissutali di ferro di
origine dietetica e sviluppo di un fenotipo dismetabolico in termini di intolleranza al
glucosio, insulino-resistenza (IR), sindrome metabolica (MetS) e diabete mellito di
tipo 2 (T2D) [385, 386, 387]. L’insieme di tali condizioni è riassunto nella sindrome
dismetabolica da sovraccarico di ferro (DIOS – “Dysmetabolic Iron Overload
Syndrome”) recentemente caratterizzata a livello periferico e metabolico dal nostro
gruppo di lavoro [1]. Il ruolo causale del ferro in tali alterazioni metaboliche è
dimostrato dall’effetto benefico della deplezione di ferro sulla sensibilità all’insulina e
sulla glicemia [385, 387, 388].
Nel 2004 è stata descritta la prima correlazione tra T2D e concentrazioni subnormali
di testosterone libero in associazione a livelli bassi di ormone luteinizzante (LH) e
follicolo-stimolante (FSH) derivanti probabilmente da una disfunzione ipotalamica,
come suggerito dalla risposta normale di LH e FSH all’ormone di rilascio delle
gonadotropine (GnRH) e dall’analisi MRI (Magnetic Resonance Imaging) [335]. Tale
associazione tra ipogonadismo ipogonadotropo (HH) e fenotipo dismetabolico è stata
poi confermata in diversi studi condotti su uomini affetti da T2D (prevalenza del 2540%) e MetS [336‐341]. La parallela compromissione dell’omeostasi metabolica e
della funzionalità riproduttiva denota il contemporaneo coinvolgimento di diverse
componenti molecolari e funzionali nel controllo della sfera metabolica e riproduttiva
[2]. Anche in pazienti affetti da emocromatosi ereditaria (prevalenza del 10-100%) o
da sovraccarico di ferro trasfusionale (nella talassemia maggiore supera il 50% in
studi
multicentrici)
l’ipogonadismo,
prevalentemente
ipogonadotropo,
è
l’endocrinopatia più frequentemente riscontrata, oltre al T2D. Per entrambe le
suddette patologie, è stato ampiamente descritto un deposito tossico dell’eccesso di
ferro nelle cellule gonadotrope ipofisarie con conseguente riduzione del loro volume,
della loro funzionalità ed insorgenza di HH (ipogonadismo secondario) [328, 342, 389].
Esistono evidenze in letteratura, seppur minoritarie e non ben definite, di un possibile
ruolo causale dell’ipotalamo, esclusivo o combinato con l’ipofisi, nell’alterazione
dell’asse riproduttivo (ipogonadismo terziario) [343‐345]. La compromissione dell’asse
ipotalamo-ipofisi
è
proporzionale
all’entità
di
sovraccarico
marziale:
elevata
140 iperferritinemia e disfunzione d’organo multipla comportano un difetto più completo
(HH irreversibile); livelli intermedi di ferritina consentono la reversibilità della
sintomatologia dopo deplezione dell’eccesso di ferro mediante flebotomia o intensa
chelazione [382, 390]. Per tale ragione, è recentemente emersa la necessità di
accertare l’eventuale deposizione ipofisaria di ferro il più precocemente possibile. Fino
ad oggi è stato pubblicato solo un lavoro in merito alla prevalenza e alla natura della
disfunzione gonadica in uomini affetti da DIOS [317]. Da tale studio è emerso come
l’accumulo epatico di ferro (HIC, “Hepatic Iron Concentration”), meno consistente
rispetto a quello caratteristico dell’emocromatosi ereditaria, e la ferritinemia siano
associati positivamente ai livelli plasmatici delle globuline leganti gli ormoni sessuali
(SHBG, “Sex Hormone-Binding Globulin”) e negativamente alla concentrazione di LH e
di testosterone biodisponibile (non legato a SHBG). La ridotta funzione gonadotropa
indotta dal ferro in tali pazienti è indipendente dal quadro dismetabolico in termini di
iper-insulinemia a digiuno, IR, elevato BMI (“Body Mass Index”) o circonferenza
dell’addome. Il mancato ripristino delle normali concentrazioni ormonali dopo
deplezione di ferro per flebotomia è indicativo dell’elevata suscettibilità dell’ipofisi al
danno permanente o della necessità di tempi più lunghi per ripristinare una normale
funzionalità riproduttiva [317].
ASPETTI INNOVATIVI E MODELLI SPERIMENTALI
Questo lavoro di tesi, focalizzato sulla disfunzione dell’asse gonadico indotta
dall’eccesso
di
ferro
dietetico,
nasce
come
estensione
sperimentale
della
caratterizzazione periferica e metabolica del nostro modello murino di DIOS [1]. Nello
specifico, topi maschi C57BL/6J di 6 settimane sono stati sottoposti ad una dieta
controllo a normale contenuto di ferro o a una dieta arricchita con il 3% di ferro
carbonile (IED, “Iron Enriched Diet”) per 9 o 11 settimane. L’aspetto innovativo di tale
studio risiede nel tentativo di apportare nuove evidenze in merito al controverso
coinvolgimento
primario
ed
esclusivo
dell’ipotalamo
nell’alterazione
dell’asse
riproduttivo indotta dal ferro. Inoltre, gli studi riportati in letteratura in merito ai
processi neurodegenerativi ferro-dipendenti sono principalmente incentrati sull’analisi
dell’accumulo marziale in tutto il cervello e non selettivamente nell’ipotalamo. Poiché
quest’ultimo nell’uomo è esplorabile solo per via indiretta, ci siamo avvalsi del modello
traslazionale in vivo già caratterizzato dal punto di vista metabolico [1] e, come
ulteriore lente di ingrandimento del fenomeno, di due modelli in vitro di neuroni GnRH
immortalizzati: le GN-11, rappresentative di neuroni immaturi e migratori e le GT1-7,
l’analogo maturo, post-migratorio e GnRH secernente. Tale studio è inoltre il primo ad
141 indagare se e come l’esposizione a dosi eccessive di ferro in età pre-natale possa
compromettere il fisiologico processo migratorio dei neuroni GnRH dal placode
olfattorio all’ipotalamo e quali vie di segnale possano essere coinvolte in tale
perturbazione.
