7.Laboratori di riferimento - EXPO

La rete dei laboratori
diagnostici di riferimento
Marina Barba
CREA- Centro di Ricerca per la Patologia
Vegetale- ROMA
1
Il Decreto Legislativo 19 agosto 2005, n. 214!
"Attuazione della direttiva 2002/89/CE concernente le misure
di protezione contro l'introduzione e la diffusione nella
Comunità di organismi nocivi ai vegetali o ai prodotti vegetali“!
Introduce la rete laboratoristica nazionale (RLN) e definisce il
ruolo del laboratorio nazionale di riferimento (LNR)!
LRN!
Laboratori dei servizi fitosanitari regionali
Laboratori pubblici e privati ufficialmente riconosciuti dai servizi
I laboratori della rete nazionale
REQUISITI TECNICI
1- Personale
2- Ambiente di lavoro
3- Protocolli di diagnosi
22/09/15
3
REQUISITI TECNICI
1- Personale
Il personale deve
essere
addestrato,
aggiornato e
organizzato in
funzione della
diversa
professionalità
22/09/15
4
Organizzazione corsi
Lezioni teoriche
Laboratorio
22/09/15
5
REQUISITI TECNICI
2- Ambiente
A- Organizzazione idonea dei locali (ricevimento
campioni, preparazione campioni, diagnosi,
stoccaggio materiale, stoccaggio campioni, etc.)
B- Controllo condizioni ambientali che possono
influenzare la qualità della diagnosi
C- Idonea gestione
dei patogeni da
quarantena
22/09/15
6
REQUISITI TECNICI
3- Protocolli di Diagnosi
Il laboratorio DEVE utilizzare protocolli di
riferimento VALIDATI, quando disponibili (EPPO
standard, standards nazionali, regionali).
Se non disponibili deve procedere a validare esso
stesso dei protocolli.
22/09/15
7
VALIDAZIONE di un
PROTOCOLLO DIAGNOSTICO
-
sensibilità analitica
-  specificità analitica
- ripetibilità
- riproducibilità
22/09/15
8
REQUISITI PER LA DIAGNOSI
CAMPIONI STANDARD:
A- CERTIFICATI: provenienti da una fonte certa (fonte
riconosciuta internazionalmente o collezioni nazionali),
codificato e con una tracciabilità
B- ‘DI RIFERIMENTO’: devono essere documentati ed
idonei per il test.
Possono consistere in campioni biologici o preparazioni di
acidi nucleici.
22/09/15
9
Compiti del LRN:!
1.  Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali!
2.  Trasferire i protocolli ufficiali a tutti i laboratori della rete!
3.  Formare ed aggiornare il personale della rete laboratoristica!
4.  Mantenere una collezione di patogeni di riferimento!
5.  Organizzare test inter-laboratorio (PT e RT)!
6.  Fornire supporto tecnico-scientifico alle autorità competenti!
Armonizzazione di tutti i partner coinvolti
in diagnosi ufficiali e nel controllo fitosanitario
1. 
Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali!
Il Mipaaf ha finanziato negli ultimi anni alcuni progetti per la
messa a punto di protocolli ufficiali per la diagnosi di agenti
patogeni coperti da norme fitosanitarie.!
Quali patogeni?
• 
• 
• 
Malattie emergenti
Patogeni per i quali non
esisteva un protocollo
ufficiale
Patogeni che
rappresentavano un
“problema”fitosanitario
Spedito un
questionario a
tutti i S.F.R.
11
1. 
Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali (ARNADIA)!
Virus e viroidi
Phytoplasmi
‘Candidatus Phytoplasma prunorum’
‘Candidatus Phytoplasma mali’
Funghi
- Tilletia indica
• 
Plum pox virus - PPV
• 
Potato Spindle Tuber Viroid - PSTVd
• 
Grape viruses (GLRaV 1, 2, 3, GVA, GVB,
GFLV, ArMV, GFkV);
• 
Pepino mosaic virus - PeMV
• 
Tomato infectious chlorosis virus - TIC and
Tomato chlorosis virus – ToCV
- Monilinia fructicola
- Phytophthora ramorum
Batteri
- Gibberella circinata
- Ceratocystis platani
- Funghi terricoli:
Chondrostereum pupureum, Verticillium
dahlie, V. albo-atrum, Armillariella
mellea, Nectria galligena, Phytophthora
cactorum
• 
Erwinia amylovora
• 
Clavibacter michiganensis subsp.
michiganensis
• 
Xanthomonas arboricola pv. pruni
12
1. 
Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali (ARNADIA)!
METODO DI LAVORO
q  Gruppo di lavoro: !
-  Scelta di protocolli diagnostici da sottoporre a valutazione
e validazione secondo criteri internazionali (UNI CEI EN
ISO/IEC 17025:2005).!
-  Discussione dei risultati e calcolo dei parametri di
validazione: scelta finale del protocollo(i)!
!
q  Test interlaboratorio con i laboratori della rete
nazionale (SS.FF.RR.) per stabilire il parametro di
riproducibilità e aumentare la “robustezza” e
armonizzazione del metodo!
1. 
Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali (ARNADIA)!
Un esempio….
PROTOCOLLO DIAGNOSTICO PER I
“Virus della vite coperti da norme fitosanitarie”
Gruppo di lavoro
Ø  CRA-PAV
Ø  FEM-IASMA
Ø  CRA-VIT
Ø  ERSA - FVG
Ø  CNR-IVV Bari
Ø  CAV - Faenza
Ø  CNR-IVV Gugliasco
Ø  CRSFA - Locorotondo
Ø  Università di Milano
Ø  IPAD -Lodi
Ø  Università di Bologna
Ø  VCR - Rauscedo
Ø  Università di Pisa
14
1. 
Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali (ARNADIA)!
Laboratori della rete
laboratoristica nazionale che
hanno preso parte al Ring test
Ø 
Ø 
Ø 
Ø 
Ø 
SFR
SFR
SFR
SFR
SFR
Trentino (Laimburg)!
Emilia Romagna!
Lombardia!
Valle d’Aosta!
Friuli Venezia Giulia (ERSA)!
15
1. 
Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali (ARNADIA)!
METODOLOGIE SCELTE E SOTTOPOSTE A
VALIDAZIONE
ELISA con antisieri Agritest (8), Bioreba (9), Sediag (8)!
Virus: GLRaV 1, 2, 3, GVA, GVB, GFLV, ArMV, GFkV!
Multiplex RT-PCR
rif. Gambino G. and Gribaudo I. 2006. Phytopathology 96 (11):
1223-1229)!
Estrazione Kit commerciale, !
Virus: GLRaV 1, 2, 3, GVA, GVB, GFLV, ArMV, GFkV
16
!
1. 
Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali (ARNADIA)!
CAMPIONAMENTO
La matrice vegetale da utilizzare per tutti i protocolli è il
floema prelevato da tessuto sottocorticale
Periodo di prelievo: durante tutto il periodo di dormienza
Tipologia: tralci lignificati di un anno. 2 porzioni legnose prelevate
nella parte basale.
