Quali sono gli argomenti di cui si occupa la
BIOFISICA?
BIOFISICA TEORICA: MODELLI
ACIDI NUCLEICI E RIBOSOMI
BIOENERGETICA
STRUTTURA PROTEICA DINAMICA E FUNZIONE
CANALI IONICI
BIOFISICA DELLA SINGOLA MOLECOLA
STRUTTURA E DINAMICHE DELLE MEMBRANE
INTERAZIONI LIPIDI-PROTEINE
AGGREGAZIONI DI MACROMOLECOLE
BIOFISICA CELLULARE
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Biofisica
La struttura delle biomolecole è un
argomento di grande interesse per molti
settori della ricerca di base e applicativa
Conoscere la struttura delle macromolecole biologiche è fondamentale
per capire la loro funzione e quindi per conoscere il meccanismo dei
processi biologici.
La fisica fornisce metodi teorici (computazionali) e approcci sperimentali
molto potenti per indagare la struttura delle macromolecole biologiche.
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Biofisica
Le più importanti tecniche sperimentali e
teoriche per l’analisi delle strutture di
macromolecole
Microscopie
Spettroscopie
Difrattometria ai raggi X
Modellistica molecolare
Simulazioni di dinamica molecolare
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Biofisica
Di che cosa trattiamo?
Brevi cenni sulla struttura delle macromolecole biologiche più importanti:
Proteine;
Come si affronta dal punto di vista fisico il problema della risoluzione di
strutture complesse;
Quale è il contributo dell’analisi informatica per la comprensione della
struttura e funzione;
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Biofisica
La complessità della vita richiede che molte
biomolecole siano di grande dimensioni
DNA che caratterizza un cromosoma umano: peso molecolare di circa 1012
daltons, lunghezza totale circa 10 cm. La lunghezza totale del DNA umano
esteso è di circa 2 m.
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Biofisica
Un semplice organismo unicellulare come l’ Escherichia Coli ha un
DNA con un peso molecolare di circa 109 daltons.
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Biofisica
Le proteine e gli acidi nucleici sono polimeri
Le macromolecole sono costruite collegando insieme unità strutturali definite
MONOMERI. Essi sono etero polimeri caratterizzati rispettivamente da 4 e
20 unità strutturali.
Proteine:
Acidi nucleici
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20 amminoacidi
4 basi nucleotidiche
Biofisica
Le proteine sono più piccole ma il loro grado di
complessità è comunque molto alto
La
mioglobina
di
capodoglio:
la
prima
struttura tridimensionale
risolta con la diffrazione
ai raggi X
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Biofisica
LE PROTEINE (dal greco protos: principale) SONO LE MACROMOLECOLE
PIU’ ABBONDANTI E SVOLGONO SVARIATE FUNZIONI:
a) la luce prodotta dalle lucciole coinvolge la proteina luciferina;
b) gli eritrociti contengono la proteina emoglobina che trasporta
l’ossigeno;
c) la proteina cheratina è il componente strutturale dei capelli, squame,
corna, lana, unghie etc.
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Biofisica
Le proteine hanno dimensioni molto variabili
Possono essere ad una sola subunità o a più subunità
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Biofisica
Contengono 20 amminoacidi uniti tramite un
legame “peptidico”covalente
Amminoacido
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Il legame peptidico
Biofisica
La sequenza degli amminoacidi costituisce la
struttura primaria
Ogni pallina corrisponde ad un ammino acido:
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Biofisica
Le strutture primarie a confronto: mioglobina
(Mb) di capodoglio e di uomo.
Le sequenze delle due Mb sono molto
simili;
Anche le strutture tridimensionale
sono molto simili;
La funzione fisiologica è la stessa: il
legame con l’ossigeno;
L’evoluzione ha proceduto per molti
milioni di anni, ma capodoglio e uomo
hanno avuto un comune antenato;
Le proteine evolvono cambiando la loro
sequenza.
