Problematiche di Laboratorio nell`applicazione del Protocollo

Problematiche di Laboratorio
nell’applicazione del Protocollo regionale
UOC di Microbiologia e Virologia
DAI di Patologia e Diagnostica
AOUI di Verona
MALATTIE TRASMESSE DA VETTORI E SORVEGLIANZA DELLE FEBBRI ESTIVE
Verona 16 Maggio 2013
Malattie Trasmesse da Vettori e
Sorveglianza delle Febbri Estive
Piano regionale - obiettivi
Individuare in tempi rapidi possibili introduzioni della malattia
nell’area geografica indenne
Verificare la reintroduzione nell’area infetta
Tutelare la salute degli animali
Attuare misure di protezione per la popolazione umana
West Nile Virus
Dengue -Chikungunya
Diagnosi
• Sintomi clinici non specifici
• Laboratorio fondamentale:
– Parametri connessi con la replicazione virale
(primo stadio dell’infezione)
– Parametri connessi con la risposta anticorpale
WNV - Dengue - Chikungunya
ARBOVIRUS
Famiglia Flaviviridae, Genere Flavivirus
Dengue virus 1- 4: Dengue fever, DHF*, DSS*
*pazienti precedentemente infetti con sierotipo differente dal
sierotipo causa di infezione secondaria
West Nile virus: WNF, WNND
Famiglia Togaviridae, Genere Alphavirus
Chikungunya virus
WNV – Diagnosi di Laboratorio
Isolamento del virus (sangue e urine)
coltura (possibilità di sequenziare l’isolato)
metodi molecolari RT-PCR
Anticorpi
IgM (anche su liquor)
IgG
aumento del titolo anticorpale confermato con test di
neutralizzazione (PRNT)
tempo di comparsa:
IgM 1 settimana
IgG 15 giorni
WNV – Diagnosi di Laboratorio
Problematiche test sierologici
• IgM possono persistere per più di un anno dopo
infezione acuta
• Cross-reattività anticorpi con altri flavivirus (es. TBE)
• Test di neutralizzazione specifico ma può essere
neutralizzato da altri flavivirus
• IgM non sono neutralizzabili
• Test di conferma in BSL3, tempi lunghi
WNV – Diagnosi di Laboratorio
Problematiche test molecolari
• Viremia bassa e di breve durata
• Genetica diversa (lineage)
• Labilità, degradazione del genoma RNA
WNF – Diagnosi di Laboratorio
Strutture livello B
Ricerca anticorpi IgM IgG
con metodo immunoenzimatico
Positivo
inviare campione
Laboratorio Regionale di Riferimento - Padova
WNF – Diagnosi di Laboratorio
Laboratorio Regionale di Riferimento - Padova
Ricerca anticorpi IgM IgG (test ELISA)
Conferma con test neutralizzazione
Ricerca WNV-RNA real time RT-PCR
Sequenziamento genomico
Isolamento in coltura
Malattia neuroinvasiva da West-Nile virus
WNND – Caso possibile
Segni clinici
febbre >38.5°C
manifestazioni neurologiche:
encefalite
meningite a liquor limpido
poliradicoloneurite
paralisi flaccida acuta
liquor limpido
Malattia neuroinvasiva da West-Nile virus
WNND – Caso probabile
Segni clinici e
Almeno uno dei seguenti criteri di laboratorio:
Presenza di anticorpi IgM anti WNV (met. ELISA)
Sieroconversione (met. ELISA)
Aumento di 4 volte del titolo di anticorpi IgG anti
WNV (met. ELISA) in due prelievi consecutivi (a distanza
> 5 giorni, preferibilmente 15-20giorni)
Malattia neuroinvasiva da West-Nile virus
WNND – Caso confermato
Segni clinici e
Almeno uno dei seguenti criteri di laboratorio:
Isolamento del virus WN nel sangue o nel liquor
Presenza di anticorpi IgM nel liquor (met.ELISA)
WNV-RNA positivo (met. RT-PCR) nel sangue o nel liquor
Rilevazione di un titolo elevato di WNV IgM e IgG (met. ELISA)
confermato con test di neutralizzazione PRNT)
Dengue – Diagnosi di Laboratorio
Ricerca anticorpi
• IgM e IgG con test rapidi e test ELISA
• Conferma test neutralizzazione
DENV-RNA real time RT-PCR
Tipizzazione tipo specifica real time RT-PCR
Sequenziamento
Isolamento virale in coltura
Dengue – Diagnosi di Laboratorio
Strutture livello B
Test rapidi immunocromatografici
• Ricerca antigene NS1
+
• Ricerca anticorpi IgM e IgG
Un solo test positivo: caso probabile
Due test positivi: sensibilità molto alta
inviare campione
Laboratorio Regionale di Riferimento - Padova
Dengue – Diagnosi di Laboratorio
Laboratorio Regionale di Riferimento - Padova
Ricerca anticorpi IgM IgG (test ELISA)
Conferma con test neutralizzazione
Ricerca DENV-RNA real time RT-PCR
Tipizzazione dei casi positivi real time RT-PCR tipo-specifica
Sequenziamento genomico
Isolamento in coltura
Major diagnostic markers for dengue infection
Peeling, R. W. et al. Evaluation of diagnostic tests: dengue. Nature Reviews Microbiology 8, S30–S37 (2010).
