protozoi ematici

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Plasmodi
protozoi ematici
Trypanosomi
Tec. Maria Gobbo
Servizio Autonomo di Epidemiologia e
Laboratorio di Malattie Tropicali (SAELMT)
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In laboratorio:
ü Riconoscere la presenza del parassita
ü Definire la specie
• Plasmodium falciparum
• Plasmodium vivax
• Plasmodium ovale
• Plasmodium malariae
• Plasmodium knowlesi
ü Carica parassitaria
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Raccolta del campione
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OTTIMALE SANGUE SENZA ANTICOAGULANTE
l'anticoagulante potrebbe provocare modificazioni morfologiche dei
globuli rossi parassitati e dei parassiti stessi.
SANGUE VENOSO SENZA ANTICOAGULANTE
Preparare le gocce spesse e gli strisci sottili a partire dal prelievo di
sangue prima di farlo defluire in una provetta con l’anticoagulante
SANGUE VENOSO CON ANTICOAGULANTE
Quando i preparati non possono essere allestiti immediatamente, il
campione di sangue viene raccolto in una provetta contenente
l’anticoagulante. I preparati devono essere allestiti nel più breve
tempo possibile (massimo un’ora dal prelievo) pena
l’introduzione di possibili modificazioni morfologiche a carico dei
globuli rossi parassitati e del parassita stesso.
SANGUE CAPILLARE DAL POLPASTRELLO
Fare attenzione a non utilizzare sangue coagulato.
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Esami
Diagnosi parassitologica diretta
Emoscopia
Antigeni
PCR
ü Emoscopia convenzionale (G.S. e S.S.)
ü Colorazione dei preparati ematici con coloranti
fluorescenti
ü Quantitative Buffy Coat (QBC)
centrifugazione/colorazione fluorocromica
ü Test rapidi (metodi immuno-cromatografici)
ü Ibridazione con sonde di DNA
Diagnosi parassitologica indiretta
Anticorpi
ü Sierologia (IHA, IF, ELISA)
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Diagnosi parassitologica diretta
Emoscopia convenzionale
la Goccia Spessa
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Emoscopia convenzionale
lo Striscio Sottile
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Emoscopia convenzionale
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Colorazione: Giemsa, Field, M.G.-G.
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Colorazione
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LETTURA DEI PREPARATI
Goccia spessa: positivo/negativo
Striscio sottile: diagnosi di specie
Indice di parassitemia: gravità
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INDICE DI PARASSITEMIA
Su goccia spessa
Quando ……
ci sono pochi parassiti
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INDICE DI PARASSITEMIA
Su goccia spessa
Quando ……
Su striscio sottile
Quando……
il numero di parassiti e tale che la loro conta
risulta essere molto imprecisa
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INDICE DI PARASSITEMIA
Su goccia spessa
Quando ……
Su striscio sottile
Quando……
Indice di gravità: >= 5%
>= 250.000 parassiti/µl
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emazia
granulazioni
Emazia parassitata
parassita
nucleo
pigmento
vacuolo
citoplasma
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LE FORME DEL PARASSITA
Trofozoite
Gametocita
Schizonte
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Emoscopia convenzionale
(goccia spessa e striscio sottile)
Pro
CNecessità di microscopio ottico
CRelativamente rapido, poco
C
C
C
costoso (ma…tempo
dell’operatore)
Possibilità di diagnosi di specie
Stima quantitativa della
parassitemia
Riconoscimento delle diverse
forme di sviluppo del parassita
Contro
DNecessità di un
operatore esperto
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Quantitative buffy coat (QBC)
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Sensibilità e specificità del QBC® nella diagnosi
di malaria a bassa parassitemia (< 10 parassiti/µl)
comparati all’emoscopia convenzionale
Sensibilità
QBC®
98%
Specificità
100%
Trop.Med. 1995, Z. Bisoffi
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Quantitative buffy coat (QBC)
pro
CRapida esecuzione
CDiagnosi rapida
CStima quantitativa
della parassitemia
contro
D Equipaggiamento
D
D
D
D
specifico
Necessità di microscopio
a fluorescenza
Relativamente costoso
Non differenziazione
delle specie
Difficile riconoscimento
diverse forme di sviluppo
del parassita
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Test immunocromatografico
3 antigeni:
- una proteina ricca di istidina 2 di P. falciparum (PfHRP2 );
- Plasmodium aldolasi;
- il lattato deidrogenasi parassita specifico (pLDH).
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3 antigeni:
Istidina proteina ricca di 2 P. falciparum (PfHRP2) è una proteina
solubile in acqua che viene prodotta dagli stadi asessuali e
gametociti di P. falciparum, espressa sulla superficie della
membrana eritrocitaria.
Si è dimostrato che questo antigene può rimanere nel sangue per
almeno 28 giorni dopo l'inizio della terapia antimalarica (antigene
libero o complessi antigene-anticorpo).
Plasmodium aldolasi è un enzima della via glicolitica espresso
dalle quattro specie di plasmodi.
Lattato deidrogenasi parassita (pLDH) è un enzima glicolitico
solubile prodotto dagli stadi asessuali e sessuali dei parassiti vivi
ed è presente e rilasciato dagli eritrociti parassiti infetti. E 'stato
trovato in tutti e 4 i tipi di malaria umana ed esistono per
ciascuna delle quattro specie differenti isomeri di pLDH.
