QUANTA LiteTM dsDNA

QUANTA LiteTM ssDNA ELISA
708525
Cantena singloa DNA ELISA
Per uso diagnostico In Vitro
Complessità CLIA: elevata
Finalità d’uso
QUANTA LiteTM ssDNA è un test immunoenzimatico (ELISA) semi-quantitativo per la ricerca degli
autoanticorpi anti-DNA a catena singola (ssDNA). Il kit QUANTA LiteTM ssDNA ELISA della INOVA, se usato
contemporaneamente con il kit QUANTA LiteTM dsDNA della INOVA, consente la determinazione semiquantitativa degli autoanticorpi anti-ssDNA nel siero umano per la diagnosi del lupus eritematoso sistemico
(LES) e di alcune altre malattie reumatiche. Il risultato del test non è diagnostico ma rappresenta un
parametro in un processo diagnostico multidisciplinare.
Riassunto e Spiegazione del test
Gli anticorpi anti-nucleo (ANA) vengono riscontrati in una grande varietà di malattie del tessuto connettivo e
pertanto rappresentano un test di screening molto sensibile.1 Gli anticorpi anti-DNA a doppia elica (dsDNA)
si trovano quasi esclusivamente in pazienti con LES e perciò vengono considerati un marker della malattia.
La presenza di anticorpi anti-dsDNA è fortemente indicativa di LES, tuttavia, l’assenza di tali anticorpi non
consente sempre di eliminare il sospetto di LES.2
Gli autoanticorpi anti-ssDNA vengono ritrovati in numerose malattie reumatiche ed in vari tipi di altre
malattie.3,4 La maggior frequenza ed i titoli più elevati di autoanticorpi anti-ssDNA vengono riscontrati in
pazienti con LES.4 Nei pazienti affetti da LES positivi per la presenza di autoanticorpi anti-ssDNA, il titolo può
essere usato per monitorare i cambiamenti nell’attività della malattia e la risposta alla terapia
farmacologica.5,6 Sebbene gli autoanticorpi anti-ssDNA non siano specifici del LES, essi possono essere
l’unico test sierologico positivo in alcuni pazienti con LES che non producono titoli significativi di anticorpi
ANA.7 Molti di questi pazienti con alti titoli di autoanticorpi anti-ssDNA mostrano segni di malattia cutanea
fotosensibile. Circa il 25% dei pazienti affetti da lupus discoide mostrano autoanticorpi anti-ssDNA e sono a
rischio di complicanze sistemiche.3 Nei pazienti con forme severe di lupus discoide ed affetti da
glomerulonefrite è stata dimostrata la presenza dei soli autoanticorpi anti-ssDNA.3 Tali studi indicano che la
ricerca degli autoanticorpi anti-ssDNA può essere un importante test per la diagnosi del lupus discoide
oppure per la valutazione dei pazienti sospetti di avere una forma di LES negativa per ANA.3 Gli anticorpi
che reagiscono con ssDNA denaturato termicamente sono in grado di reagire con le purine e le pirimidine
come pure con lo scheletro zucchero-fosfato della molecola di DNA.1,4 Da un punto di vista tecnico è ancora
impossibile misurare con un singolo test i veri autoanticorpi anti-ssDNA (utilizzando le basi puriniche e
pirimidiniche come unico antigene). La tecnica ELISA utilizzata in questo test è oggettiva ed i risultati
possono essere refertati in modo semi-quantitativo. La metodica ELISA consente di testare sia grandi che
piccoli numeri di campioni in in un formato analogo a quello di altri esami per la diagnosi di malattie
reumatiche quali dsDNA, istone e anticorpi anti-nucleo estraibili (ENA).
Principio della Metodica
Un ssDNA di timo di vitello altamente purificato e denaturato termicamente è adsorbito sulla parete dei
pozzetti di una piastra microtiter di polistirene in condizioni adatte a conservare l’antigene nel suo stato
nativo. I controlli pre-diluiti ed i sieri diluiti dei pazienti vengono distribuiti nei pozzetti corrispondenti,
consentendo agli anticorpi anti-ssDNA eventualmente presenti di legarsi all’antigene adsorbito. L’eccesso di
campione non legato viene allontanato mediante il lavaggio e successivamente si aggiunge a ciascun
pozzetto un anticorpo anti-IgG umane marcato con un enzima. Una seconda incubazione consente agli
anticorpi anti-IgG umane marcati con l’enzima di legarsi agli anticorpi del paziente che si sono
eventualmente legati alla parete dei pozzetti. Dopo ulteriore lavaggio per allontanare l’eccesso di anticorpi
anti-IgG umane marcati con l’enzima, l’attività dell’enzima rimasto viene misurata aggiungendo un substrato
cromogenico e misurando l’intensità del colore che si sviluppa. Il test può essere letto mediante uno
spettrofotometro ed interpretato confrontando l’intensità del colore che si sviluppa nei pozzetti dei campioni
con quella dei pozzetti dei controlli.
