“La scoperta della doppia elica mezzo
secolo fa ha coinvolto la pratica
medica con lentezza, ma sono probabili
trasformazioni significative nei
prossimi 50 anni.
Bisogna cambiare la pratica medica e la
formazione dei medici per poter
realizzare i potenziali benefici”
Bell, Nature 421: 414, 2003
Tratta da “lezioni di genetica” Prof. PF Pignatti
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In base al potere di risoluzione della
tecnica
Metodologie citogenetiche
Metodologie molecolari
• Formulare la domanda
• Utilizzare la metodica appropriata
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Metodologie molecolari
Analisi Southern (DNA)
Analisi Northern (RNA)
Analisi Western (Proteine)
PCR (DNA)
RT-PCR (RNA)
Microarray (DNA – RNA – Proteine)
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Sonde Molecolari
Sequenze nucleotidiche marcate a singolo
filamento in grado di riconoscere
sequenze complementari
4
5
• Denaturazione di una molecola di acido
nucleico a doppia elica
• Rinaturazione o ibridazione di
polinucleotidi a filamento singolo in una
molecola a doppia elica
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Marcatura
• Radioisotopi (32P, 3H, 35S)
• Fluorescenti (biotina-avidina)
• Chemiluminescenti (fosfatasi alcanica)
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Analisi Southern
• Estrazione del DNA
• Quantificazione e Controllo Qualità
• Digestione con Enzimi di Restrizione
• Elettroforesi preparativa
• Trasferimento del DNA dal gel ad un supporto di nylon
• Ibridazione con la sonda
• Autoradiografia
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Enzimi di Restrizione
Endonucleasi che riconoscono e tagliano il DNA a
livello di specifiche sequenze
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Elettroforesi
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Elettroforesi di DNA genomico umano
tagliato con enzimi di restrizione
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Immagine ottenuta
dopo:
ibridazione della
membrana con una
specifica sonda
esposizione della
membrana su lastra
autoradiografica
sviluppo della lastra
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Analisi Northern
• Estrazione dell’RNA totale
• Isolamento degli mRNA o Arricchimento dei miRNA
• Elettroforesi
• Trasferimento del RNA dal gel ad un supporto di nylon
• Ibridazione con la sonda
• Autoradiografia
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Elettroforesi di RNA totale
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Limiti
• Notevole quantità di DNA - RNA – Proteine
(numero elevato di cellule da analizzare)
• Uso di sostanze radioattive
• Tempo impiegato
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PCR - Polymerase Chain Reaction
ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il
premio Nobel per la chimica (1993).
Questa tecnica, utilizzando i principi della
duplicazione del DNA,
permette di ottenere in poco tempo
notevoli quantità di materiale specifico
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22
PCR schema
23
24
•
•
•
•
•
DNA bersaglio
Primers
Enzima
Nucleotidi trifosfati
Ioni Mg++
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Campione
DNA bersaglio
Primers
Enzima
Oligonucleotidi sintetici complementari
a sequenze fiancheggianti il tratto di
DNA da studiare 20 – 25 bp
DNA polimerasi
Nucleotidi trifosfati
26
27
28
Termociclatori
Denaturazione del DNA
(94°C)
Ibridazione dei primers al bersaglio
(40°C – 60°C)
Sintesi del DNA
(72°C)
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Denaturazione
Ibridazione
Sintesi
Denaturazione
Ibridazione
Sintesi
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Vantaggi
• Si può evitare l’uso di tecniche più
laboriose. Velocità di esecuzione
• Si possono analizzare campioni di poche
cellule (anche 1 cellula). Elevata
sensibilità
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Biopsie
Analisi prenatale e Analisi preimpianto
Tracce di infezioni virali
Malattia mimima residua
Medicina forense
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Real Time PCR
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Permette di quantificare
il DNA del campione
analizzato
•Ricerca di DNA virali
•Ricerca di OGM negli
alimenti
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RT-PCR
Reverse transcription-PCR
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Sequenziamento
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Scomparsa di un sito BclI nel gene del fattore VIII
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PCR allele specifica
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Multiplex ARMS test per individuare 4 specifiche
mutazioni che causano la fibrosi cistica
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Diagnosi di malattie da espansione
di triplette ripetute
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Analisi contemporanea di più geni
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Queste tecniche si basano sempre sul principio
dell’ibridazione;
Differenze:
• legato al supporto troviamo un oligonucleotide non il campione
• il campione è marcato
46
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Il campione:
RNA totale convertito in cDNA e marcato
(analisi dell’espressione)
DNA genomico (analisi delle mutazioni)
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Un supporto a cui vengono legati degli
oligonucleotidi specifici:
Complementari ai geni che vogliamo studiare
Complementari a sequenze normali e a
sequenze mutate
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Ibridazione di DNA amplificato con PCR ad
oligonucleotidi
allele
specifici
(ASO)
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DNA microarrays consist of thousands of individual gene sequences bound to
closely spaced regions on the surface of a glass microscope slide.