CONSIDERAZIONI PRELIMINARI SULLO STUDIO DELLA FISIOPATOLOGIA
DEL FERRO NEL CERVELLO
Lo studio della fisiopatologia del ferro nel sistema nervoso centrale (SNC) ha suscitato
un crescente interesse poiché l’accumulo anomalo di ferro nel cervello è stato
associato a varie patologie neurodegenerative [217]. L’indagine degli effetti delle
perturbazioni marziali nel SNC rende necessario effettuare alcune considerazioni
preliminari:
1. Il libero passaggio del ferro dalla circolazione sistemica al cervello è strettamente
regolato dalla barriera emato-encefalica (BEE) e dalla barriera emato-liquorale
(BEL) [208]. Tuttavia, è stato dimostrato che elevati livelli sistemici di ferro
aumentano il contenuto marziale in specifiche regioni cerebrali sia nei roditori
[267] che nell’uomo [271].
2. Alcune aree cerebrali, definite organi circumventricolari (CVO), sono prive di BEE e
contengono corpi cellulari con libero accesso alle sostanze circolanti. In tale
categoria rientra l’eminenza mediana dell’ipotalamo mediobasale [391]. Anche i
vasi della porzione ventromediale del nucleo arcuato (ARC), in prossimità dei
neuroni preposti alla regolazione dell’assunzione di cibo e del peso corporeo,
sarebbero privi di una BEE intatta [392].
3. Il cervello è un organo eterogeneo che comprende diverse regioni anatomiche e
tipi cellulari (neuroni, astrociti, oligodendrociti e microglia) ciascuno con le proprie
caratteristiche metaboliche e architettoniche [207] e quindi con il proprio specifico
contenuto e utilizzo di ferro [393].
CARATTERIZZAZIONE DI UN MODELLO ANIMALE ADULTO DI SOVRACCARICO
DIETETICO DI FERRO:
•
Alterazione del fenotipo metabolico [1]
Studi precedentemente condotti dal nostro gruppo di lavoro [1] hanno evidenziato
come la dieta IED influenzi negativamente il metabolismo glucidico (iperglicemia a
digiuno, insulino-resistenza) e lipidico (ipertrigliceridemia a digiuno) in seguito a
compromissione, rispettivamente, del tessuto adiposo viscerale (VAT) e del fegato. In
142 particolare, l’accumulo di ferro nel VAT ha ridotto la massa e la dimensione
adipocitaria, ha compromesso l’attivazione del signaling insulinico (aumento di
resistina, induzione di Socs3, “Suppressor of Cytokine Signaling 3”, e riduzione del
rapporto pAkt/Akt) e ha indotto uno stato di stress ossidativo e del reticolo
endoplasmatico [1].
•
Alterazione della funzione riproduttiva: parametri morfometrici
La prima evidenza macroscopica della compromissione della funzionalità riproduttiva
da parte della dieta IED è stata l’osservazione di una riduzione significativa del peso e
delle dimensioni testicolari. Abbiamo quindi voluto indagare se tale atrofia gonadica
fosse correlata a perturbazioni a livello molecolare nelle sedi anatomiche dell’asse
HPG (ipotalamo, ipofisi o gonadi) con particolare attenzione all’ipotalamo.
•
Metabolismo marziale periferico e centrale
Da nostri precedenti studi [1] era emerso come le condizioni sperimentali da noi
utilizzate aumentassero la sideremia, il contenuto di ferro intraepatico (HIC) e i livelli
sierici ed epatici di epcidina (ormone che inibisce l’assorbimento e il reciclaggio
marziale mediante il legame e l’inattivazione della ferroportina [394]) fino a valori
paragonabili a quelli riscontrabili clinicamente in pazienti affetti da DIOS [1, 349].
Anche i testicoli hanno manifestato un aumento sostanziale del loro contenuto di ferro
totale, sebbene l’entità di tale deposito sia inferiore rispetto a quella epatica e del VAT
[1]. Alla luce di dati recentemente pubblicati [395], possiamo ipotizzare che la
maggior parte del ferro captato dai testicoli sia confinato nello spazio interstiziale,
sede delle cellule steroidogenetiche o del Leydig.