Conservazione: i campioni da saggiare devono essere conservati
asciutti, posti in buste di plastica e conservati in luogo fresco fino
all’utilizzo
Tracciabilità: ogni campione deve essere etichettato sulla busta e
sulla pianta
Spedizione: i campioni devono essere consegnati al laboratorio
diagnostico entro 72 ore dal prelievo in pacchi refrigerati
17
Lista dei campioni (122) e loro stato sanitario
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12 
13 
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35 
36 
37 
38
39
40
41
42
43
44
45
GLRaV 1 + GLRaV 2 + GLRaV 3 + GVA+
GFkV
GVA
GVB
SANO
SANO
SANO
GLRaV3 + GVA
GFLV
GFkV
POOL DA 42 (GLRaV1, GVA,GFLV)
GLRaV 3 , GFLV
GVA, GLRAV1, GLRaV3
ArMV, GFLV, GLRaV1
GLRaV-1
POOL DA 107 (GLRaV1)
sano
POOL DA 106 (GFKV)
ArMV
ArMV (GRSPaV)
GVA, GRLaV2, GLRaV3
GLRaV-3+GVA
GLRaV-1 , GFkV, GFLV
SANO
SANO
GVA + GFLV
GLRaV-1 GLRaV-3 GVA
POOL DA 93 (GFLV)
GFkV
sano
GLRaV 3
GVA
SANO
sano
SANO
ArMV, GFLV, GFKV, GLRaV1, GVA
POOL DA 63 (GLRaV2-3, GVA)
GLRaV 2 + GFkV
POOL DA 66 (GLRaV2, GLRaV3,GVA)
GLRaV-1
ArMV
GVA – GFkV – GLRaV-3
GFLV + GLRaV1 + GVA
22/09/15
POOL
SANO
GLRaV1
GLRaV3
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
SANO
SANO
POOL DA 18 (ArMV)
SANO
GLRaV 3, GFkV, GFLV
SANO
sano
POOL DA 44 (GLRaV1)
SANO
GVA + GFkV +GLRaV-3+GLRaV2
GFLV
GLRaV3
SANO
GVA+GLRaV1+GFLV
sano
sano
Sano
GLRaV 2 + GLRaV 3 + GVA
POOL DA 12 (GVA,GLRaV1-3)
SANO
GLRaV 2, GLRaV 3 GVA
SANO
GLRaV 2 (isolato BD)
GFLV – GFkV – GLRaV-3
GFLV
GVA – GFkV – GLRaV-3
GFkV+ GLRaV 2 + GLRaV 3 + GVA
GFkV
POOL DA 1
(GLRaV1-2-3,GVA,GFkV)
ArMV, GFKV
GLRaV2 GLRaV3
GFkV + GLRaV2
GFLV, GFKV
GLRaV3
GLRaV1
SANO
Sano
SANO POOL
SANO
sano
Sano
GVA, GRLaV2, GLRaV1
GLRaV2 (isolato BD)
SANO
GLRaV-1 e GVA
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
121
122
GFLV, GLRaV 3
GLRaV 1-3 e GVA
GFLV
SANO
ArMV
GVA
SANO
sano
sano
SANO
SANO
GFLV – GFkV – GLRaV-3
GLRaV 2 (isolato BD)
GFkV, GLRaV3
GFKV
GFkV
GLRaV1
GVA
sano
SANO
GLRaV 3 + GVA
GLRaV 3, GVA, GFLV
GFKV
GLRaV 2 (isolato RG)
POOL DA 70 (GFLV)
POOL DA 112 (GLRaV3, GVA, GFLV)
POOL GFLV
POOL DA 72 (GFKV,
GLRaV2-3,GVA)
POOL DA 95 (ArMV)
POOL DA 25 (GVA,GFLV)
POOL DA 71 (GVA, GFKV,GLRaV3
POOL DA 113 (GFKV)
I campioni sono stati
analizzati in forma
“anonima” dai
laboratori
18
1. 
Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali (ARNADIA)!
PARAMETRI DI VALIDAZIONE
CALCOLATI
ISO 17025; ISO 16140 (2003) –
EPPO – Diagnostics PM7/76 e
PM7/98
§ Sensibilità diagnostica
§ Specificità diagnostica
§ Sensibilità analitica
§ Ripetibilità § Riproducibilità Campioni di riferimento ‘target’
Campioni di riferimento ‘non target’
19
1. 
Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali (ARNADIA)!