20 - 50 µm
20 - 50 µm
Millions of identical
oligonucleotide
probes per feature
49 - 400
chips/wafer
1.28cm
up to ~ 400,000 features/chip
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To conduct a multiplex gene expression screen, a microarray needs to
be designed to contain cDNA clones or gene-specific oligonucleotides
(designed from transcribed gene regions) to represent every gene of
interest. To investigate expression of the chosen genes represented in
such arrays, RNA is prepared from the selected target cells, converted
into cDNA using standard reverse transcriptase procedures, labeled with
a fluorescent tag and hybridized to the microarray.
oligonucleotide arrays
cDNA clones
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Schematically
Before labelling
Array
53
Schematically
Labelled but before hybridization
Array
54
Schematically
After hybridization
Array
55
Schematically
Quantification
4
2
0
Array
3
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•Microarrays may be used to assay gene expression within a single
sample or to compare gene expression in two different cell types or
tissues samples, such as in healthy and diseased tissue.
–Follow population of (synchronized) cells over time, to see how expression
changes (vs. baseline)
–Expose cells to different external stimuli and measure their response (vs.
baseline)
–Take cancer cells (or other pathology) and compare to normal cells.
Tumor Reference
sample sample
RNA
RNA
cDNA
cDNA
excitation
green
laser
red
laser
emission
Hybridize
overlay images and normalise
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Gene expression during tumorigenesis - cells can be sampled at
different recognized stages during the progression to cancer
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•Developmental stage-specific gene expression
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•Gene expression during differentiation - investigation of how gene
expression patterns are altered during differentiation.
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•screening of polymorphisms and mutation
•There is also huge potential for assaying for mutations in known disease
genes, as recently exemplified in the case of the breast cancer
susceptibility gene, BRCA1. In addition, there have been vigorous efforts
to identify and catalog human single nucleotide polymorphism (SNP)
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markers
ADVANTAGES
Microarray analysis offers the advantage of profiling expression levels
of hundreds or thousands of genes simultaneously using a single RNA
preparation
Human ~ 25,000 genes
Mouse ~ 25,000 genes
Theorycally, all genes of an organism can be analyzed by a single array
Easy to use
Yeast ~ 6200 genes
E. coli ~ 4200 genes
High speed
This technology is a very dynamic one and
PhageisT4currently
~ 20 genes spawning
Influenza ~ 12 genes
a variety of derivative technologies including the development
of
protein and antibody microarrays and cell microarrays
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LIMITS
Obviously, this is an expression-based technology, capable only
of monitoring cellular responses at the RNA level. Some critical
signaling changes may occur only at the protein or posttranslational level and therefore would not be detected with gene
arrays.
The correlation between the number of mRNA and protein molecules is
generally not strong enough to predict one value from the measurement
of the other
DNA
transcription
mRNA
translation
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Protein
LIMITS
High cost technology
No quantitative: 3 fold variations are experimental
Data interpretation represent a complex problem:
mRNA profiling data (as other applications) typically consist of many
thousands of measurements for each array
Needs verification by other approach (i.e., Real time PCR)
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