Nonostante l’elevato sovraccarico marziale periferico indotto dalla IED, non è stato
registrato un aumento nella quantità di ferro totale nell’ipotalamo. Possiamo quindi
ipotizzare che nel nostro modello animale di manipolazione alimentare dello stato di
ferro, l’ipotalamo sia protetto dall’aumento di ferro sistemico probabilmente grazie
alla rigida regolazione della BEE o della BEL o mediante altri meccanismi. Sarebbe
quindi interessante dosare l’effettivo contenuto marziale nelle regioni notoriamente
prive di una BEE intatta, in particolare, il nucleo ARC e l’eminenza mediana.
Analogamente a studi riportati in letteratura [272, 372, 396], condotti su cervello
intero, non sono stati registrati cambiamenti sostanziali nei livelli dei trascritti
ipotalamici per il recettore della transferrina (TfR, il principale recettore per il
complesso circolante transferrina – ferro) e per la ferritina H (FtH - la principale
proteina di deposito intracellulare del ferro) in risposta agli elevati depositi di ferro
143 sistemico. Anche nei testicoli, l’analisi RT-qPCR non ha mostrato una modulazione
ferro-dipendente di TfR, FtH ed epcidina. La mancata risposta testicolare al
sovraccarico marziale è probabilmente ascrivibile al ridotto accumulo di ferro in tale
distretto.
•
Modulazione dell’espressione genica nell’ipotalamo
I risultati ottenuti a livello ipotalamico nel nostro studio rispecchiano quanto osservato
da Johnstone e Milward in una simile serie di esperimenti [372]. Secondo tali
ricercatori, l’assenza di variazioni significative nell’accumulo cerebrale di ferro e nei
livelli delle proteine preposte alla regolazione dell’omeostasi marziale non esclude la
possibilità che il sovraccarico di ferro sistemico possa comunque indurre cambiamenti
nell’espressione ipotalamica di altri geni. L’eccesso marziale sistemico potrebbe
modulare indirettamente alcune funzioni ipotalamiche mediante l’attivazione di fattori
periferici che invierebbero segnali all’ipotalamo [372]. Tali considerazioni sono state
dimostrate in tre diversi modelli animali, ratti sottoposti a dieta arricchita in ferro
[397], topi Hfe
-/-
[271] e topi knockout per Irp2 [398, 399], in cui si sono osservate
anormalità comportamentali o motorie senza un apparente aumento nei livelli marziali
cerebrali. Anche nel nostro modello animale di manipolazione alimentare dello stato di
ferro, l’analisi RT-qPCR ha mostrato delle variazioni significative nell’espressione
ipotalamica di geni correlati a specifiche “pathways” o funzioni biologicamente
rilevanti e in cui è riconosciuto il coinvolgimento del ferro.
•
Funzione riproduttiva: basi molecolari della perturbazione ipotalamoipofisaria
Innanzitutto, la nostra attenzione si è focalizzata sull’identificazione di eventuali
perturbazioni a carico dell’asse riproduttivo e principalmente a livello dei neuroni
GnRH. La dieta IED ha indotto un aumento nell’mRNA del GnRH, contrariamente alle
nostre aspettative di un HH centrale (ipotalamico o terziario). Tuttavia, sarebbe
necessario integrare questo dato con l’effetto del sovraccarico marziale sulla
secrezione dell’ormone decapeptidico, non effettuato in tale lavoro di tesi. Infatti,
dalla letteratura emerge come l’espressione genica di un ormone ipotalamico non sia
sempre in analogia con la sua secrezione e, in tale contesto, potrebbero influire
diversi fattori quali il tipo o la durata della stimolazione [400]. L’aumentata
espressione del trascritto del GnRH potrebbe essere ascrivibile ad un “effetto
rebound” della ridotta secrezione del decapeptide. Inoltre, i livelli di mRNA del GnRH
non correlano con l’espressione genica delle gonadotropine ipofisarie. Sebbene non
144 siano state osservate variazioni nel trascritto dell’FSH, notoriamente meno responsivo
dell’LH alla pulsatilità del GnRH, i livelli dell’mRNA dell’LH tendono a ridursi nei topi
IED, suggerendo che effettivamente potrebbe sussistere una disfunzione centrale.
Negli ultimi anni è emerso il ruolo cruciale del sistema Kiss-1 (neuroni secernenti
kisspeptina) /GPR54 (recettore di kisspeptina) nell’attivazione dei neuroni GnRH e
quindi dell’asse riproduttivo [311, 401] e nella mediazione della regolazione a
feedback degli steroidi sessuali sulla secrezione del GnRH e delle gonadotropine [402].
Nel 2003, due indipendenti gruppi di lavoro hanno identificato la presenza di
mutazioni inattivanti o delezioni del gene GPR54 in rare forme di HH [120, 121]. Nei
nostri topi IED, le alterazioni delle componenti dell’asse riproduttivo non sono
ascrivibili a variazioni nei livelli di espressione genica dei neuroni Kiss-1 o del
recettore GPR54. Anche dalla letteratura non emergono studi in merito agli effetti
dell’eccesso di ferro sul sistema Kiss-1/GPR54.