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Biofisica
Dalla sequenza è facile definire la composizione
amminoacidica
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Biofisica
Altri gruppi chimici caratterizzano le proteine
coniugate
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Biofisica
Le proteine hanno diversi livelli di struttura
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Biofisica
La struttura secondaria si riferisce ad alcune
parti di un polipeptide
Atsbury (1930) con i primi studi di diffrazione ai raggi X dimostrò che la
proteina fibrosa α cheratina, di cui sono fatti i capelli, aveva una
struttura regolare che si ripeteva ogni 5.12 Å (Angstrom: 0.1 nm)
Nel 1950 Pauling e Corey analizzarono le possibili conformazioni regolari
di una catena polipetidica secondo questi principi:
Minor distorsione possibile dei legami chimici
La planarità del legame peptidico
Formazione di molti legami non covalenti: idrogeno
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Biofisica
La più semplice disposizione che può assumere
una catena polipetidica: α elica
MODELLO A PALLE E BASTONCINI
a)
b)
c)
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Elica destrorsa,
Si evidenziano i legami idrogeno
Il passo dell’elica è 5.4 Å o 3.6
residui amminoacidici
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Modelli di α elica
Nelle proteine gli ammino acidi sono D e
le eliche sono in larga misura destrorse
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Biofisica
La struttura foglietto β :
I legami idrogeno si formano tra segmenti adiacenti;
I segmenti adiacenti possono anche essere lontani nella
sequenza amminoacidica;
Le catene possono essere parallele o antiparallele
I residui laterali R sporgono al di fuori della struttura a
zig zag in modo alternato
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Biofisica
La struttura terziaria analizza il “folding” di
una singola catena polipeptica o di una parte di
catena (dominio)
α eliche e β sheets, unità di struttura secondaria, si assemblano (folding)
in una particolare conformazione proteica
il dominio è l’unità della struttura terziaria
Nelle proteine a più domini la struttura terziaria include l’assemblaggio di
più domini
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Biofisica
C’è una classificazione delle strutture
terziarie in base alla loro topologia: alcuni
esempi semplici
Proteine con predominanza
di α elica
Proteine con predominanza
di β sheets
Proteine miste
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Biofisica
Proteine con predominanza di α elica
Due eliche antiparallele + un loop
Rna binding protein ROP: 63 residui
(proteina estratta da plasmidi)
Quattro eliche antiparallele + tre loops
Mioemeritrina
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Biofisica
altri esempi:
Citocromo c’
Citocromo b-562
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Tipologie β: β sandwich
Due foglietti β impacchettati l’uno di fronte all’altro
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Biofisica
Tipologie β: β barrel
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Biofisica
Proteine con α eliche + β sheets
Placental ribonuclease inhibitor
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Biofisica
La struttura quaternaria delle proteine
La struttura quaternaria riguarda proteine multimeriche costituite da più
catene polipeptidiche o da più domini strutturali. Le proteine regolatrici
hanno spesso più subunità. Le interazioni tra le subunità consentono grandi
variazioni nell’attività catalitica .
Esempio: la emoglobina
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Biofisica
Il problema del “folding”: che cosa determina la
struttura tridimensionale delle proteine?
In genere la sequenza amminoacidica contiene la
informazione completa per il raggiungimento
della struttura funzionale
Se si provoca mediante agenti chimico-fisici la
distruzione della struttura di una proteina
(unfolding) si ottiene una struttura disordinata
detta “random coil”
In alcuni casi il recupero della struttura nativa
è possibile semplicemente ripristinando le
condizioni sperimentali originali
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Biofisica
Le interazioni non covalenti che partecipano
nella
definizione
della
struttura
delle
biomolecole
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Biofisica
Il paradosso di Levinthal
Se consideriamo che ogni residuo amminoacidico abbia 10
conformazioni diverse, una ipotetica proteina con 100 amminoacidi
può, in linea teorica, assumere 10100 conformazioni.
Se il tempo per analizzare la singola conformazione fosse molto breve
(10-13 s), il tempo necessario per analizzare tutte le conformazioni
sarebbe dell’ordine di 1077 anni
Quindi il processo di ripiegamento non può essere un processo
casuale: DEVE PER FORZA ESISTERE UNA SCORCIATOIA
Il “folding” procede attraverso un limitato set di conformazioni
intermedie metastabili (modello sequenziale) o con la formazione di
un collasso idrofobico (molten globule).
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Biofisica
Termodinamica del folding visto come imbuto di
energia libera
Scendendo verso il basso si
ha una diminuzione delle
specie
Si raggiunge il minimo
energetico
percorrendo
anche strade diverse
Ogni minimo corrisponde a
stati intermedi metastabili
Le interazioni idrofobiche
di
residui
non
polari
provocano
il “collasso
idrofobico”
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Biofisica
Molte malattie sono dovute al difettoso
ripiegamento di una proteina
Alcune patologie derivano da proteine che non sono in grado di
raggiungere la loro struttura funzionale e che tendono a formare
grossi aggregati (fibrille o forme amiloidi): Alzheimer, Parkinson,
encefalopatia spongiforme, diabete di tipo II.
In altri casi mutazioni puntiformi generano proteine che non
raggiungono laloro locazione finale o che non sono più in grado di
svolgere la loro funzione perché icapaci di legare i loro substrati:
fibrosi cistica
Fibrosi cistica: difetto nella proteina transmembrana che agisce come
un canale degli ioni cloro (CFTR). La mutazione più comune è la
delezione di un amminoacido (Phe 508) e la proteina mutata non si
avvolge correttamente
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Biofisica
Come si studiano le strutture tridimensionali delle
macromolecole: diffrattometria ai raggi X
Tecnica fisica molto potente per risolvere le strutture solide regolari
(cristalline)
In fisica con il termine cristallo si intende una struttura atomica
ordinata
In un solido cristallino gli atomi sono disposti in modo regolare nello
spazio reticolo geometrico
Cristallo di pirite
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Biofisica
In un cristallo l’unità ripetente può essere un
atomo o una molecola
NaCl
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nei cristalli di Ferro
l’unità è un singolo
atomo,
nel sale da cucina NaCl
sono due atomi,
in laboratorio si possono
realizzare cristalli in cui
l’unità ripetente è una
macromolecola biologica
costituita da migliaia di
atomi
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Biofisica
Come si determina la struttura dei cristalli?