Chikungunya – Diagnosi di Laboratorio
Ricerca anticorpi
• IgM test rapidi
• IgG e IgM test ELISA, test in Immunofluorescenza
Conferma
• CHIKV-RNA real time RT-PCR e RT-PCR
• Isolamento virale in coltura
• Aumento del titolo anticorpale
Chikungunya – Diagnosi di Laboratorio
Strutture livello B
Ricerca anticorpi IgM
test rapido immunocromatografico
Falsi negativi nei primi 7 giorni di febbre
Forte sospetto clinico (anche se test rapido negativo)
inviare campione
Laboratorio Regionale di Riferimento - Padova
Chikungunya – Diagnosi di Laboratorio
Laboratorio Regionale di Riferimento - Padova
Ricerca anticorpi IgM IgG (test immunofluorescenza)
Ricerca CHIKV-RNA real time RT-PCR e RT-PCR
Sequenziamento genomico
Ricerca mutazione A226V nel gene E1: favorisce
trasmissione tramite Aedes albopictus
Isolamento in coltura
Inviare sempre la
scheda compilata
I campioni di siero, CSF, sangue in
EDTA e urine possono essere
conservati a 4°C fino a 72 ore.
Raccogliere subito siero,
plasma, e urine per i test
sierologici e molecolari. Poco
utile un protocollo in due fasi
con test di screening e test di
secondo livello.
Compilare sempre la scheda,
indicando sempre:
-data inizio sintomi
-Sintomi
-Vaccinazioni pregresse
-Eventuali precedenti risultati di
laboratorio (anticorpi anti-WNV e
altri flavivirus con test ELISA o IFA)
-Segnalare se NON sono stati
eseguiti test di primo livello.
-Info medico richiedente.
Inviare sempre i seguenti campioni:
-Almeno 1 provetta di sangue per
sierologia
-Almeno 2 provette di sangue intero
in EDTA
-Un campione di urina in
contenitore sterile.
Inviare sempre i campioni di followup a distanza di 15 giorni (utile
anche follow-up ravvicinato)
Inviare sempre la scheda
compilata
Rischio elevato di test rapidi
IgM/IgG falsamente positivi nei
casi autoctoni WN
Rischio di risultati falsi negativi
con i test rapidi come
screening. Il test rapido è utile
perchè eseguibile in urgenza.
I campioni di siero, sangue in
EDTA e urine possono essere
conservati a 4°C fino a 72 ore.
Raccogliere subito siero,
plasma, e urine per i test
sierologici e molecolari.
Compilare sempre la scheda,
indicando sempre:
-Data inizio sintomi
-Sintomi
-Paesi visitati
-Vaccinazioni pregresse
-Eventuali precedenti risultati di
laboratorio.
-Segnalare se NON sono stati eseguiti
test di primo livello.
-Info medico richiedente.
Inviare sempre i seguenti campioni:
-Almeno 1 provetta di sangue per
sierologia
-Almeno 1 provetta di sangue intero
in EDTA
-Un campione di urina in contenitore
sterile.
Inviare sempre un campione di siero
a distanza di 15-20 giorni per i
pazienti DENV RNA-negativi (per test
di neutralizzazione).
Laboratorio di riferimento regionale
UOC Microbiologia e Virologia - Azienda Ospedaliera di Padova
Per migliorare la diagnosi laboratoristica e la conferma dei casi è
utile centralizzare i test presso il Laboratorio di Rifermento
Regionale (come per es. in Emilia-Romagna e altri Paesi
Europei).
– Approccio diagnostico integrato per la conferma rapida dei casi.
– Personale altamente qualificato con ampia esperienza e capacità di set-up
rapido di nuovi test diagnostici.
– Tempi rapidi di riposta (6 - 48 ore dal ricevimento del campione)
– Costi contenuti grazie all’esecuzione di test “in house”.
– No costi aggiuntivi per il trasporto dei campioni (si eseguono già
routinariamente test diagnostici per tutti gli ospedali del Veneto).
– Elevata qualità delle prestazioni (unico laboratorio clinico italiano
accreditato ISO 15189).
– Partecipazione regolare a VEQ e network per diagnostica di infezioni
emergenti (WNV, DENV, Hantavirus, CCHFV, influenza virus,
coronavirus, etc.)
– Laboratorio BSL3 per colture virali.
– Disponibili test per la diagnosi differenziale.
diagnosi positivi pd non da
proiettare
WNV IgM tutti pos
WNV IgG 80% pos
16 liquor neuroinvasiva
WNV IgM tutti pos
WNV 44% IgG pos
Interferenti infez da altri flaviv mono inf cmv
malaria
Confermati con prnt
WNV Rna non da proiettare
Plasma - positivo
33% dei pazienti con malattia neuroinvasiva
20% dei pazienti con febbre
Urina più sensibile
RT-PCR rileva la presenza per tempi più lunghi anche
un mese dall’esordio dei sintomi ; carica virale 30X
• RNA pos coltura