RISULTATI METODO ELISA
Parameter
Sensitivity
Specificity
Accurancy
Repeatability
Reproducibility
Sensitivity pool
Specificity pool
Accurancy pool
Repeatability pool
AGRITEST
GLRaV1 GLRaV2 GLRaV3 GFKV
ArMV
89
86
81
85
64
97
100
100
100
85
93
90
84
88
74
100
94
100
100
100
92
88
98
92
94
85
32
66
72
64
100
95
94
100
94
89
59
75
84
81
100
94
100
100
100
GFLV
75
96
80
100
87
65
100
79
100
GVA
74
100
80
95
92
73
100
81
95
GVB
86
100
92
100
100
nt
nt
nt
nt
20
RISULTATI METODO MOLECOLARE
Sensitivity
Specificity
Accuracy
Analytical
sensitivity
Repeatability
Reproducibility
GLRaV-1
74%
100%
94%
10-2
100%
70%
GLRaV-2
84%
98%
85%
10-2
95%
83%
GLRaV-3
100%
93%
95%
10-3
100%
100%
GVA
96%
99%
98%
10-2
100%
94%
GVB
100%
100%
100%
10-2
100%
100%
ArMV
92%
99%
98%
10-2
100%
100%
GFLV
68%
100%
90%
10-3
100%
76%
GFkV
95%
95%
95%
10-2
100%
95%
TOTAL
89%
98%
95%
99%
90%
VIRUS/PARAMETER
21
ARNADIA: Grapevine-RING TEST– ACCURACY
100
Accuratezza
relativa: il valore
risultante
dal calcolo
della
sensibilità
diagnostica
e della
specificità
diagnostica;
1:ELISA-A;
2:ELISA-B;
3:ELISA-S;
4:multiplex RT-PCR
OPTIMAL ACCURACY
90
HIGH ACCURACY
75
MEDIUM ACCURACY
50
POOR ACCURACY
1
2
3
4
0
22
2. Trasferimento dei protocolli ufficiali a tutti i laboratori della rete
Protocolli includono:
q 
q 
Descrizione della malattia
Campionamento:
Numero di campioni!
Periodo!
Matrice!
ü 
ü 
ü 
q 
q 
Descrizione del metodo
Punti critici del metodo
Sito istituzionale
www.strateco.it
Pubblicati su “PETRIA”
3. Formazione del personale della rete
1.  Organizzazione di meeting/stage per il personale del
settore (es.)
• 
• 
“Il settore fitosanitario e l’EPPO: contributi e criticità”, Roma 23
febbraio 2011.
Convegno “Potato spindle tuber viroid nel settore del vivaismo
ornamentale: risultati di tre anni di ricerca e messa a punto di un
modello di gestione aziendale certificante per piante viroid-free”.
Sabaudia 25 Maggio 2012
2.  Organizazione di corsi di formazione teorici(es.)
•  Corso di formazione per ispettori fitosanitari del Lazio
•  Corso di formazione per ispettori fitosanitari della Sicilia
3. Organizazione di corsi di formazione pratici (lab) es.
•  Phytophthora ramorum: PCR/nested PCR
•  Ceratocystis platani : real time PCR
•  Potato spindle tuber viroid : RT-PCR and real time RT-PCR
24
4. Mantenimento di collezioni ufficiali di isolati patogeni di riferimento!
Col.Mia: collezione di riferimento
Italiana per i microrganismi
La collezione contiene riferimenti dettaglaiti di più di 1.350
microorganismi sia di interesse agro-industriale, sia
fitopatogeni, entomopatogeni e del suolo
COLMIA è membro del World Federation for Culture
Collection (WFCC) con il numero WDCM945.
Informazioni dettagliate disponibili sul sito: www.colmia.it
25
5. Organizzare test inter-laboratorio (PT e RT)!
!
Quali patogeni?
• 
• 
• 
Malattie emergenti
Patogeni per i quali
esiste un protocollo
ufficiale
Patogeni che
rappresentano un
“problema”fitosanitario
Spedito un
questionario a
tutti i S.F.R.
26
Il Laboratorio di riferimento
nazionale DEVE essere accreditato
secondo ISO 17025
ACCREDIA è l’ente nazionale
accreditatore
CREA-PAV ha fatto domanda per l’accreditamento dei seguenti
protocolli:!
• 
• 
• 
• 
• 
• 
ELISA per la diagnosi di Plum pox virus e di Pepino mosaic virus!
RT-PCR per la diagnosi di Pospiviroidi!
PCR per la diagnosi di Monilinia fructicola !
Real time PCR per la diagnosi di Guignardia citricarpa!
PCR per la diagnosi di Pseudomonas syringae pv actinidiae!
PCR per la diagnosi di Clavibacter michiganensis pv michiganensis !