Reagenti
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Piastra microtiter ELISA in polistirene adsorbita con antigene ssDNA purificato (12-1 x 8 pozzetti),
con supporto, in busta chiusa contenente materiale essicante
Controllo ELISA Negativo, 1 flacone di tampone contenente conservante e siero umano senza
anticorpi umani anti-ssDNA, prediluito, 1,2mL
Controllo ELISA fortemente positivo per ssDNA, 1 flacone di tampone contenente conservante ed
anticorpi umani anti-ssDNA, prediluito, 1,2mL
Controllo ELISA debolmente positivo per ssDNA, 1 flacone di tampone contenente conservante ed
anticorpi umani anti-ssDNA, prediluito, 1,2mL
Diluente per campioni HRP, 1 flacone – di colore rosa contenente soluzione fisiologica tamponata
con Tris, Tween 20, stabilizzatori delle proteine e conservante, 50mL
Soluzione di lavaggio HRP Concentrata, 1 flacone di soluzione concentrata 40x – di colore rosso
contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris e Tween 20, 25mL. Vedi la Sezione Metodi per
le istruzioni sulla diluizione.
1
7.
8.
9.
Coniugato HRP IgG, (montone), anti-IgG umane, 1 flacone – di colore blu contenente tampone,
stabilizzatori delle proteine e conservante, 10mL
Cromogeno TMB, 1 flacone contenente stabilizzatori, 10mL
Soluzione di arresto HRP, Acido solforico 0,344M, 1 flacone – incolore, 10mL
Avvertenze
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
ATTENZIONE: Questo prodotto contiene un composto chimico (cloramfenicolo allo 0,02%) nel
diluente per i campioni, nei controlli e nel coniugato, noto allo Stato della California come causa di
tumori.
Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state
testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-HIV, per HBsAg e per anticorpi antiHCV mediante metodi approvati dall’FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa
dell’assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Controlli ELISA fortemente positivo
ssDNA, ELISA debolmente positivo ssDNA ed ELISA Negativo devono essere maneggiati come
materiali potenzialmente infettivi.8
La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se
ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di
piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità
di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi.
Il Coniugato HRP contiene un composto chimico velenoso/corrosivo, che può essere tossico se
ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi.
Il Cromogeno TMB contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito
attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare l’inalazione, l’ingestione o il contatto con la cute e
con gli occhi.
La Soluzione di arresto HRP è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. Evitare
l’esposizione a basi, metalli o altri composti che possono reagire con gli acidi. L’acido solforico è
velenoso e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche,
evitare il contatto con la cute e con gli occhi.
Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti.
I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le
normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica.
Precauzioni
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Questo prodotto è stato messo a punto per l’uso diagnostico In Vitro.
La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili.
Un lavaggio incompleto o non accurato e l’insufficiente aspirazione del liquido dai pozzetti ELISA può
causare una scarsa precisione e/o un’elevato background.
L’adattamento di questo test all’uso con apparecchiature automatiche e altri dispositivi per
trattamento dei campioni liquidi, in toto o in parte, può causare differenze nei risultati rispetto a quelli
ottenuti mediante la procedura manuale. E’ responsabilità di ciascun Laboratorio confermare che le
procedure automatizzate utilizzate diano risultati entro limiti di accettabilità.
Una serie di fattori influenza le prestazioni del test. Essi comprendono l’iniziale temperatura dei
reagenti, la temperatura dell’ambiente, l’accuratezza e la riproducibilità della tecnica di pipettamento,
la scrupolosità delle operazioni di lavaggio e di aspirazione del liquido dai pozzetti delle piastre
ELISA, il tipo di spettrofotometro usato per leggere i risultati e la lunghezza dei tempi di incubazione
durante l’esecuzione del test. Bisogna prestare molta attenzione alla costanza per ottenere risultati
accurati e riproducibili.
Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite.
Una chiusura incompleta della busta richiudibile contenente le strisce di pozzetti ed il materiale
essicante causa la degradazione dell’antigene ed una scarsa precisione nei risultati.
Valori di assorbanza inaccettabilmente bassi possono essere osservati dopo aver usato due o più
volte lo stesso flacone di coniugato HRP per un certo periodo di tempo. E’ importante seguire
attentamente le istruzioni fornite per il trattamento del coniugato HRP per evitare tale inconveniente.
Un’eventuale contaminazione chimica del coniugato HRP può essere conseguenza di una impropria
pulizia o risciacquo di apparecchi o di strumenti. Residui di comuni reagenti chimici di laboratorio
quali formalina, candeggina, etanolo o detergenti causano la degradazione nel tempo del coniugato
HRP. Risciacquare molto accuratamente tutti gli apparecchi e gli strumenti dopo l’uso di detergenti
chimici.
Condizioni di conservazione
1.
2.
3.
Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8°C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di
scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite.
Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere rimesse immediatamente nella busta richiudibile
contenente il materiale essicante e conservate nella busta ben chiusa a 2-8°C.
Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 1 settimana a 2-8°C.
2
Raccolta dei campioni
Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. L’aggiunta al campione di sodio azide o di altri
conservanti può influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica,
trattati con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l’uso
di sieri fortemente emolizzati o lipemici.
Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A2 dell’NCCLS
raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni a temperatura
ambiente per non più di 8 ore. 2) Se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in
frigorifero a 2-8°C. 3) Se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni,
congelare a ≤-20°C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di
essere testati.
Procedura
Materiali forniti
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Piastra microtiter ELISA ssDNA (12-1 x 8 pozzetti), con supporto
1,2mL Controllo ELISA Negativo prediluito
1,2mL Controllo ELISA debolmente positivo ssDNA prediluito
1,2mL Controllo ELISA fortemente positivo ssDNA prediluito
50mL Diluente per campioni HRP
25mL Soluzione di lavaggio HRP concentrata, 40x concentrata
10mL Coniugato HRP IgG, (montone), anti-IgG umane
10mL Cromogeno TMB
10mL Soluzione di arresto HRP, 0,344M Acido solforico
Materiali richiesti ma non forniti
Micropipette in grado di erogare volume di 5, 100, 200-300 e 500µL
Puntali monouso per micropipette
Provette per la diluizione dei sieri, volume 4mL
Acqua distillata o deionizzata
Beuta da 1L per diluite la Soluzione di lavaggio HRP concentrata
Lettore per piastre ELISA in grado di leggere a 450nm (e 620nm per le letture a doppia lunghezza d’onda)
Metodica
Prima di incominciare
1.
2.
3.
4.
Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20-26oC) e mescolarli bene.
Diluire la Soluzione di lavaggio HRP concentrata 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone fornito
con il kit a 975mL di acqua distillata o deionizzata. Se non si usa l’intera piastra in una sola volta, si
può preparare una minore quantità di soluzione di lavaggio aggiungendo 2,0mL di concentrato a
78mL di acqua distillata o deionizzata ogni 16 pozzetti utilizzati. La soluzione di lavaggio diluita è
stabile per 1 settimana a 2-8oC.
Preparare una diluizione 1:101 di ciascun campione da testare aggiungendo 5µL di siero a 500µL di
Diluente per campioni HRP. I campioni diluiti devono essere testati entro 8 ore dalla preparazione.
NON DILUIRE i Controlli ELISA debolmente positivo ssDNA, ELISA fortemente positivo ssDNA ed
ELISA Negativo.
La determinazione della presenza o dell’assenza di ssDNA usando unità arbitrarie richiede due
pozzetti per ciascuno dei tre controlli ed uno o due pozzetti per ciascun campione clinico. Si
raccomanda di testare i campioni in duplicato.
Esecuzione del test
1.
2.
3.
4.
TUTTI I REAGENTI DEVONO ESSERE PORTATI A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26°C)
PRIMA DI INIZIARE IL TEST. Posizionare i pozzetti/le strisce necessarie nel supporto. Rimettere
immediatamente la strisce inutilizzate nella busta contenente il materiale essicante e sigillarla
bene per minimizzare l’esposizione all’umidità ambientale.
