file - Dipartimento di Scienze Matematiche, Fisiche e
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Quali sono gli argomenti di cui si occupa la BIOFISICA? BIOFISICA TEORICA: MODELLI ACIDI NUCLEICI E RIBOSOMI BIOENERGETICA STRUTTURA PROTEICA DINAMICA E FUNZIONE CANALI IONICI BIOFISICA DELLA SINGOLA MOLECOLA STRUTTURA E DINAMICHE DELLE MEMBRANE INTERAZIONI LIPIDI-PROTEINE AGGREGAZIONI DI MACROMOLECOLE BIOFISICA CELLULARE fisica24ore Biofisica La struttura delle biomolecole è un argomento di grande interesse per molti settori della ricerca di base e applicativa Conoscere la struttura delle macromolecole biologiche è fondamentale per capire la loro funzione e quindi per conoscere il meccanismo dei processi biologici. La fisica fornisce metodi teorici (computazionali) e approcci sperimentali molto potenti per indagare la struttura delle macromolecole biologiche. fisica24ore Biofisica Le più importanti tecniche sperimentali e teoriche per l’analisi delle strutture di macromolecole Microscopie Spettroscopie Difrattometria ai raggi X Modellistica molecolare Simulazioni di dinamica molecolare fisica24ore Biofisica Di che cosa trattiamo? Brevi cenni sulla struttura delle macromolecole biologiche più importanti: Proteine; Come si affronta dal punto di vista fisico il problema della risoluzione di strutture complesse; Quale è il contributo dell’analisi informatica per la comprensione della struttura e funzione; fisica24ore Biofisica La complessità della vita richiede che molte biomolecole siano di grande dimensioni DNA che caratterizza un cromosoma umano: peso molecolare di circa 1012 daltons, lunghezza totale circa 10 cm. La lunghezza totale del DNA umano esteso è di circa 2 m. fisica24ore Biofisica Un semplice organismo unicellulare come l’ Escherichia Coli ha un DNA con un peso molecolare di circa 109 daltons. fisica24ore Biofisica Le proteine e gli acidi nucleici sono polimeri Le macromolecole sono costruite collegando insieme unità strutturali definite MONOMERI. Essi sono etero polimeri caratterizzati rispettivamente da 4 e 20 unità strutturali. Proteine: Acidi nucleici fisica24ore 20 amminoacidi 4 basi nucleotidiche Biofisica Le proteine sono più piccole ma il loro grado di complessità è comunque molto alto La mioglobina di capodoglio: la prima struttura tridimensionale risolta con la diffrazione ai raggi X fisica24ore Biofisica LE PROTEINE (dal greco protos: principale) SONO LE MACROMOLECOLE PIU’ ABBONDANTI E SVOLGONO SVARIATE FUNZIONI: a) la luce prodotta dalle lucciole coinvolge la proteina luciferina; b) gli eritrociti contengono la proteina emoglobina che trasporta l’ossigeno; c) la proteina cheratina è il componente strutturale dei capelli, squame, corna, lana, unghie etc. fisica24ore Biofisica Le proteine hanno dimensioni molto variabili Possono essere ad una sola subunità o a più subunità fisica24ore Biofisica Contengono 20 amminoacidi uniti tramite un legame “peptidico”covalente Amminoacido fisica24ore Il legame peptidico Biofisica La sequenza degli amminoacidi costituisce la struttura primaria Ogni pallina corrisponde ad un ammino acido: fisica24ore Biofisica Le strutture primarie a confronto: mioglobina (Mb) di capodoglio e di uomo. Le sequenze delle due Mb sono molto simili; Anche le strutture tridimensionale sono molto simili; La funzione fisiologica è la stessa: il legame con l’ossigeno; L’evoluzione ha proceduto per molti milioni di anni, ma capodoglio e uomo hanno avuto un comune antenato; Le proteine evolvono cambiando la loro sequenza. fisica24ore Biofisica Dalla sequenza è facile definire la composizione amminoacidica fisica24ore Biofisica Altri gruppi chimici caratterizzano le proteine coniugate fisica24ore Biofisica Le proteine hanno diversi livelli di struttura fisica24ore Biofisica La struttura secondaria si riferisce ad alcune parti di un polipeptide Atsbury (1930) con i primi studi di diffrazione ai raggi X dimostrò che la proteina fibrosa α cheratina, di cui sono fatti i capelli, aveva una struttura regolare che si ripeteva ogni 5.12 Å (Angstrom: 0.1 nm) Nel 1950 Pauling e Corey analizzarono le possibili conformazioni regolari di una catena polipetidica secondo questi principi: Minor distorsione possibile dei legami chimici La planarità del legame peptidico Formazione di molti legami non covalenti: idrogeno fisica24ore Biofisica La più semplice disposizione che può assumere una catena polipetidica: α elica MODELLO A PALLE E BASTONCINI a) b) c) fisica24ore Elica destrorsa, Si evidenziano i legami idrogeno Il passo dell’elica è 5.4 Å o 3.6 residui amminoacidici Biofisica Modelli di α elica Nelle proteine gli ammino acidi sono D e le eliche sono in larga misura destrorse fisica24ore Biofisica La struttura foglietto β : I legami