Per meglio comprendere quale effettivamente sia la sede anatomica della disfunzione
riproduttiva nell’asse HPG e quali siano i meccanismi fisiopatologici coinvolti sono in
corso analisi del profilo endocrino dei topi IED, in termini di dosaggio dei livelli sierici
di LH, FSH e testosterone libero. Inoltre, per chiarire l’effettivo contributo del sistema
Kiss1-GPR54
e
dei
neuroni
GnRH
nella
perturbazione
ferro-indotta
dell’asse
riproduttivo, saranno condotti esperimenti d’ibridazione in situ su sezioni ipotalamiche
di topi IED.
•
Lieve attivazione ipotalamica del pathway infiammatorio e dello stress
Complessivamente, i modelli di sovraccarico marziale, genetico o dietetico, presenti in
letteratura, hanno mostrato variazioni irrilevanti nei sistemi preposti alla regolazione
dello stress ossidativo nel cervello in toto [393]. In realtà, l’esplorazione degli stessi
nell’ipotalamo dei nostri topi IED ha evidenziato un incremento nell’mRNA di CHOP
(proteina omologa di CAAT/enhancer binding protein (C/EPB); marker dell’attivazione
della risposta allo stress nel reticolo endoplasmatico), come nel VAT [1], ma nessuna
variazione nell’espressione genica di SOD2 (Superossido Dismutasi 2; marker di
stress ossidativo) e nello splicing di XBP-1 (Proteina di Legame di X-box 1; marker
dell’attivazione della risposta allo stress nel reticolo endoplasmatico). L’aumentata
espressione genica ipotalamica di CHOP è probabilmente da considerarsi come un
epifenomeno del sovraccarico periferico di ferro.
Inoltre, dalla letteratura sono emersi pochi cambiamenti in merito all’espressione
cerebrale di geni correlati a processi infiammatori e apoptotici, spesso implicati nel
danno o morte neuronale in risposta ad elevati livelli marziali [372]. Nel nostro
145 modello, la dieta IED non ha aumentato l’espressione di citochine pro-infiammatorie
nel siero, nel fegato e nel VAT [1] mentre nell’ipotalamo si è registrato un incremento
nell’espressione genica del TNFα. In numerosi studi, l’attivazione ipotalamica del
pattern infiammatorio è stata associata alla promozione di un bilancio energetico
negativo. Sebbene i topi IED abbiano manifestato un ridotto incremento ponderale,
non è ad oggi possibile correlare i due fenomeni. Infatti, per comprendere il reale
significato di questo stato pro-infiammatorio è necessario identificare quale tipo
cellulare sviluppi tale condizione (neuroni, astrociti, oligodendrociti, microglia, cellule
endoteliali ed ependimali), in quali nuclei ipotalamici avvenga l’aumentata sintesi di TNFα e quali circuiti neuronali siano coinvolti [403]. •
Promozione di uno stato oressigenico
Nel nostro modello murino di sovraccarico marziale, la dieta IED ha comportato un
minor incremento ponderale in parte giustificabile con una spontanea riduzione
dell’assunzione di cibo da parte dei topi IED. Tale calo è associato alla riduzione della
massa del VAT stimata dal peso del grasso perigonadico. Come atteso, si è osservato
un minor rilascio di leptina dal VAT che ha modificato i livelli di mRNA dei neuropeptidi
ipotalamici regolatori dell’appetito favorendo l’attivazione del pathway oressigenico
(aumento dell’espressione genica del peptide oressizzante NPY/AGRP e riduzione di
quella del peptide anoressante POMC). L’asse ipotalamo-tessuto adiposo viscerale è
coinvolto nel mantenimento dell’omeostasi energetica mediante la regolazione
dell’assunzione di cibo e della spesa energetica. A livello ipotalamico, tale funzione è
esercitata prevalentemente dall’ARC preposto all’integrazione di segnali circolanti
periferici quali ormoni (insulina e grelina), adipochine (leptina) e nutrienti (glucosio,
acidi grassi liberi) e al conseguente rilascio di specifici neuropeptidi. A sua volta, ARC
controlla l’attività di altri nuclei ipotalamici: il ventromediale (VMN), il dorsomediale
(DMN) e il paraventricolare (PVN), considerati i “centri della sazietà”; l’area
ipotalamica laterale (LHA), definita “centro della fame”. L’ipotalamo, soprattutto il
PVN, risponde ai segnali endocrini periferici modulando, attraverso il nucleo del tratto
solitario del tronco encefalico, l’attività del sistema nervoso autonomo simpatico che
regola la spesa energetica tramite lipolisi e/o termogenesi nel VAT [404‐406].