Distribuire 100µL dei Controlli ELISA debolmente positivo ssDNA, ELISA fortemente positivo ssDNA
ed ELISA Negativo prediluiti e dei sieri diluiti nei rispettivi pozzetti. Coprire i pozzetti ed incubare per
30 minuti a temperatura ambiente su una superficie piana. Il tempo di incubazione inizia dopo
l’aggiunta dell’ultimo campione.
Lavaggio: Aspirare completamente il contenuto di ciascun pozzetto. Distribuire 200-300µL di
soluzione di lavaggio HRP diluita in tutti i pozzetti e quindi aspirarla. Ripetere questa operazione per
altre due volte, per un totale di tre lavaggi. Dopo l’ultimo lavaggio capovolgere la piastra e scuoterla
fermamente su tovaglioli di carta assorbente per rimuovere eventuali residui di liquido. E’ importante
vuotare completamente ciascun pozzetto dopo ciascun lavaggio. Per l’aspirazione mantenere la
stessa sequenza usata per l’aggiunta dei campioni.
Distribuire 100μL di Coniugato HRP IgG in ciascun pozzetto. Il coniugato dovrebbe essere prelevato
dal flacone mediante tecniche sterili. Prelevare dal flacone solo la quantità di coniugato necessaria
per l’esecuzione del test. PER EVITARE POSSIBILI CONTAMINAZIONI MICROBICHE E/O
CHIMICHE, NON RIMETTERE MAI IL CONIUGATO INUTILIZZATO NEL FLACONE. Incubare i
pozzetti per 30 minuti come descritto al punto 2.
3
5.
6.
7.
8.
Lavaggio: Ripetere la procedura descritta al punto 3.
Distribuire 100µL di Cromogeno TMB in ciascun pozzetto ed incubare al buio per 30 minuti a
temperatura ambiente.
Distribuire 100µL di Soluzione di arresto HRP in ogni pozzetto. Per l’aggiunta della Soluzione di
arresto HRP mantenere la stessa sequenza e gli stessi tempi utilizzati per l’aggiunta del Cromogeno
TMB. Agitare gentilmente la piastra con le dita per mescolare completamente i reagenti nei pozzetti.
Leggere l’assorbanza (OD) di ciascun pozzetto a 450nm entro 1 ora dall’aggiunta della soluzione di
arresto. Se si preferisce una lettura a doppia lunghezza d’onda, si può usare la lunghezza d’onda di
620nm come riferimento.
Controllo di qualità
1.
2.
3.
4.
I Controlli ELISA debolmente positivo ssDNA, ELISA fortemente positivo ssDNA ed ELISA Negativo
devono essere inclusi ogni volta che si esegue il test per assicurare che tutti i reagenti ed il test
funzionino in modo corretto.
Si deve notare che, poichè i Controlli ELISA debolmente positivo ssDNA, ELISA fortemente positivo
ssDNA ed ELISA Negativo sono prediluiti, essi non rappresentano un controllo procedurale per le
tecniche di diluizione utilizzate per i campioni.
Ulteriori controlli possono essere inclusi in base alle indicazioni o alle richieste delle vigenti
regolamentazioni o delle organizzazioni di accreditamento. Ulteriori sieri di controllo possono essere
preparati raccogliendo un pool dei sieri umani, aliquotandolo e conservandolo a < -20°C.
Perchè i risultati del test siano considerati validi, tutti i seguenti criteri devono essere soddisfatti. Se
anche uno solo non rientra nei valori specificati, i risultati non dovrebbero essere considerati validi ed
il test dovrebbe essere ripetuto.
a.
L’assorbanza del Controllo ELISA fortemente positivo ssDNA prediluito deve essere
maggiore di quella del Controllo ELISA debolmente positivo ssDNA prediluito che a sua volta
deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA Negativo prediluito.
b.
Il Controllo ELISA fortemente positivo ssDNA prediluito deve avere un’assorbanza maggiore
di 1,0 mentre l’assorbanza del Controllo ELISA Negativo prediluito non deve essere maggiore
di 0,2.
c.
L’assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo ssDNA deve essere maggiore di due
volte rispetto a quella del Controllo ELISA Negativo oppure maggiore di 0,25.
d.
Il Controllo ELISA Negativo e quello ELISA fortemente positivo ssDNA servono per
controllare un’eventuale malfunzionamento dei reagenti. Il Controllo ELISA fortemente
positivo ssDNA non assicura la precisione in corrispondenza del valore soglia del test.
e.
