Interazioni DNA-proteina
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Il dogma centrale della biologia
molecolare
Cell
DNA
Transcription
mRNA
Translation
Ribosome
Polypeptide
(protein)
L’ informazione per la sintesi delle proteine è contenuta nel DNA. La
trascrizione e la traduzione sono i processi attraverso cui l’ informazione
genetica è convertita in proteine. Il flusso dell’ informazione genetica è
unidirezionale, ovvero non passa mai dalle proteine agli acidi nucleici.
Trascrizione di RNA
DNA
TRASCRIZIONE
RNA
TRADUZIONE
PROTEINA
mRNA
rRNA
tRNA
RNA messaggero (mRNA) è lo stampo per la sintesi delle proteine
RNA ribosomale (rRNA) è il componente principale dei ribosomi
RNA transfer (tRNA) è coinvolto nel processo di traduzione
(trasporta amminoacidi in forma attivata sul ribosoma per la
formazione di un legame peptidico)
RNA transfer
(tRNA)
RNA ribosomiale (rRNA)
RNA messaggero
(mRNA)
The Prokaryotic
Need
to understandApparatus
the following:
Transcription
• Differenze tra replicazione e trascrizione
• Differenze tra DNA ed RNA polimerasi
• La RNA polimerasi di E. coli e la sua funzione
• Le sequenze che definiscono un promotore
• Gli step di inizio e di elongazione
• I due meccanismi di terminazione della trascrizione.
La trascrizione è molto simile alla replicazione
per quanto riguarda:
Meccanismo chimico
Direzione di sintesi
richiesta di uno stampo
La trascrizione differisce dalla replicazione perché:
Non richiede un primer
Interessa solo brevi segmenti della molecola di DNA
Nel tratto trascritto, uno solo dei filamenti funge da stampo
L’inizio della trascrizione avviene a livello di sequenze
specifiche (regione del promotore) riconosciute dalla RNA
polimerasi
L’RNA viene replicato dalle polimerasi
Gli enzimi che catalizzano la reazione sono le RNA polimerasi
Le RNA polimerasi richiedono:
● Uno stampo che generalmente è il DNA a doppia elica (ma anche a
singola elica). L’RNA non può essere utilizzato come stampo
● I substrati sono i NTP
● Mg2+ e Mn2+
La direzione di sintesi è 5’ → 3’
Le RNA polimerasi non richiedono innesco 3’-OH (primer)
A “Simple” Gene
Transcription
3’ Untranslated Region
Start Site
5’ Untranslated Region
5’
3’
Protein Coding Region
RNA Transcript
Promoter/
Control Region
Terminator
Sequence
•Promotori
- Sequenze di DNA che posizionano correttamente la RNAp rispetto al sito di inizio della
trascrizione di un gene.
•Terminatori
- Sequenze di DNA che specificano la terminazione della sintesi dell’
dell’ RNA ed inducono il rilascio
della RNAp dal DNA.
•Reazione (ordered series of steps)
1) Inizio.
Inizio.
2) Elongazione.
Elongazione.
3) Terminazione.
Terminazione.
Importanti convenzioni di
nomenclatura
Sito di inizio della
trascrizione
“Upstream”
5’
3’
“Downstream”
-5 -4 -3 -2 -1 +1 +2 +3 +4 +5 +6
3’
5’
Direzione di
trascrizione
Filamento
stampo
Non c’è “zero”
Una sola delle due catene di DNA viene
usata come stampo
La catena di DNA che viene
usata come stampo viene
chiamata catena antisenso o
non codificante.
La catena di DNA che non
funge da stampo viene
chiamata catena senso o
codificante
RNA polimerasi procariotica
Permette il riconoscimento
del promotore.
Si dissocia dall’oloenzima dopo
l’inizio della trascrizione
Responsabile dell’attività
polimerasica 5’ 3’
β' lega il DNA
β lega i NTPs
β e β ' costituiscono il sito attivo dell’enzima
α è essenziale per l’ assemblaggio e per l’ attivazione della RNAp da
parte delle proteine regolative.
σ riconosce sequenze promotrici sul DNA
Funzione del promotore:
indica l’inizio del gene che deve essere trascritto
La trascrizione produce più copie
dello stesso gene
Promotori
La trascrizione inizia ai siti promotori che legano
specificamente le RNA polimerasi
Proprietà dei Promotori
• I promotori consistono di una regione di 70
bp localizzata al 5’- del sito di inizio di
trascrizione
• Sono presenti due elementi consenso:
-La "-35 region", che possiede il consenso
TTGACA
-IL Pribnow box centrato a -10, che possiede
il consenso TATAAT. Questa regione è
ideale per lo svolgimento delle eliche.