Organigramma:!
DIRECTOR
TECHNICAL AREA
MANAGERs
QUALITY
MANAGER
LABORATORY TECHNICIANS
Criticità:
•  Alti costi per ottenere e
mantenere lo status di
ACCREDITAMENTO
•  Gestione tecnica (tarature
strumenti ecc.)
•  Problemi amministrativi (la
gestione riguarda tutto il CRAPAV)
•  Gestione di un laboratorio
dove vengono svolte anche
altre attività non in Accredia o
di ricerca
Nessun problema: per eseguire le procedure di validazione
6 . Fornire supporto tecnico-scientifico alle autorità competenti!
!
Il Laboratorio di Riferimento fornisce supporto
tecnico-scientifico al Mipaaf riguardo:
-  Gestione delle malattie emergenti
-  Raccolta dei dati di monitoraggio
-  Caratterizzazione molecolare dei patogeni
coperti da normativa fitosanitaria
-  Competenza scientifica per l’emanazione di
provvedimenti ufficiali nei confronti di agenti
patogeni di quarantena
-  Valutazione di PRA
In conclusione
È in fase di pubblicazione il decreto per il
riconoscimento dei laboratori che a vario
livello faranno parte della rete laboratoristica
nazionale
Il laboratorio nazionale di riferimento farà
parte della rete laboratoristica europea dei
laboratori di riferimento
22/09/15
30
In conclusione
L’EPPO svolge un ruolo di estrema
importanza nella armonizzazione dei vari
aspetti che riguardano i protocolli di diagnosi
e le norme relative all’accreditamento dei
laboratori
Dal 7 all’11 settembre il CREA-PAV
ospiterà il 3° workshop riservato ai
responsabili dei laboratori europei di
riferimento
22/09/15
31
In conclusione
Una efficiente rete laboratoristica nazionale
• È alla base di una corretta e tempestiva
diagnosi
• Riduce il rischio di contenziosi
• Consente di uniformare quanto più possibile le
procedure di analisi su tutto il territorio
• Eleva la qualità dei laboratori responsabili delle
analisi ufficiali
• Favorisce la professionalità e l’aggiornamento
degli operatori
22/09/15
32
22/09/15
Grazie
per l’attenzione
33
1. 
Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali (ARNADIA)!
PARAMETRI DI VALIDAZIONE CALCOLATI
(ISO 17025; ISO 16140 (2003) - EPPO – Diagnostics PM7/76 e PM7/98): § Sensibilità diagnostica: capacità del metodo utilizzato di rilevare la presenza del patogeno nei campioni
sicuramente infetti dal patogeno in esame;
§ Specificità diagnostica: capacità del metodo utilizzato di NON rilevare la presenza del patogeno nei
campioni non infetti dal patogeno in esame;
§ Sensibilità analitica: la più piccola quantità di entità infettiva che può essere identificata dal metodo
diagnostico (nel caso di patogeni virali vegetali, che non possono essere quantificati in vitro, corrisponde
alla diluizione limite dell’estratto iniziale nella quale il metodo utilizzato riesce ad individuare il patogeno);
§ Ripetibilità : grado di conformità dei risultati ottenuti in replicazioni, effettuate a intervalli brevi di tempo,
del metodo utilizzando lo stesso campione di riferimento e nelle stesse condizioni di lavoro
(strumentazioni, operatore, laboratorio); § Riproducibilità : grado di conformità dei risultati ottenuti utilizzando lo stesso metodo con gli stessi
campioni di riferimento in diversi laboratori.
Tutte le prove di validazione sono state effettuate utilizzando una serie di campioni di riferimento: Campioni di riferimento ‘target’: campioni infetti da isolati che coprono la diversità genetica, la
distribuzione geografica e le eventuali diverse specie ospiti del patogeno. Campioni di riferimento ‘non target’: campioni infetti da patogeni simili che colpiscono la stessa specie
ospite, da patogeni geneticamente correlati (nel caso dei virus vegetali stesso genere), campioni non
infetti appartenenti alla stessa specie ospite.
34