idrogeno si formano tra segmenti adiacenti; I segmenti adiacenti possono anche essere lontani nella sequenza amminoacidica; Le catene possono essere parallele o antiparallele I residui laterali R sporgono al di fuori della struttura a zig zag in modo alternato fisica24ore Biofisica La struttura terziaria analizza il “folding” di una singola catena polipeptica o di una parte di catena (dominio) α eliche e β sheets, unità di struttura secondaria, si assemblano (folding) in una particolare conformazione proteica il dominio è l’unità della struttura terziaria Nelle proteine a più domini la struttura terziaria include l’assemblaggio di più domini fisica24ore Biofisica C’è una classificazione delle strutture terziarie in base alla loro topologia: alcuni esempi semplici Proteine con predominanza di α elica Proteine con predominanza di β sheets Proteine miste fisica24ore Biofisica Proteine con predominanza di α elica Due eliche antiparallele + un loop Rna binding protein ROP: 63 residui (proteina estratta da plasmidi) Quattro eliche antiparallele + tre loops Mioemeritrina fisica24ore Biofisica altri esempi: Citocromo c’ Citocromo b-562 fisica24ore Biofisica Tipologie β: β sandwich Due foglietti β impacchettati l’uno di fronte all’altro fisica24ore Biofisica Tipologie β: β barrel fisica24ore Biofisica Proteine con α eliche + β sheets Placental ribonuclease inhibitor fisica24ore Biofisica La struttura quaternaria delle proteine La struttura quaternaria riguarda proteine multimeriche costituite da più catene polipeptidiche o da più domini strutturali. Le proteine regolatrici hanno spesso più subunità. Le interazioni tra le subunità consentono grandi variazioni nell’attività catalitica . Esempio: la emoglobina fisica24ore Biofisica Il problema del “folding”: che cosa determina la struttura tridimensionale delle proteine? In genere la sequenza amminoacidica contiene la informazione completa per il raggiungimento della struttura funzionale Se si provoca mediante agenti chimico-fisici la distruzione della struttura di una proteina (unfolding) si ottiene una struttura disordinata detta “random coil” In alcuni casi il recupero della struttura nativa è possibile semplicemente ripristinando le condizioni sperimentali originali fisica24ore Biofisica Le interazioni non covalenti che partecipano nella definizione della struttura delle biomolecole fisica24ore Biofisica Il paradosso di Levinthal Se consideriamo che ogni residuo amminoacidico abbia 10 conformazioni diverse, una ipotetica proteina con 100 amminoacidi può, in linea teorica, assumere 10100 conformazioni. Se il tempo per analizzare la singola conformazione fosse molto breve (10-13 s), il tempo necessario per analizzare tutte le conformazioni sarebbe dell’ordine di 1077 anni Quindi il processo di ripiegamento non può essere un processo casuale: DEVE PER FORZA ESISTERE UNA SCORCIATOIA Il “folding” procede attraverso un limitato set di conformazioni intermedie metastabili (modello sequenziale) o con la formazione di un collasso idrofobico (molten globule). fisica24ore Biofisica Termodinamica del folding visto come imbuto di energia libera Scendendo verso il basso si ha una diminuzione delle specie Si raggiunge il minimo energetico percorrendo anche strade diverse Ogni minimo corrisponde a stati intermedi metastabili Le interazioni idrofobiche di residui non polari provocano il “collasso idrofobico” fisica24ore Biofisica Molte malattie sono dovute al difettoso ripiegamento di una proteina Alcune patologie derivano da proteine che non sono in grado di raggiungere la loro struttura funzionale e che tendono a formare grossi aggregati (fibrille o forme amiloidi): Alzheimer, Parkinson, encefalopatia spongiforme, diabete di tipo II. In altri casi mutazioni puntiformi generano proteine che non raggiungono laloro locazione finale o che non sono più in grado di svolgere la loro funzione perché icapaci di legare i loro substrati: fibrosi cistica Fibrosi cistica: difetto nella proteina transmembrana che agisce come un canale degli ioni cloro (CFTR). La mutazione più comune è la delezione di un amminoacido (Phe 508) e la proteina mutata non si avvolge correttamente fisica24ore Biofisica Come si studiano le strutture tridimensionali delle macromolecole: diffrattometria ai raggi X Tecnica fisica molto potente per risolvere le strutture solide regolari (cristalline) In fisica con il termine cristallo si intende una struttura atomica ordinata In un solido cristallino gli atomi sono disposti in modo regolare nello spazio reticolo geometrico Cristallo di pirite fisica24ore Biofisica In un cristallo l’unità ripetente può essere un atomo o una molecola NaCl QuickTime™ and a Cinepak decompressor are needed to see this picture. nei cristalli di