Sequenze del filamento senso (codificante) di
alcuni promotori di E.coli
Importanti caratteristiche di un
promotore
• La “forza” del promotore è correlata alla maggiore o minore
similutidine delle sequenze che sono localizzate a -10 ed a -35
rispetto al “consensus”
• Un promotore forte viene trascritto ogni due secondi, mentre uno
debole viene trascritto ogni due minuti.
• La sequenza del tratto spacer (tra la regione -10 e a -35) non è
importante
• The lunghezza della sequenza spacer IS è importante:
TTGACA - spacer (16 to 19 base pairs) - TATAAT
• Spacers che sono più lunghi o più corti della lunghezza del
consenso diminuiscono la forza del promotore.
INIZIO DELLA TRASCRIZIONE
• La RNAP si lega non specificamente al DNA e con
bassa affinità e migra, alla ricerca di promotori.
• La subunità Sigma rende competente la RNAP a
riconoscere le sequenze promotrici
• L’ oloenzima RNAP ed il promotore formano il
“complesso chiuso”(DNA non svolto)
• La RNAP svolge il DNA di circa 17 coppie di basi per
formare il “complesso aperto”
• La trascrizione ha inizio all’ interno del complesso
aperto
Il processo di assemblaggio del core
dell’ enzima
α
α2
αΙ
αΙΙ
β
β’
σ70
+
vegetative
(principal σ)
α2β
α2ββ’
ββ = core enzyme
CORE ENZYME
L’ inizio della trascrizione è
aspecifico e sequenza
indipendente
σ32
heat shock
(for emergencies)
σ60
nitrogen starvation
(for emergencies)
SIGMA SUBUNIT
intercambiabile,
Preposta al
riconoscimento del
promotore
Elongazione
•
•
•
•
Core polymerase - no sigma
La RNAP è piuttosto accurata (only about 1 error
in 10,000 bases -not as accurate as DNAP III)
Tale frequenza di errore è compensata dal fatto
che per ogni gene vengono prodotte diverse
copie di trascritto
La velocità di elongazione è di circa 20-50 basi
per secondo – più lenta nelle regioni ricche in
G/C-rich e più veloce in qualsiasi altra regione
Le Topoisomerasi precedono and seguono la
RNAP per rimuovere lo stress torsionale dovuto ai
superavvolgimenti
L’ idrolisi del pirofosfato
rende la reazione di sintesi dell’ RNA
energeticamente favorita
Ibrido DNA-RNA (eteroduplex)
Le topoisomerasi rimuovono
i superavvolgimenti
L’RNA polimerasi non ha attività esonucleasica e quindi non può
effettuare “proofreading”
Frequenza di errore: 1 ogni 104-105 ribonucleotidi incorporati nell’RNA
Elevata processività
http://www.youtube.com/watch?v=Jqx4Y0OjWW4
Transcripcion.flv
Terminazione
Due meccanismi
1) Rho – Il fattore di terminazione
– rho è una elicasi ATP-dependente
– Si muove lungo il trascritto , trova la struttura “
a bolla”, svolge il DNA e rilascia la catena di
RNA
Rho-Dependent Transcription Termination
(depends on a protein AND a DNA sequence)
G/C -rich site
RNAP rallenta
Rho elicase
raggiunge la RNAP
Il complesso di elongazione si
disassembla
Terminazione
Two mechanisms
2) Rho-Independent
- I siti di terminazione si trovano sul DNA
– Sequenza ripetuta ed invertita, ricca in GC che
forma una struttura “stem and loop” sul
trascritto di RNA
– 6-8 “A” sono localizzate sul filamento coding e
producono un numero corrispondente di U sul
trascritto.
Terminazione della Transcrizione RhoIndependent
(dipende dalla sequenza di DNA - NON da un fattore
proteico)
Stem-loop structure
Rho-independent
transcription
termination
• RNAP si arresta quando
raggiunge un sito di
terminazione.
