Progetto di ricerca: “Studio del ruolo dei microRNA e delle cellule staminali tumorali nell’osteosarcoma umano” Responsabile: Prof.ssa Maria Luisa Brandi Background e razionale del progetto L’osteosarcoma è la più comune neoplasia maligna ossea che colpisce ogni anno 6 giovani ed adolescenti e 2 adulti ogni milione di persone. Gli osteosarcomi sono tumori molto aggressivi, e, nonostante i trattamenti disponibili siano migliorati negli ultimi anni, la sopravvivenza a 5 anni rimane inferiore al 55% con circa il 90% dei pazienti che presenta micro metastasi alla diagnosi. Oggi l’osteosarcoma rimane la seconda causa di morte tra i tumori che colpiscono i bambini e gli adolescenti e quindi c’è una grande necessità di sviluppare quanto prima nuove terapie per ridurre la morbilità e la mortalità dei pazienti affetti. Terapie molecolari specifiche dirette contro le molecole coinvolte nella tumorigenesi dell’osteosarcoma potrebbero rappresentare nuovi potenziali efficaci trattamenti per questa aggressiva neoplasia. La complessa instabilità genomica dell’osteosarcoma, la presenza in questo tumore di un ampio spettro di alterazioni genetiche ed epigenetiche e la rarità dei campioni biologici disponibili per le ricerche scientifiche hanno fino ad oggi reso difficoltosa l’identificazione delle cause che predispongono allo sviluppo di osteosarcoma. Recenti evidenze sperimentali sembrano sempre più suggerire che l’osteosarcoma origini dalle cellule staminali mesenchimali (MSCs) attraverso una serie di variazioni genetiche ed epigenetiche che in ultima analisi risultano nella perdita della differenziazione osteoblastica terminale. Recentemente cellule staminali tumorali (CSCs) con caratteristiche tipiche delle cellule MSC preosteoblastiche sono state scoperte nell’osteosarcoma. La teoria delle cellule staminali tumorali afferma che nei tumori esista una piccola sottopopolazione di cellule staminali, denominate CSCs, che hanno la capacità di auto-rinnovarsi, di differenziare e che costituiscono il nucleo del tumore. Queste cellule hanno le stesse caratteristiche delle cellule staminali normali e possono originarsi dalla trasformazione in senso maligno di cellule staminali pre-esistenti o da alterazioni genetiche ed epigenetiche che inducono la dedifferenziazione e la riacquisizione delle caratteristiche di staminalità da parte di cellule differenziate. Le CSCs sono responsabili della crescita del tumore e, se non completamente eliminate con la chirurgia o con la chemio- o la radioterapia, possono dare origine a recidive o metastasi. Inoltre, le CSCs sono fortemente sospettate di essere le responsabili della resistenza di molti tumori, come ad esempio l’osteosarcoma, alla chemio- ed alla radioterapia. Caratteristiche tipiche di queste cellule, quali la quiescenza, l’aumentata capacità di riparare i danni al DNA e la notevole resistenza all’apoptosi sono tra i fattori responsabili della loro resistenza alle attuali terapie anti-cancro. Dopo la chemio- o la radioterapia le CSCs possono sopravvivere, crescere, differenziarsi e formare un nuovo tumore primario o dare origine a metastasi. Quindi disegnare terapie mirate specifiche contro queste cellule è indispensabile per l’eradicazione completa e definitiva dei tumori. Gli osteosarcomi, in particolare, sono tumori estremamente resistenti alle attuali terapie anti-tumorali, anche quelle particolarmente aggressive, e questo fa sospettare un ruolo importante delle CSCs nel loro sviluppo e nella loro enorme malignità e recidività. Individuare le CSCs all’interno degli osteosarcomi e riconoscere le molecole che caratterizzano queste cellule sarà utile per disegnare terapie mirate all’eliminazione di queste cellule tumorali ma non delle cellule staminali normali del tessuto. Recentemente una popolazione di CSCs, caratterizzate dall’espressione dei marcatori di superficie tipici delle MSCs ossee e dall’espressione di Oct 3/4 e Nanog due fattori di trascrizione tipici delle cellule staminali embrionali (ESCs), è stata identificata nell’osteosarcoma. L’espressione, da parte di queste cellule, di Oct 3/4 e Nanog suggerisce che questi due fattori possano avere un ruolo importante nel mantenimento delle loro capacità staminali e di conseguenza nello sviluppo dell’osteosarcoma. L’identificazione dei fattori che regolano l’espressione di tali geni (i.e. microRNAs) associati al fenotipo staminale delle cellule CSCs nell’osteosarcoma potrebbe aiutare a comprendere i meccanismi che regolano la tumorigenesi in questa neoplasia ossea. Tutte queste molecole potrebbero rivelarsi utili marcatori diagnostici o prognostici ed anche importanti bersagli molecolari per lo sviluppo di terapie mirate a colpire le cellule CSCs non-proliferanti e resistenti alle attuali terapie anti-cancro. Obbiettivi dello studio Il presente progetto ha come scopo principale quello di identificare le CSCs all’interno del tessuto di osteosarcoma umano, isolarle e metterle in coltura al fine di poterne studiare le caratteristiche cellulari e molecolari ed individuare caratteristiche peculiari e/o marcatori genetici e molecolari che le contraddistinguano dalle altre cellule dell’osteosarcoma e che possano quindi essere utilizzati quali possibili bersagli molecolari per il futuro disegno di terapie, geniche e/o basate sull’RNA, mirate contro le CSCs. Nello specifico obbiettivi generali dello studio sono: A) Raccolta di campioni umani di osteosarcoma da soggetti donatori che si siano sottoposti a resezione chirurgica di tale tumore B) Localizzazione delle nicchie di CSCs all’interno del tessuto di osteosarcoma mediante marcatura immunoistochimica al fine di verificare una eventuale loro peculiare distribuzione nel tessuto tumorale stesso C) Isolamento e messa in coltura di linee cellulari staminali tumorali da osteosarcomi umani per essere utilizzate per studiare il ruolo di queste cellule nello sviluppo, malignità e recidività di questa neoplasia. Caratterizzazione del fenotipo staminale mediante: 1) valutazione della capacità di crescita in sarcosfere; 2) analisi di espressione dei marcatori di staminalità D) Analisi del profilo di espressione dei microRNA (miRNA) e successive analisi funzionali di tali miRNA, nelle linee cellulari di CSCs isolate da osteosarcoma, per l’identificazione di eventuali miRNA coinvolti nella staminalità cellulare che potranno rivelarsi possibili nuovi bersagli molecolari per il disegno di nuove terapie di questa neoplasia. La Responsabile della Ricerca Prof.ssa Maria Luisa Brandi