L’utente del test dovrebbe fare riferimento al Documento C24-A dell’NCCLS per ulteriori
informazioni su appropriate tecniche di Controllo di Qualità.
Calcolo dei risultati
Si deve determinare innanzitutto il valore medio di assorbanza per ciascun set di duplicati. La reattività di
ciascun campione viene quindi calcolata dividendo il valore medio di assorbanza del campione per il valore
medio di assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo ssDNA e moltiplicando il risultato per il
numero di unità assegnate al Controllo ELISA debolmente positivo ssDNA, che è stampato sull’etichetta del
flacone.
Assorbanza campione
Valore del campione = ————————————————
x Valore Controllo ELISA debolmente positivo ssDNA
(unità)
Assorbanza Controllo ELISA debolmente positivo ssDNA
(unità)
La reattività è collegata in modo non lineare alla quantità di anticorpi presente. Mentre gli aumenti e le
diminuzioni delle concentrazioni degli anticorpi vengono evidenziate da un corrispondente aumento o
diminuzione della reattività, il cambiamento non è proporzionale (ad es., un raddoppio della concentrazione
di anticorpi non raddoppia necessariamente la reattività). Se si desidera una più accurata quantificazione del
contenuto di anticorpi, si possono allestire e testare diluizioni seriate del campione. L’ultima diluizione che
risulta positiva nel test dovrebbe essere refertata come il titolo anticorpale del paziente.
Interpretazione dei risultati
Il metodo ELISA è molto sensibile alla procedura ed è in grado di individuare anche piccole differenze nella
popolazione dei pazienti. I valori riportati qui di seguito sono solo valori suggeriti. Ciascun Laboratorio
dovrebbe stabilire il proprio range di normalità basato sulla procedura da esso utilizzata, sui controlli,
sull’apparecchiatura e sulla popolazione di pazienti secondo le proprie metodiche standard. Le seguenti
informazioni servono come esempio per l’interpretazione dei risultati.
Poichè gli autoanticorpi anti-DNA a singola elica (ssDNA) ed alcuni autoanticorpi anti-DNA a doppia elica
(dsDNA) possono reagire con l’antigene ssDNA di questo kit, i campioni dovrebbero essere testati anche per
la presenza di autoanticorpi anti-dsDNA. Questi risultati, espressi in unità OMS, dovrebbere essere presi in
considerazione quando si valutano i livelli di autoanticorpi anti-ssDNA. Analizzando contemporaneamente i
risultati ottenuti con il test QUANTA LiteTM dsDNA ELISA della INOVA e quelli ottenuti mediante il test
QUANTA LiteTM ssDNA ELISA della INOVA il medico curante può trarre delle conclusioni sulla presenza di
autoanticorpi anti-ssDNA calcolando il rapporto (ssDNA/dsDNA). Un risultato <0,5 indica l’assenza di
autoanticorpi anti-ssDNA. Un rapporto >0,5 indica la presenza di autoanticorpi anti-ssDNA.
4
NOTA: Il campione dovrebbe essere considerato positivo solo quando il risultato del test per la ricerca di
autoanticorpi anti-ssDNA è positivo ed il rapporto delle unità anti-ssDNA rispetto alle unità anti-dsDNA è
>0,5.
Esempio 1:
Esempio 2:
Esempio 3:
Test 1: concentrazione di autoanticorpi anti-dsDNA: 120 Unità OMS/mL
Test 2: concentrazione di autoanticorpi anti-ssDNA: 160 Unità/mL
Rapporto di autoanticorpi anti-ssDNA (ssDNA/dsDNA): 160/120 = 1,33 (+)
Interpretazione: Il campione del paziente è positivo per la presenza di autoanticorpi antissDNA
Test 1: concentrazione di autoanticorpi anti-dsDNA: 270 Unità OMS/mL
Test 2: concentrazione di autoanticorpi anti-ssDNA: 130 Unità/mL
Rapporto di autoanticorpi anti-ssDNA (ssDNA/dsDNA): 130/270 = 0,48 (-)
Interpretazione: Il campione del paziente è negativo per la presenza di autoanticorpi antissDNA
Test 1: concentrazione di autoanticorpi anti-dsDNA: 80 Unità OMS/mL
Test 2: concentrazione di autoanticorpi anti-ssDNA: 80 Unità/mL
Rapporto di autoanticorpi anti-ssDNA (ssDNA/dsDNA): 80/80 = 1,0 (+)
Interpretazione: Il campione del paziente è positivo per la presenza di autoanticorpi antissDNA
Se il risultato del test per la ricerca degli autoanticorpi anti-ssDNA risulta positivo, allora le unità di
autoanticorpi anti-ssDNA possono essere confrontate con le seguenti categorie cliniche.