Ferro l’unità è un singolo atomo, nel sale da cucina NaCl sono due atomi, in laboratorio si possono realizzare cristalli in cui l’unità ripetente è una macromolecola biologica costituita da migliaia di atomi fisica24ore Biofisica Come si determina la struttura dei cristalli? Le distanze tra atomi in un solido cristallino sono dell’ordine di 0.1 nm paragonabili con le lunghezze d’onda dei raggi X (da 0.07 a 0.15 nm); L’interferenza dei raggi X che vengono deviati dagli atomi porta ad un fenomeno generale chiamato diffrazione fisica24ore Biofisica La diffrazione Se posizioniamo due oggetti nel cammino di un fronte di onda ognuno devia (scattering) la luce generando due fronti d’onda sferici DIFFRAZIONE: in alcune posizioni dello spazio si ha interferenza positiva (onde in fase) in altre interferenza negativa (onde fuori fase) fisica24ore Biofisica Dalla diffrazione alla distanza interatomica Se si fanno diverse osservazioni delle ampiezze dei nuovi fronti d’onda a differenti angoli di incidenza e con diverse orientazioni SI POSSONO OTTENERE LE POSIZIONI DEGLI OGGETTI A EB LA LEGGE DI BRAGG BEN CHIARISCE IL RAPPORTO TRA POSIZIONI DEGLI ATOMI E LA DIFFRAZIONE. Nella trattazione semplice si considera solo la riflessione del raggio incidente, ma considerazioni analoghe posssono essere fatte considerando lo scattering su tutto l’angolo solido fisica24ore Biofisica La legge di Bragg L’interferenza costruttiva del fascio diffratto è possibile solo se è soddisfatta la relazione di Bragg: λ: lunghezza d’onda dei raggi X, d: distanza tra i piani cristallini paralleli e θ: l’angolo di incidenza dei raggi X rispetto i piani considerati fisica24ore Biofisica Come si opera sperimentalmente Cristallizzazione della macromolecola Posizionamento del cristallo tra sorgente X e rivelatore Mediante il movimento del cristallo si genera una serie ordinata di macchie che rappresentano le riflessioni dei raggi X fisica24ore Biofisica Dalla distribuzione complessiva delle macchie viene creata una mappa di densità elettronica fisica24ore Biofisica Si costruisce un modello per la struttura compatibile con le mappe di densità elettronica La diffrazione ai raggi X della mioglobina di capodoglio comporta circa 25000 macchie (riflessioni) fisica24ore Biofisica Risonanza magnetica nucleare: NMR I nuclei di alcuni atomi hanno numero di spin diverso da zero e si comportano come piccoli magnetini ruotanti (1H, 31P, 15N, 13C etc). Le macromolecole da studiare sono in soluzione Si hanno informazioni anche sulla dinamica della struttura fisica24ore Biofisica Il campo magnetico esterno Quando questi nuclei sono posti in un campo magnetico ci sono due possibili configurazioni una di bassa energia (a) e una di alta energia (b) b) a) La differenza di energia tra i due stati è data da E=hγB dove h : cost di Plank, γ costante giromagnetica e B la forza del campo magnetico esterno fisica24ore Biofisica La radiazione elettromagnetica induce la transizione Se faccio incidere una radiazione elettromagnetica con con frequenza ν la sua energia è E= hν. Quando la frequenza è uguale a γB si ha risonanza e il magnetino inverte la sua polarità fisica24ore Biofisica Due modi per ottenere la transizione QuickTime™ and a GIF decompressor are needed to see this picture. Mantenendo fissa la frequenza (radiofrequenza) e modulando il campo fisica24ore Biofisica Il secondo modo QuickTime™ and a GIF decompressor are needed to see this picture. Modulando la frequenza incidente e mantenendo fisso il campo fisica24ore Biofisica Le informazioni dallo spettro NMR La energia necessaria per avere assorbimento dipende fortemente dall’intorno dell’atomo che può accoppiarsi con gli atomi vicini Spettro NMR monodimensionale di una globina fisica24ore Biofisica Gli spettri NMR bidimensionali Per le macromolecole è necessario usare tecniche bidimensionali che consentono di misurare con precisione accoppiamenti con atomi attraverso lo spazio (Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY: NOESY) o attraverso i legami covalenti (COherent SpectroscopY: COSY). Il cambio di intensità di un segnale di un nucleo è ottenuto irraggiando un nucleo vicinale. Questa interazione è dipendente dalla distanza (r-6) fisica24ore Biofisica L’ interazioni 1 e 2 sono state determinate: in particolare la interazione 2 è connessa alla vicinanza tra gli idrogeni di un metile della proteina e un idrogeno dell’eme fisica24ore Biofisica Queste informazioni sono tridimensionale della proteina NMR usate per costruire la struttura Raggi X Con NMR si ottengono delle famiglie di strutture: si hanno informazioni sulla dinamica delle macromolecole fisica24ore Biofisica QuickTime™ and a GIF decompressor are needed to see this picture. fisica24ore Biofisica
