Rendiconto OLEA – I Anno
U.O. CRA Centro di Ricerca per la Genomica
Responsabile: Luigi Cattivelli
WorkPackage 8 - Tolleranza e resistenza agli stress abiotici e biotici
Obiettivi della ricerca
(Max 2.000 caratteri spazi inclusi)
Sequenziamento del trascrittoma di piante di olivo sensibili e tolleranti a freddo, attraverso
la piattaforma Illumina GAIIx.
Data mining volto all’identificazione dei pathway metabolici coinvolti nella tolleranza
dell’olivo al freddo sulla base delle conoscenze maturate in altre specie.
Sequenziamento del trascrittoma di piante di olivo sensibili e tolleranti a Verticillium,
attraverso la piattaforma Illumina GAIIx, i campioni di RNA saranno predisposti da CRAOLI.
Attività svolte
(Max 15.000 caratteri spazi inclusi)
A. Sviluppo di un sistema riproducibile per il monitoraggio della risposta fotosintetica al
freddo in olivo
La conoscenza della tolleranza a freddo delle diverse varietà di olivo è di norma basata su
osservazioni di campo spesso influenzate da condizioni specifiche (età della pianta, fertilità dei
suoli, microclima ecc). Pertanto in parallelo all’attività molecolare si è ritenuto necessario
sviluppare e caratterizzare un sistema sperimentale in camera di crescita che consenta una
valutazione comparata del livello di resistenza al freddo delle cultivar. Pertanto in parallelo
all’attività molecolare si è ritenuto necessario sviluppare in camera di crescita un sistema
sperimentale riproducibile che consenta una valutazione della risposta al freddo delle cultivar di
olivo in condizioni di acclimatamento e stress a basse temperature. A tal fine è stata utilizzata la
tecnica della fluorescenza della clorofilla in vivo come sonda per monitorare attraverso misure non
invasive il funzionamento dell’apparato fotosintetico e in particolare del fotosistema II (PSII). E’
stato misurato il parametro Fv/Fm, che in numerose specie vegetali si è dimostrato molto utile per
rilevare sulle foglie effetti reversibili e irreversibili sulla funzionalità del PSII alle basse
temperature. Essendo la misura rapida e non distruttiva si presta particolarmente a rilevare
modificazioni che potranno essere associate ad analisi molecolari eseguite negli stessi tessuti
fogliari. Fv/Fm è risultato altamente correlato alla tolleranza a congelamento rilevata in condizioni di
campo in specie erbacee e arboree. Questo aspetto è stato preso in considerazione confrontando
piante di due cultivar, Leccino e Dolce Agogia (la prima presumibilmente più suscettibile al freddo
rispetto alla seconda) esposte a temperature progressivamente decrescenti per simulare l’andamento
autunno-invernale sino a giungere al congelamento. La risposta foto sintetica al freddo è stata
valutata lungo un periodo di 12 settimane di acclimatamento evidenziando come 7 settimane di
esposizione a 3°C siano necessarie per il completo acclimatamento dei tessuti fogliari (vedi grafico
sottostante). Le misure effettuate hanno evidenziato un significativo meccanismo di acclimatamento
del sistema fotosintetico (e quindi dei tessuti fogliari) dipendente dall’età della foglia senza però
evidenziare riproducibili differenza tra le cultivar.
Inoltre l’esperimento ha evidenziato come la risposta foto sintetica della pianta a basse temperature
sia significativamente differente lungo l’asse verticale del tronco, con le foglie più giovani (F4 nel
grafico sottostante) che rispondono in modo più rapido rispetto a quelle più vecchie (F1).
Questi dati dimostrano che è possibile misurare in modo rapido e non distruttivo il grado di
acclimatamento (ed indirettamente di resistenza al freddo) in olivo. Per una ulteriore validazione, in
collaborazione con CRA-OLI sono state selezionate una ventina di varietà diverse di olivo
contrastanti per resistenza a freddo, le piante moltiplicate presso CRA-OLI verranno sottoposte a
basse temperature per valutare il loro livello di acclimatamento e, successivamente di resistenza al
freddo. Anche se ulteriori studi sono necessari per la messa a punto di un sistema sperimentale che
evidenzi differenze riproducibili tra cultivar resistenti e cultivar suscettibili, i dati acquisiti indicano
Fv/Fm come un marker fisiologico per valutare la resistenza al freddo in olivo.
B. Analisi della risposta molecolare al freddo per ricercare i determinanti genici che
controllano la tolleranza al freddo (sulla base delle conoscenze sviluppate in altre specie)
o Allestimento della prova di trattamento a freddo
Un set di piante di Leccino e Dolce Agogia, suddiviso in tre pool, è stato inizialmente acclimatato
alla cella climatica con fotoperiodo 10/14h, condizioni analoghe a quelle incontrate dalle piante in
condizioni naturali durante l’inverno. Quindi, sulla base dell’esperienze pregressa sulle risposte
adattative delle piante al freddo, è stato sviluppato un piano sperimentale per esporre le piante a
condizioni di basse temperature, in modo da indurre le risposte molecolari indicative
dell’acclimatamento al freddo (hardening). Durante il periodo di acclimatamento sono stati
compiuti campionamenti di foglie, andando a costituire tre repliche biologiche per ogni cv.