<68,6 Unità/mL
Negativo per la presenza di autoanticorpi anti-ssDNA
68,6 - 229 Unità/mL
Moderatamente positivo per la presenza di autoanticorpi anti-ssDNA
>229 Unità/mL
Fortemente positivo per la presenza di autoanticorpi anti-ssDNA
Può essere difficile determinare l’attività anti-ssDNA in campioni che risultano fortemente positivi (con
assorbanza >2,0 OD) sia per ssDNA sia per dsDNA. Se il campione è fortemente positivo il rapporto può
essere ingannevole poichè il test ELISA è saturato dagli anticorpi del paziente. Si raccomanda di ritestare i
campioni fortemente positivi sia per ssDNA sia per dsDNA ad un’ulteriore diluizione di 1:4 e 1:20 (cioè 1:404
e 1:2020) nel Diluente per campioni HRP per determinare se gli anticorpi anti-ssDNA hanno un livello
superiore a quello degli anticorpi anti-dsDNA. Le operazioni di calcolo dei valori di unità devono essere
ripetute sulle successive diluizioni del campione paziente.
Limitazioni del test
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Poichè gli anticorpi della classe IgG sono considerati quelli più significativi dal punto di vista clinico,
questo test usa un coniugato specifico anti-IgG. Gli anticorpi anti-ssDNA della classe IgM non rilevati
da questo test possono competere con le IgG per i siti di legame disponibili. Se si sospetta la
presenza di interferenze da parte di IgM, si consiglia di ripetere il test diluendo ulteriormente il
campione usando il Diluente per campioni HRP. Un netto aumento del valore per il campione indica
la presenza di IgM che competono con le IgG. Questo nuovo valore fornisce una determinazione più
accurata della quantità di IgG anti-ssDNA nel campione in esame.
La presenza nel campione di complessi immuni o di altri aggregati di immunoglobuline può causare
un aumento del livello di reazioni aspecifiche con conseguenti risultati falsi positivi con questo test.
Poichè sia gli autoanticorpi anti-DNA a singola elica (ssDNA) sia alcuni autoanticorpi antiDNA a
doppia elica (dsDNA) possono reagire con l’antigene ssDNA di questo kit, i campioni dovrebbero
essere testati anche per la presenza di anticorpi anti-dsDNA, e questi risultati devono essere tenuti in
considerazione nella valutazione dei levelli di anticorpi anti-ssDNA.
Una serie di fattori può influenzare le prestazioni del test. Questi comprendono l’accuratezza e la
riproducibilità della tecnica di pipettamento, lo spettrofotometro utilizzato per misurare i risultati e la
corretta osservanza dei tempi di incubazione durante l’esecuzione del test. Si deve prestare grande
attenzione alla tecnica per ottenere risultati accurati e riproducibili.
Il kit QUANTA LiteTM ssDNA ELISA non è un test definitivo per la presenza di anticorpi anti-ssDNA.
Esso deve essere utilizzato contemporaneamente al kit QUANTA LiteTM dsDNA ELISA della INOVA
Diagnostics, Inc. per rilevare la presenza di anticorpi anti-ssDNA. Non utilizzare un test per anticorpi
anti-dsDNA prodotto da altre Ditte perchè la calibrazione dei test ssDNA ELISA e del test dsDNA y
ELISA della INOVA è stata eseguita in parallelo.
I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del
paziente e del risultato degli altri test sierologici.
Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero.
Valori attesi
La capacità del test QUANTA LiteTM ssDNA ELISA di individuare anticorpi anti-ssDNA è stata valutata
paragonandola a quella di un altro test ELISA disponibile in commercio. I risultati del test ELISA sono stati
interpretati in base alle istruzioni fornite dalle Ditte produttrici.
Range normale
Un campione casuale di 117 sieri è stato selezionato e testato mediante il kit QUANTA LiteTM ssDNA ELISA.
Di questi campioni, 7 avevano un valore di unità ≥69 (da considerare come positivo in questo test ELISA).