•
Modulazione delle vie di segnale di MAPK/ERK1/2, PI3K/Akt e AMPK
nell’ipotalamo
La preliminare caratterizzazione degli effetti centrali del sovraccarico di ferro sistemico
è proseguita con l’indagine delle possibili vie di segnale coinvolte nelle variazioni,
146 seppur di lieve entità, osservate a livello ipotalamico. Tale analisi è stata però
condotta su ipotalami interi ed è quindi il risultato dei contributi di diversi nuclei e tipi
cellulari, neuronali o meno. Indagini future verteranno sull’isolamento dei nuclei
preposti al controllo della funzionalità riproduttiva per meglio comprendere quali vie di
segnale siano effettivamente coinvolte nella modulazione dell’asse HPG da parte del
ferro. I componenti della famiglia MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase), ERK1/2
(Extracellular-Signal-Regulated Kinase 1/2), JNK (c-Jun NH2 Terminal Kinase) e p38,
svolgono un ruolo chiave nelle difese antiossidanti e nelle risposte pro- e antiinfiammatorie [407] e sono coinvolti nella regolazione di una grande varietà di
processi tra cui l'adesione cellulare, la progressione del ciclo cellulare, la migrazione
cellulare, la sopravvivenza, la differenziazione, il metabolismo, la proliferazione e la
trascrizione [408]. Fattori di crescita, citochine, agenti stressogeni pro-ossidanti quali
il ferro e altri metalli neurotossici attivano e inducono la traslocazione nucleare di
ERK1/2 [407, 409‐415]. E’ stato dimostrato che lo stress ossidativo indotto
dall’eccesso marziale provoca morte cellulare mediante l’attivazione, ERK-dipendente,
delle vie di segnale apoptotiche o necrotiche [416]. L’eccessiva attivazione della via di
MAPK è quindi uno dei segnali più importanti di morte cellulare neuronale [408, 417].
Nel nostro modello sperimentale, la IED non ha modificato i livelli di fosforilazione di
ERK1/2 nell’ipotalamo, suggerendo che l’entità di sovraccarico di ferro sistemico non è
stata sufficiente per indurre stress ossidativo e danno cellulare nell’ipotalamo.
La serina-treonina protein chinasi Akt, conosciuta anche come PKB (protein chinasi B)
è uno dei principali effettori a valle di PI3K (fosfatidilinositol-3-chinasi) [418]. La via di
PI3K/Akt controlla una serie molto ampia di funzioni cellulari tra cui la crescita, la
sopravvivenza, la proliferazione cellulare e il metabolismo glucidico [419]. Nei
neuroni, l’attivazione di PI3K/Akt in risposta ad uno stato di debole stress ossidativo
indotto dall’eccesso di ferro è stata associata all’attivazione di meccanismi di plasticità
sinaptica e di sopravvivenza neuronale. Nello specifico, PI3K/Akt agirebbe riducendo
l’espressione di SOD1 e SOD2 e bilanciando la perdita di tali enzimi antiossidanti
mediante regolazione del contenuto di GSH (glutatione ridotto) [420]. In effetti, i topi
IED hanno mostrato un’aumentata fosforilazione di Akt unitamente alla riduzione,
seppur non significativa, dell’espressione genica di SOD2. Tale dato deve però essere
necessariamente supportato da indagini aggiuntive.
AMPK (proteina chinasi attivata da AMP) è un sensore dei livelli energetici cellulari ed
è attivata da stati di deficit energetico fisiologico e patologico a livello sistemico o in
un singolo tessuto. Tale chinasi promuove l’attivazione delle vie cataboliche del
metabolismo glucidico e lipidico e spegne i processi che consumano energia al fine di
147 contrastare il bilancio energetico negativo. Nel SNC, AMPK stimola l’assunzione di cibo
e la produzione epatica di glucosio ed inibisce la spesa energetica e l’ossidazione degli
acidi grassi [420‐424]. L’attivazione ipotalamica di AMPK è uno stimolo oressigeno e,
se in eccesso, contribuisce al processo d’infiammazione centrale [425]. Nel nostro
modello di sovraccarico marziale, l’aumento della fosforilazione di AMPK potrebbe
derivare dalla ridotta stimolazione da parte dell’ormone anoressizzante leptina ed
essere associata all’aumento di TNFα.
CARATTERIZZAZIONE DI MODELLI IN VITRO DI NEURONI GnRH IMMATURI E
MATURI SOTTOPOSTI A SOVRACCARICO DI FERRO
Oltre alla via enterale (ferro eme e non-eme nella dieta) e parenterale (trasfusioni o
iniezioni di composti contenenti ferro), il ferro può entrare nell’organismo attraverso
la placenta durante la vita prenatale [426]. In particolare, tutto il ferro necessario per
la crescita e lo sviluppo fetale è trasportato in modo unidirezionale dalla circolazione
materna al feto contro gradiente di concentrazione [427]. I sinciziotrofoblasti
placentari possiedono un sistema di “trafficking” del ferro simile a quello dell’epitelio
duodenale, ma, diversamente dall’enterocita, la placenta regola l’espressione delle
proteine preposte all’omeostasi marziale in risposta a segnali sia materni che fetali
[428]. Sebbene la carenza di ferro nelle donne in gravidanza sia un problema molto
più comune rispetto al sovraccarico marziale, l’eccesso di ferro è stato associato a
complicanze quali la variazione di peso alla nascita [429] e lo sviluppo di diabete
gestazionale [430]. Qualsiasi difetto genetico o metabolico che causa un aumento
nell’accumulo di ferro nel feto, prevalentemente nel fegato, è probabilmente
caratterizzato da un anomalo trasferimento placentare di ferro dalla madre al feto
[431, 432]. Per realizzare un modello sperimentale di sovraccarico marziale nel feto è
necessario aumentare il contenuto di ferro nella dieta materna. Tale approccio è però
limitato dalla difficoltà di ottenere un elevato carico marziale nel feto e di determinare
gli effettivi livelli di esposizione di ciascun feto al ferro dietetico [431]. La disponibilità
nel nostro laboratorio di modelli cellulari in vitro di neuroni GnRH immaturi
immortalizzati ci ha consentito di effettuare delle indagini preliminari sulla capacità del
ferro di perturbare tale sistema.