o Preparazione e sequenziamento dei campioni
A partire dai campioni prelevati nell’esperimento descritto sopra si è proceduto all’estrazione di
RNA totale utilizzando il kit QIAGEN RNeasy Plant Mini Kit. I campioni di RNA sono stati
utilizzati per produrre librerie a cDNA utilizzando il kit/protocollo True Seq™RNA di Illumina. In
totale sono state prodotte 18 librerie corrispondenti alla condizione controllo, hardening ad 8°C e
congelamento a -5°Cche sono state sottoposte a sequenziamento nel settembre 2011 sfruttando la
piattaforma illumina GAIIx ed un protocollo che ha previsto la generazione di “read pair ends”
della dimensione di circa 120 paia di basi. Sono stati ottenuti complessivamente circa 200 milioni di
reads di alta qualità con una lunghezza media di circa 110 basi. I dati sono stati elaborati in modo
preliminare con priorità per la cultivar Leccino per la quale è in corso il sequenziamento del
genoma. I risultati dell’assemblaggio preliminare sono illustratati nella tabella sottostante, mentre
un più accurato assemblaggio delle sequenze è attualmente in corso.
Length statistic
Leccino +22°C
Leccino +8°C
Leccino -5°C
Total length (Mpb)
86
98
90
Mean
1.123
1.133
1.116
Median
804
795
775
N50
1.724
1.760
1.736
Length
(contig)
distribution
Nrs
%
200-1.000
44.394
1.000-5.000
Nrs
% Nrs
%
57,7 49.871
58,0 47.266
58,9
31.954
41,5 35.389
41,1 32.367
40,3
5.000-10.000
558
0,01 747
0,01 630
0,01
>10.000
26
-
-
-
Total
76.932
100 86.032
25
28
100 80.291
100
o Identificazione di fattori trascrizionali CBF con ruolo chiave nel controllo dei
meccanismi di tolleranza al freddo
Sulla base delle conoscenze in altre specie vegetali (sia erbacee che arboree) la resistenza al freddo
è prevalentemente controllata da una famiglia di fattori di trascrizione denominati CBF, pertanto
abbiamo utilizzato l’assemblaggio preliminare del trascrittoma di piante di olivo esposte a freddo
per ricercare sequenze omologhe alle sequenze di CBF descritte in altre specie. La ricerca BLAST
ha consentito di isolare alcune sequenze caratterizzate da significative omologie con CBF noti in
altre specie. La sequenza migliore è stata verificata in qRT-PCR su un nuovo set di campioni
prelevati da piante esposte a 3°C per periodi compresi da 1 a 24 ore. Il risultato, riportato nella
figura sottostante, dimostra la rapida induzione della sequenza CBF in risposta all’abbassamento
della temperatura. Il livello di espressione di CBF in molte specie è stato correlato al grado di
resistenza al congelamento dei tessuti verdi, pertanto nelle prossime settimane un panel di varietà di
olivo contrastanti per tolleranza al freddo verrà analizzato per valutare il livello di espressione di
questo gene.
A. Sequenziamento del trascrittoma di piante di olivo sensibili e tolleranti a Verticillium,
attraverso la piattaforma Illumina GAIIx, i campioni di RNA saranno predisposti da CRAOLI.
Presso CRA-OLI è stato sviluppato il metodo di infezione, realizzato il protocollo di infezione con
cvs resistenti e suscettibili ed è in corso la preparazione dei campioni di RNA che verranno
sottoposti a sequenziamento nelle prossime settimane.
Risultati ottenuti
(Max 6.000 caratteri spazi inclusi)
È stata valutata la risposta al freddo dei tessuti fotosintetici da utilizzarsi quale sistema
diagnostico rapido ed è stato messo a punto un potenziale marcatore fisiologico per la
misura non distruttiva del livello di acclimatamento al freddo. Questo potrà consentire nel
prosieguo uno screening dei materiali genetici disponibili.
Sono stati sequenziali i trascrittomi delle piante sottoposte a acclimatamento e congelamento
ed è in corso l’identificazione e la validazione dei geni differenzialmente espressi in risposta
a freddo.
È stato identificato e validato un fattore trascrizionale CBF regolato da freddo e coinvolto
nel controllo dell’acclimatamento.
Ostacoli incontrati e azioni correttive
(Max 6.000 caratteri spazi inclusi)
Pubblicazioni / Eventi divulgativi / Eventi formativi
Guerra D, Lamontanara A, Bagnaresi P, Baldoni L, Rizza F, Pagani D, Cattivelli L,
Mazzucotelli E. MOLECULAR AND PHYSIOLOGICAL ADAPTATION OF OLEA
EUROPEAE TO LOW TEMPERATURES Joint meeting AGI-SIBV-SIGA Assisi, 19-22 set
2011.
Tesi di laurea specialistica: Analisi della risposta a freddo in piante di olivo. Laureanda
Giorgia Pertrile c/o Universita degli studi di Firenze, Corso di laurea magistrale in Scienze e
tecnologie dei sistemi forestali (prof Giacomo Pietramellara).
Timbro Istituzione
Firma Responsabile Scientifico U.O.