Le distanze tra atomi in un solido cristallino sono dell’ordine di 0.1 nm
paragonabili con le lunghezze d’onda dei raggi X (da 0.07 a 0.15 nm);
L’interferenza dei raggi X che vengono deviati dagli atomi porta ad
un fenomeno generale chiamato diffrazione
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Biofisica
La diffrazione
Se posizioniamo due oggetti nel cammino di un fronte di
onda ognuno devia (scattering) la luce generando due fronti
d’onda sferici
DIFFRAZIONE: in alcune posizioni dello spazio si ha
interferenza positiva (onde in fase) in altre interferenza
negativa (onde fuori fase)
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Biofisica
Dalla diffrazione alla distanza interatomica
Se si fanno diverse osservazioni delle ampiezze dei nuovi fronti
d’onda a differenti angoli di incidenza e con diverse orientazioni
SI POSSONO OTTENERE LE POSIZIONI DEGLI OGGETTI A
EB
LA LEGGE DI BRAGG BEN CHIARISCE IL RAPPORTO TRA
POSIZIONI DEGLI ATOMI E LA DIFFRAZIONE.
Nella trattazione semplice si considera solo la riflessione del
raggio incidente, ma considerazioni analoghe posssono essere
fatte considerando lo scattering su tutto l’angolo solido
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Biofisica
La legge di Bragg
L’interferenza costruttiva del fascio diffratto è possibile solo se è
soddisfatta la relazione di Bragg:
λ: lunghezza d’onda dei raggi X,
d: distanza tra i piani cristallini paralleli e
θ: l’angolo di incidenza dei raggi X rispetto i piani considerati
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Biofisica
Come si opera sperimentalmente
Cristallizzazione della macromolecola
Posizionamento del cristallo tra sorgente X e rivelatore
Mediante il movimento del cristallo si genera una serie ordinata di
macchie che rappresentano le riflessioni dei raggi X
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Biofisica
Dalla distribuzione complessiva delle macchie viene creata una
mappa di densità elettronica
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Biofisica
Si costruisce un modello per la struttura compatibile con le mappe di
densità elettronica
La diffrazione ai raggi X della mioglobina di capodoglio comporta circa
25000 macchie (riflessioni)
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Biofisica
Risonanza magnetica nucleare: NMR
I nuclei di alcuni atomi hanno numero di spin diverso da zero e si
comportano come piccoli magnetini ruotanti (1H, 31P, 15N, 13C etc).
Le macromolecole da studiare sono in soluzione
Si hanno informazioni anche sulla dinamica della struttura
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Biofisica
Il campo magnetico esterno
Quando questi nuclei sono posti in un campo magnetico ci sono due
possibili configurazioni una di bassa energia (a) e una di alta energia (b)
b)
a)
La differenza di energia tra i due stati è data da
E=hγB
dove h : cost di Plank, γ costante giromagnetica e B la forza del
campo magnetico esterno
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Biofisica
La radiazione elettromagnetica induce la
transizione
Se faccio incidere una radiazione elettromagnetica con con
frequenza ν la sua energia è E= hν. Quando la frequenza è uguale
a γB si ha risonanza e il magnetino inverte la sua polarità
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Biofisica
Due modi per ottenere la transizione
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Mantenendo fissa la frequenza (radiofrequenza) e modulando il
campo
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Il secondo modo
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Modulando la frequenza incidente e mantenendo fisso il campo
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Biofisica
Le informazioni dallo spettro NMR
La energia necessaria per avere assorbimento dipende fortemente dall’intorno
dell’atomo che può accoppiarsi con gli atomi vicini
Spettro NMR monodimensionale di una globina
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Biofisica
Gli spettri NMR bidimensionali
Per le macromolecole è necessario usare tecniche bidimensionali che
consentono di misurare con precisione accoppiamenti con atomi attraverso
lo spazio (Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY: NOESY) o attraverso i
legami covalenti (COherent SpectroscopY: COSY).
Il cambio di intensità di un segnale di un nucleo è ottenuto irraggiando un
nucleo vicinale. Questa interazione è dipendente dalla distanza (r-6)
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L’ interazioni 1 e 2 sono state determinate: in particolare la interazione 2 è
connessa alla vicinanza tra gli idrogeni di un metile della proteina e un idrogeno
dell’eme
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Biofisica
Queste informazioni
sono
tridimensionale della proteina
NMR
usate
per
costruire
la
struttura
Raggi X
Con NMR si ottengono delle famiglie di strutture: si hanno
informazioni sulla dinamica delle macromolecole
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