•
Compromissione della capacità migratoria di neuroni GnRH immaturi
Gli studi condotti sui neuroni GN-11 immaturi hanno evidenziato il potenziale effetto
inibitorio di dosi sovra-fisiologiche di ferro sulla migrazione in vivo dei neuroni GnRH
148 durante la vita embrionale dal placode olfattorio all’ipotalamo. Nei mammiferi, tale
processo migratorio è un pre-requisito essenziale per lo sviluppo del compartimento
riproduttivo ipotalamico e per l'acquisizione della competenza riproduttiva in età
adulta. Numerosi segnali genetici e locali, presenti lungo il percorso migratorio, quali
fattori di adesione, diffusivi o connessi alla matrice extracellulare, influenzano la
migrazione nei neuroni GnRH; l’identità di molecole e meccanismi che perturbano
negativamente tale processo è ancora poco conosciuta [31, 374]. Questo lavoro di tesi
aggiunge un elemento di novità in tale ambito poiché ha evidenziato la capacità
dell’eccesso di ferro di inibire la chemiotassi, indotta da FBS, delle cellule GN-11 in
modo dose- e tempo-dipendente. Il minor effetto anti-migratorio ottenuto con dosi
molto elevate di Citrato di Ammonio Ferrico (FAC) (1000 µM) rispetto a dosaggi più
bassi (200 e 500 µM) è probabilmente ascrivibile alla saturazione o down-regolazione
del recettore e/o delle vie di segnale associate. Degna di nota è l’osservazione che
dosi sovra-fisiologiche di ferro non comportano un abbattimento della migrazione dei
neuroni GnRH immaturi, come avviene nella sindrome di Kallman [4], ma possono
comunque alterare negativamente il normale processo fisiologico con conseguente
HH. L’effettivo contributo negativo del ferro sulla chemomigrazione delle GN-11 è
stato confermato dal ripristino della motilità basale dopo chelazione dell’eccesso di
FAC mediante Deferoxamina Mesilato (DFO), un sideroforo che forma complessi
esadentati in rapporto molare 1:1 con gli ioni ferrici liberi (NTBI – “Non-Transferrin
Bound Iron”) [433]. DFO è un farmaco attualmente impiegato in clinica per ridurre il
carico di ferro nell’organismo [434] e la sua efficacia nel sequestro del NTBI è stata
ampiamente dimostrata [435]. Come atteso, l’incubazione delle cellule GN-11 con il
solo chelante ha inibito in modo più marcato rispetto al solo ferro la chemiotassi FBSindotta, poiché DFO ha deprivato le cellule del contenuto marziale necessario per le
normali funzioni biologiche. L’eccesso, e ancora di più, il deficit marziale hanno quindi
un impatto negativo sulla migrazione neuronale.
•
Metabolismo marziale
Il primo approccio allo studio degli effetti del ferro sui neuroni immortalizzati immaturi
GN-11 ha previsto la caratterizzazione della risposta di tali sistemi al sovraccarico
marziale. L’analisi è stata estesa anche all’analogo maturo GT1-7, utilizzato solo
marginalmente in questo lavoro di tesi.
Le cellule GN-11 e GT1-7 hanno aumentato fortemente il proprio specifico contenuto
marziale dopo opportuno trattamento con FAC, il che è indicativo della capacità di tali
sistemi in vitro di soddisfare i meccanismi fisiologici alla base della captazione del
149 ferro [371]. E’ interessante notare come i neuroni GnRH immaturi, in condizioni basali,
contengano livelli intracellulari di ferro due volte più elevati rispetto agli analoghi
maturi e come siano in grado di accumularne quantità molto maggiori dopo
esposizione a FAC. Tale comportamento potrebbe rispecchiare quanto osservato in
vivo da Piñero e collaboratori, sebbene i sistemi in vitro siano ovviamente un modello
semplicistico dei neuroni GnRH in vivo poichè sprovvisti della protezione fisica fornita
dalla BEE. Secondo tali ricercatori, il cervello di ratti adulti alimentati con dieta
arricchita in ferro è meno suscettibile all’accumulo marziale rispetto a quello di ratti
non ancora svezzati e nutriti da madri con elevati livelli sistemici di ferro [267].
Gli studi di tossicità cellulare sono stati condotti esclusivamente nelle cellule GN-11
poiché la maggior quota di ferro captato le rende potenzialmente più a rischio di
tossicità. L’accumulo intracellulare di ferro nelle GN-11 non è stato accompagnato da
una riduzione della vitalità o dall’alterazione della loro normale morfologia. Si è quindi
ipotizzato che tali modelli in vitro possedessero i meccanismi necessari per
l’immagazzinamento del ferro in forma non tossica e non reattiva [371] (come già
descritto in culture primarie neuronali [330]) e che tali sistemi fossero modulati dalle
condizioni sperimentali impiegate per indurre sovraccarico marziale. In effetti, tale
ipotesi è stata avvalorata dall’identificazione in entrambe le linee cellulari del trascritto
genico della FtH, i cui livelli sono stati significativamente aumentati dopo opportuna
incubazione con FAC. Il ferro può essere trasportato nelle cellule mediante
meccanismi dipendenti o meno dalla transferrina (Tf), la principale proteina di legame
del ferro in circolo [436]. Poiché molti degli esperimenti descritti nella sezione
“Risultati” sono stati condotti in terreno completato con siero fetale bovino (FBS), è
plausibile che gran parte del FAC introdotto nel medium fosse legato dalla Tf sierica e
quindi internalizzabile nelle cellule solo per endocitosi mediata dal TfR [371]. Abbiamo
quindi accertato l’espressione genica di tale recettore in entrambe le linee cellulari in
oggetto. Le condizioni sperimentali impiegate per indurre accumulo intracellulare di
ferro hanno contemporaneamente ridotto l’mRNA del TfR, un meccanismo attivato
dalle cellule allo scopo di minimizzare la captazione di altre molecole di FAC [329].