• La pausa della RNAP
consente alla struttura ad
hairpin di formarsi
•La struttura ad Hairpin
distrugge importanti
interazioni tra RNAP ed il suo
prodotto ad RNA
•L’ RNA U-rich può dissociare
dal templato
• Il complesso è distrutto e l’
elongazione è terminata
La RNA Polymerase è un enzima
spettacolare
• Effettua lo “scanning” delle sequenze di DNA ed
identifica promotori
• Si lega ai promotori
• Inizia la trascrizione: non richiede un primer
• Allunga la catena di RNA
• Effettua la terminazione della trascrizione
• Interagisce con attivatori e repressori
La regolazione trascrizionale in
Prokaryotes
• Perchè è necessaria?
• L’ ambiente cambia rapidamente
• La sopravvivenza dipende dalla capacità di
adattarsi
• I batteri devono esprimere gli enzimi richiesti
per sopravvivere in quell’ ambiente
• La sintesi di enzimi ha un costo energetico
elevato.
• Dunque gli enzimi devono essere prodotti
solo quando è necessario.
Proteins
Costitutive
• Sono sempre espresse
• “housekeeping” e.g.
glucose metabolizing
enzymes: il glucosio è la
fonte di carbonio più
utilizzata
Adaptive
• “inducible”
• Sono prodotte solo
quando è necessario: e.g.
Lactose metabolizing
enzymes
• Sono prodotte solo se il
lattosio è la sola fonte di
carbonio: Non sono infatti
prodotte se il glucosio è
presente.
Ways to Regulate Transcription
1. Uso di fattori sigma alternativi : controllano la trascrizione selettiva di
interi gruppi di geni
vegetative
(principal s)
σ70
(16-19 bp)
TTGACA
heat shock
nitrogen
starvation
σ32
σ60
+1
TATAAT (5-9 bp) A
+1
CNCTTGA
(13-15 bp) CCCATNT (5-9 bp) A
CTGGNA (6 bp) TTGCA
+1
(5-9 bp) A
Ways to Regulate Transcription
2 Regolazione Positiva (attivazione): un fattore di
regolazione positiva migliora la capacità
della RNAP di interagire in corrispondenza del
promotore e di iniziare la trascrizione a livello di
un promotore debole
RNAP
Activator
-35
Activator binding site
EXAMPLE: CAP
-10
+1
Ways to Regulate Transcription
3. Regolazione negativa (repressione): un fattore di
regolazione negativa (repressore) inibisce la capacità di
RNAP di interagire con un promotore forte ed iniziare la
sintesi di RNA
RNAP
Repressor
-35
-10
Operator
EXAMPLE: lac REPRESSOR
Come avviene la trascrizione negli Eucarioti?....
Negli Eucarioti sono presenti TRE tipi di RNA polimerasi
RNA polimerasi I (Pol I)
sintesi di RNA pre-ribosomiale
(un unico trascritto contenente
i precursori di rRNA 18S, 5.8S, 28S)
RNA polimerasi II (Pol II)
sintesi degli mRNA
RNA polimerasi III (Pol III)
sintesi dei tRNA, rRNA 5S
piccoli RNA
Differences
Between Transcription In
Prokaryotes and Eukaryotes
Transcription And Translation
In Prokaryotes
5’
3’
3’
5’
RNA
Pol.
Ribosome
mRNA
5’
Ribosome
Eukaryotic Transcription
Nuclear
pores
Cytoplasm
DNA
Transcription
RNA
RNA
Processing
mRNA G
G
AAAAAA
Nucleus
Export
AAAAAA
promotore
Fattori di trascrizione (TF)
proteine che regolano
la trascrizione,
ma non sono subunità
della RNA polimerasi
di inizio
Modificazioni post-trascrizionali degli mRNA eucariotici
(maturazione degli mRNA)
Aggiunto prima che la
sintesi del trascritto
primario sia completata
Introni = sequenze non codificanti (eliminati con lo splicing)
Esoni = sequenze codificanti
-guanililtransferasi (nucleo) – da GTP
-guanina 7-metiltransferasi (citoplasma)
cappuccio 5’:
- Protegge l’mRNA dalle ribonucleasi
- Viene riconosciuta da proteine che
legano il ribosoma
Coda di poliA (40-200 nucleotidi)
Aggiunta dalla poliadenilato
polimerasi (nucleo)
Stabilizza l’mRNA
Ne favorisce l’uscita dal nucleo
SPLICING: eliminazione degli introni
snRNP = piccole particelle
ribonucleoproteiche nucleari
(proteine + snRNA)
Splicing alternativo
http://www.youtube.com/watch?v=F
VuAwBGw_pQ
mRNA Splicing.flv