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Test immunocromatografico
pro
C Elevata sensibilità e specificità
C Semplicità e rapidità di
C
C
esecuzione
Non necessità di strumenti di
laboratorio
Conservazione a temperatura
ambiente
contro
D Non permettono di ottenere
D
D
D
informazioni quantitative e
sugli stadi del parassita
Antigenemia permanente
dopo trattamento nelle
infezioni ad alte cariche
Possibile cross-reazione
dell’ PfHRP2 con le altre
specie
Possibilià di falsi negativi a
cariche parassitarie elevate
(effetto prozona)
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Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR
Sensibilità
Specificità
100%
100%
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Polymerase Chain Reaction (PCR)
pro
C Elevata sensibilità e
C
C
specificità
Studio del polimorfismo
genico
Studio chemioresistenze
contro
D Non rapidità di esecuzione
D Necessità di ambienti,
D
D
strumentazione appositi
Necessità di un operatore
esperto
Alto costo
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Diagnosi parassitologica indiretta
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Metodi sierologici
Ricerca di anticorpi anti-P. falciparum
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Metodi sierologici
pro
C Diagnosi in condizioni cliniche
C
particolari ( paludismo viscerale
cronico)
Utilizzo in indagini
epidemiologiche e/o screening di
donatori di sangue
contro
D Non permette diagnosi
D
rapida
Rivelano solo anticorpi
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MALARIA
Caratteristiche di un metodo per
la conferma diagnostica
C Rapidità
C Sensibilità
C Specificità
C facilità di esecuzione ed
C
interpretazione
Basso costo
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G.S./S.S.
QBC
ICT
PCR
• rapidità
• rapidità
• rapidità
• rapidità
• sensibilità
• sensibilità
• sensibilità
• sensibilità
• specificità
• specificità
• specificità
• specificità
• facilità di
esecuzione ed
interpretazione
• facilità di
• facilità di
esecuzione ed
esecuzione ed
interpretazione interpretazione
• facilità di
esecuzione ed
interpretazione
• basso costo
• basso costo
• basso costo
• basso costo
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Trypanosomi
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DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA
T. brucei gambiense
T. brucei rhodesiense
T. cruzi
T. rangeli??
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Tripanosoma nell’uomo
Forma Trypomastigote
Cinetoplasto
Flagello
Blefaroplasto
Membrana ondulante
Nucleo
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Metodi diagnostici
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T.b.rhodesiense: fase acuta
T.b. gambiense:
T. cruzi:
T. rangeli:
esame diretto sangue periferico o liquor
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Esame diretto
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T.b. gambiense / T.b. rhodesiense
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T.b.rhodesiense: fase acuta
fase acuta
T.b. gambiense:
T. cruzi:
T. rangeli:
esame diretto sangue periferico o liquor
esame diretto sangue periferico o
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Esame diretto
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T.b. gambiense / T.b. rhodesiense
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T.b.rhodesiense: fase acuta
fase acuta
T.b. gambiense:
T. cruzi:
T. rangeli:
esame diretto sangue periferico o liquor
esame diretto sangue periferico o
ricerca con MHT
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Metodi diagnostici
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T.b.rhodesiense: fase acuta
fase acuta
esame diretto sangue periferico o liquor
esame diretto sangue periferico o
ricerca con MHT
T.b. gambiense:
fase cronica
T. cruzi:
T. rangeli:
sierologia,
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I.H.A.
C.A.T.
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T.b.rhodesiense: fase acuta
esame diretto sangue periferico o liquor
fase acuta
esame diretto sangue periferico o
ricerca con MHT
fase cronica
sierologia, ricerca con MHT,
tripla centrifugazione o ricerca in linfonodo
T.b. gambiense:
T. cruzi:
T. rangeli:
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Metodi diagnostici
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T.b.rhodesiense: fase acuta
esame diretto sangue periferico o liquor
fase acuta
esame diretto sangue periferico o
ricerca con MHT
fase cronica
sierologia, ricerca con MHT,
tripla centrifugazione o ricerca in linfonodo
fase acuta
esame diretto cute, in sangue periferico o
con MHT
T.b. gambiense:
T. cruzi:
T. rangeli:
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Esame diretto sangue periferico
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Trypanosoma cruzi
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T.b.rhodesiense: fase acuta
esame diretto sangue periferico o liquor
fase acuta
esame diretto sangue periferico o
ricerca con MHT
fase cronica
sierologia, ricerca con MHT,
tripla centrifugazione o ricerca in linfonodo
fase acuta
esame diretto cute, in sangue periferico o
con MHT
T.b. gambiense:
T. cruzi:
fase cronica
T. rangeli:
sierologia,
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T.b.rhodesiense: fase acuta
esame diretto sangue periferico o liquor
fase acuta
esame diretto sangue periferico o
ricerca con MHT
fase cronica
sierologia, ricerca con MHT,
tripla centrifugazione o ricerca in linfonodo
fase acuta
esame diretto cute, in sangue periferico o
con MHT
T.b. gambiense:
T. cruzi:
fase cronica
T. rangeli:
sierologia, ricerca con MHT,
PCR o esame istologico
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PCR
Amastigoti in muscolo cardiaco
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esame diretto sangue periferico o liquor
fase acuta
esame diretto sangue periferico o
ricerca con MHT
fase cronica
sierologia, ricerca con MHT,
tripla centrifugazione o ricerca in linfonodo
fase acuta
esame diretto cute, in sangue periferico o
con MHT
T.b. gambiense:
T. cruzi:
fase cronica
T. rangeli:
sierologia, ricerca con MHT,
PCR
o esame istologico
esame diretto sangue periferico
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