La modulazione inversa dell’espressione genica della FtH e del TfR, coordinata dal
sistema IRE/IRP (“Iron Responsive Element-Iron Regulatory Protein”) allo scopo di
proteggere l’ambiente intracellulare dalla tossicità marziale [437], è stata dimostrata
anche nelle cellule GT1-7 dopo analogo trattamento con FAC.
150 •
Modulazione delle vie di MAPK/ERK1/2, PI3K/Akt e AMPK nelle cellule
GN-11: solo PI3K/Akt è coinvolta nell’effetto inibitorio del ferro sul
processo di migrazione
Il trattamento con ferro è accompagnato dall’attivazione delle vie di segnale di
MAPK/ERK1/2 e di PI3K/Akt e dalla contemporanea inibizione di quella di AMPK, vie
che in nostri precedenti studi [373, 375] e in lavori riportati in letteratura sono state
variamente associate con il processo di migrazione cellulare. In particolare, ERK1/2 è
stato descritto come segnale pro-migratorio in cellule GN-11 [373, 375], in cellule T e
negli eosinofili [438‐441]; parimenti la via di PI3K/Akt promuove la migrazione in
cellule GN-11 [373, 375], in cellule infiammatorie, quali eosinofili, macrofagi, neutrofili
e linfociti T [442] e in cellule endoteliali [443]. Al contrario, AMPK influenza
negativamente la migrazione di monociti umani, di cellule stellate epatiche e di cellule
della muscolatura liscia vascolare [444‐446] mentre la sua azione, inibitoria o
neutrale, sulle cellule GN-11 è dipendente dalla sua attivazione, rispettivamente, a
monte o a valle di segnali pro-migratori [375]. Dal nostro studio è emerso come il
ferro inibisca la migrazione FBS-indotta delle GN-11 coinvolgendo la via di PI3K/Akt in
associazione ad altre non ancora identificate e senza alcun contributo di MAPK/ERK1/2
e AMPK. Più specificamente, la via di ERK1/2 è coinvolta nella migrazione delle GN-11
di per sé, sebbene con un contributo minore rispetto ad Akt e AMPK, ma non dopo
attivazione da parte del ferro. AMPK è fondamentale per la chemiotassi basale delle
GN-11 di per sé, come atteso dal ruolo specifico di tale chinasi nel controllo
dell’omeostasi energetica e della riproduzione, ma non partecipa alla riduzione della
migrazione indotta da FAC. L’attivazione della via di Akt è necessaria di per sé, seppur
in modo meno evidente rispetto a quella di AMPK, per la completa migrazione delle
GN-11, che è ulteriormente ridotta dall’associazione di FAC con l’inibitore di PI3K.
Considerati nel loro insieme, questi risultati indicano come il ferro inibisca la
migrazione FBS-indotta delle GN-11 coinvolgendo solo la via di Akt, tra quelle
analizzate, in associazione ad altre vie non ancora identificate. L’azione pro-migratoria
delle vie di ERK1/2, Akt e AMPK di per sé si evince anche dall’effetto additivo
sull’inibizione della migrazione ottenuto con la loro associazione; tale riduzione è stata
ulteriormente amplificata dalla contemporanea aggiunta di ferro confermando come
tale metallo agisca necessariamente attraverso altre vie, oltre a quella di Akt.
151 •
Attivazione del pathway infiammatorio e induzione di stress ossidativo
nelle cellule GN-11
L’accumulo intracellulare della percentuale di ferro libero è potenzialmente tossico per
l’ambiente cellulare poiché può partecipare alla reazione di Fenton generando specie
radicaliche dell’ossigeno (ROS). Un’eccessiva produzione di radicali liberi potrebbe
danneggiare i lipidi di membrana, le proteine e gli acidi nucleici alterando la
funzionalità neuronale e inducendo morte cellulare. I neuroni sono particolarmente
suscettibili al danno ossidativo ed hanno sviluppato numerosi meccanismi di
protezione per contrastare gli effetti deleteri dei ROS.
Le condizioni impiegate per indurre sovraccarico marziale non sono state sufficienti per
promuovere la traslocazione nucleare del fattore NF-κB e l’attivazione del suo
signaling neppure dopo incubazione con concentrazioni più elevate di FAC. La sola
evidenza d’induzione del pathway infiammatorio è stata riscontrata nell’aumento
dose-dipendente dei livelli di mRNA di IL-6. Le perturbazioni del processo migratorio
potrebbero essere ascrivibili all’induzione di stress ossidativo (aumento dell’mRNA di
SOD2) senza però il coinvolgimento del reticolo endoplasmatico (nessuna variazione
nel trascritto di CHOP e nello splicing di XBP-1).