Cinque di questi 7 campioni risultavano positivi anche con il metodo commerciale di riferimento per anticorpi
anti-ssDNA e pertanto sono stati eliminati dalla popolazione normale. Il valore medio di unità della
popolazione testata era pari a 27 con una deviazione standard di 21. Il range di valori ottenuti con i campioni
5
studiati andava da 12 a 186. Questo studio indica che il campione normale medio è 2,0 deviazioni standard
al di sotto del valore soglia.
Sensibilità e specificità relative
Un campione casuale di 32 campioni positivi per ANA è stato testato con il test QUANTA LiteTM ssDNA e con
un altro kit disponibile in commercio (Riferimento). Diciotto campioni sono risultati positivi e 12 negativi con
entrambi i metodi. Due campioni sono risultati positivi con il metodo di riferimento ma negativi con INOVA.
Questi due campioni sono risultati negativi con un altro kit commerciale. I risultati sono riassunti nella
seguente tabella.
+
INOVA
+
18
2
Riferimento
-
0
12
Sensibilità relativa
Specificità relativa
Efficienza relativa
90%
100%
94%
Per valutare ulteriormente la fase solida del test ssDNA, una serie di controlli con elevati titoli di autoanticorpi
monospecifici è stata testata con il kit QUANTA LiteTM ssDNA. Questi controlli comprendevano i controlli ad
alto titolo dei seguenti kit QUANTA LiteTM ELISA della INOVA: Sm, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, Jo-1, Thyroid
Microsomal e Thyroglobulin, Histone e Mitochondria M2. Tutti i controlli summenzionati hanno dato risultati
negativi con il test ssDNA.
Positività per anticorpi anti-ssDNA in varie malattie del tessuto connettivo
Numero di pazienti
LES
Sindrome di Sjogrens
Scleroderma
Polimiositis
Lupus indotto da farmaci
Artrite Reumatoide
43
21
15
6
20
11
% Positivi
58
62
80
17
80
45*
*2 dei 5 campioni positivi avevano valori borderline (69 e 99 unità).
Venticinque dei pazienti con LES erano positivi per anticorpi anti-ssDNA. Sei di questi pazienti affetti da LES
e positivi per anticorpi anti-ssDNA risultavano dubbi con un test ELISA molto sensibile per anticorpi anti-DNA
a doppia elica (dsDNA) (INOVA). Tredici dei 21 pazienti con Sindrome di Sjogren risultavano positivi per
anticorpi anti-ssDNA. Tutti questi 21 pazienti erano positivi per SS-A, SS-B o sia per SS-A e SS-B mediante
metodiche ELISA (INOVA). Tre di questi pazienti con Sindrome di Sjogren risultavano positivi per anticorpi
anti-ssDNA ma erano completamente negativi con un un test ELISA molto sensibile per anticorpi anti-dsDNA
(INOVA). Dodici dei 15 pazienti affetti da scleroderma e positivi per Scl-70 erano positivi per anticorpi antissDNA e solo 1 dei 6 pazienti con polimiosite era positivo. Tutti i pazienti con polimiosite risultavano positivi
per la presenza di autoanticorpi anti-Jo-1 con un test ELISA (INOVA). Il paziente con polimiosite che
risultava positivo per anticorpi anti-ssDNA (112U) era completamente negativo per la presenza di anticorpi
anti-dsDNA mediante una tecnica ELISA (INOVA).
Precisione e riproducibilità
La precisione e la riproducibilità del metodo sono state valutate testando sei repliche di ciascun campione
negativo, moderatamente positivo e fortemente positivo in quattro esperimenti diversi. Il valore medio di unità
del campione fortemente positivo era pari a 814, quello del campione moderatamente positivo era 300 e
quello del campione negativo era 72. La deviazione standard ed il coefficiente di variazione per ciascun
campione sono riportati nella seguente tabella.
Generale
Intra-test
Inter-test
Negativo
SD
4,7
4,7
4,6
CV
6,6%
6,5%
6,3%
Fortemente positivo
SD
CV
36
4,5%
35
4,3%
24
3,0%
6
Moderatamente positivo
SD
CV
8,0
2,7%
6,8
2,7%
8,7
2,9%
Bibliografía
Referencias
Références
Referências
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Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National
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Fornitore:
INOVA Diagnostics, Inc.
9900 Old Grove Road
San Diego, CA 92131
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June 2009
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