LIMITAZIONI DELLO STUDIO
Il nostro approccio analitico si è basato solo sull’analisi dell’espressione di geni
coinvolti nell’omeostasi marziale (TfR, FtH, epcidina), nella regolazione della funzione
riproduttiva (Kiss1, GPR54, GnRH, LH, FSH), nei processi infiammatori (TNFα, IL-6) e
nello stress ossidativo (SOD2) o del RE (CHOP, XBP-1). Abbiamo scelto di utilizzare
l’analisi RT-qPCR perché ci ha consentito di valutare, più velocemente e in via
preliminare, diversi geni in due distinti modelli sperimentali (in vivo e in vitro). Studi
futuri prenderanno in considerazione altri livelli di potenziale regolazione, come i
cambiamenti nell’espressione o nell’attività delle rispettive proteine.
Inoltre, la nostra esplorazione in campioni d’ipotalamo intero delle variazioni
nell’espressione di geni e proteine d’interesse non tiene in considerazione la possibilità
di fluttuazioni divergenti e compensatorie nei livelli d’espressione nei diversi nuclei.
Il modello in vitro di neuroni GnRH immaturi rappresenta un fenotipo estremo di
sovraccarico marziale ipotalamico e necessita di conferme in modelli in vivo.
152 CONCLUSIONI
1. Il sovraccarico dietetico di ferro in topi C57BL/6J riproduce il fenotipo clinico e
biochimico di pazienti affetti da DIOS in termini di:
a) modulazione dei parametri associati al ferro nella circolazione sanguigna e nel
fegato (incremento del contenuto marziale sierico ed epatico, aumentata sintesi
e rilascio di epcidina) [1];
b) compromissione del metabolismo glucidico con un’azione primaria a livello del
VAT (iperglicemia a digiuno ascrivibile a IR per alterata attivazione del
signaling insulinico nel VAT) [1];
c) perturbazione del metabolismo lipidico (ipertrigliceridemia a digiuno) a causa di
modificazioni indotte dallo stress ossidativo nel fegato [1];
d) alterazioni
della
funzione
riproduttiva
a
livello
molecolare
(variazione
nell’espressione genica del GnRH ipotalamico e delle gonadotropine ipofisarie
LH e FSH) e macroscopico (atrofia gonadica) che suggeriscono la presenza di
ipogonadismo ipogonadotropo.
2. Tutte le componenti dell’asse riproduttivo, ovvero ipotalamo, ipofisi e gonadi, sono
diversamente perturbate dalla dieta IED ma ulteriori indagini quali l’analisi del
profilo ormonale (LH, FSH e testosterone) e il dosaggio del decapeptide
ipotalamico sono necessarie per accertare la sede anatomica primaria della
disfunzione riproduttiva e i meccanismi fisiopatologici coinvolti.
3. Il sovraccarico alimentare di ferro induce variazioni di lieve entità nell’espressione
genica ipotalamica probabilmente a causa del mancato accumulo marziale in tale
distretto anatomico. Le alterazioni osservate potrebbero essere un epifenomeno
delle perturbazioni marziali e metaboliche periferiche (leptina) oppure l’effetto
locale di mediatori indiretti dell’azione del ferro o l’unione di entrambi.
4. I modelli neuronali in vitro ci hanno consentito di realizzare un fenotipo estremo di
sovraccarico marziale ipotalamico che non tiene in considerazione dell’ostacolo
fornito dalla BEE al libero passaggio di ferro. E’ emerso come i neuroni, immaturi e
maturi, contengano i sistemi di captazione e regolazione dell’omeostasi marziale e
come questi siano in grado di rispondere al sovraccarico di ferro. Un’effettiva
esposizione dei neuroni a livelli eccessivi di ferro è potenzialmente in grado di
sovrastare i meccanismi di difesa cellulare e di indurre stress ossidativo e
infiammazione.
5. Dosi di ferro che si accumulano nei neuroni GnRH immaturi senza comprometterne
la vitalità influiscono negativamente sulla migrazione di tali neuroblasti che
avviene fisiologicamente dal placode olfattorio all’ipotalamo durante la vita
153 embrionale. L’esposizione a dosi eccessive di ferro potrebbe quindi compromettere
il corretto sviluppo della componente riproduttiva ipotalamica.
6. La ridotta migrazione di neuroni immaturi esposti a un carico marziale potrebbe
essere estesa, in senso generale, al processo di neurogenesi che avviene in
mammiferi adulti in specifiche regioni cerebrali: dalla zona sottogranulare del giro
dentato
verso
lo
strato
di
cellule
granulari
dell’ippocampo
e
dalla
zona
sottoventricolare del ventricolo laterale fino ai bulbi olfattori attraverso il flusso
migratorio rostrale [346]. Un aumento del contenuto marziale in tali regioni
potrebbe indurre delle modificazioni nel processo di generazione e rifornimento di
nuovi neuroni funzionanti e in zone più sensibili quali l’ippocampo potrebbe
contribuire, nel lungo periodo, allo sviluppo di neurodegenerazione.
154 11. BIBLIOGRAFIA
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