La rete dei laboratori diagnostici di riferimento Marina Barba CREA- Centro di Ricerca per la Patologia Vegetale- ROMA 1 Il Decreto Legislativo 19 agosto 2005, n. 214! "Attuazione della direttiva 2002/89/CE concernente le misure di protezione contro l'introduzione e la diffusione nella Comunità di organismi nocivi ai vegetali o ai prodotti vegetali“! Introduce la rete laboratoristica nazionale (RLN) e definisce il ruolo del laboratorio nazionale di riferimento (LNR)! LRN! Laboratori dei servizi fitosanitari regionali Laboratori pubblici e privati ufficialmente riconosciuti dai servizi I laboratori della rete nazionale REQUISITI TECNICI 1- Personale 2- Ambiente di lavoro 3- Protocolli di diagnosi 22/09/15 3 REQUISITI TECNICI 1- Personale Il personale deve essere addestrato, aggiornato e organizzato in funzione della diversa professionalità 22/09/15 4 Organizzazione corsi Lezioni teoriche Laboratorio 22/09/15 5 REQUISITI TECNICI 2- Ambiente A- Organizzazione idonea dei locali (ricevimento campioni, preparazione campioni, diagnosi, stoccaggio materiale, stoccaggio campioni, etc.) B- Controllo condizioni ambientali che possono influenzare la qualità della diagnosi C- Idonea gestione dei patogeni da quarantena 22/09/15 6 REQUISITI TECNICI 3- Protocolli di Diagnosi Il laboratorio DEVE utilizzare protocolli di riferimento VALIDATI, quando disponibili (EPPO standard, standards nazionali, regionali). Se non disponibili deve procedere a validare esso stesso dei protocolli. 22/09/15 7 VALIDAZIONE di un PROTOCOLLO DIAGNOSTICO - sensibilità analitica - specificità analitica - ripetibilità - riproducibilità 22/09/15 8 REQUISITI PER LA DIAGNOSI CAMPIONI STANDARD: A- CERTIFICATI: provenienti da una fonte certa (fonte riconosciuta internazionalmente o collezioni nazionali), codificato e con una tracciabilità B- ‘DI RIFERIMENTO’: devono essere documentati ed idonei per il test. Possono consistere in campioni biologici o preparazioni di acidi nucleici. 22/09/15 9 Compiti del LRN:! 1. Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali! 2. Trasferire i protocolli ufficiali a tutti i laboratori della rete! 3. Formare ed aggiornare il personale della rete laboratoristica! 4. Mantenere una collezione di patogeni di riferimento! 5. Organizzare test inter-laboratorio (PT e RT)! 6. Fornire supporto tecnico-scientifico alle autorità competenti! Armonizzazione di tutti i partner coinvolti in diagnosi ufficiali e nel controllo fitosanitario 1. Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali! Il Mipaaf ha finanziato negli ultimi anni alcuni progetti per la messa a punto di protocolli ufficiali per la diagnosi di agenti patogeni coperti da norme fitosanitarie.! Quali patogeni? • • • Malattie emergenti Patogeni per i quali non esisteva un protocollo ufficiale Patogeni che rappresentavano un “problema”fitosanitario Spedito un questionario a tutti i S.F.R. 11 1. Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali (ARNADIA)! Virus e viroidi Phytoplasmi ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’ ‘Candidatus Phytoplasma mali’ Funghi - Tilletia indica • Plum pox virus - PPV • Potato Spindle Tuber Viroid - PSTVd • Grape viruses (GLRaV 1, 2, 3, GVA, GVB, GFLV, ArMV, GFkV); • Pepino mosaic virus - PeMV • Tomato infectious chlorosis virus - TIC and Tomato chlorosis virus – ToCV - Monilinia fructicola - Phytophthora ramorum Batteri - Gibberella circinata - Ceratocystis platani - Funghi terricoli: Chondrostereum pupureum, Verticillium dahlie, V. albo-atrum, Armillariella mellea, Nectria galligena, Phytophthora cactorum • Erwinia amylovora • Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis • Xanthomonas arboricola pv. pruni 12 1. Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali (ARNADIA)! METODO DI LAVORO q Gruppo di lavoro: ! - Scelta di protocolli diagnostici da sottoporre a valutazione e validazione secondo criteri internazionali (UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2005).! - Discussione dei risultati e calcolo dei parametri di validazione: scelta finale del protocollo(i)! ! q Test interlaboratorio con i laboratori della rete nazionale (SS.FF.RR.) per stabilire il parametro di riproducibilità e aumentare la “robustezza” e armonizzazione del metodo! 1. Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali (ARNADIA)! Un esempio…. PROTOCOLLO DIAGNOSTICO PER I “Virus della vite coperti da norme fitosanitarie” Gruppo di lavoro Ø CRA-PAV Ø FEM-IASMA Ø CRA-VIT Ø ERSA - FVG Ø CNR-IVV Bari Ø CAV - Faenza Ø CNR-IVV Gugliasco Ø CRSFA - Locorotondo Ø Università di Milano Ø IPAD -Lodi Ø Università di Bologna Ø VCR - Rauscedo Ø Università di Pisa 14 1. Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali (ARNADIA)! Laboratori della rete laboratoristica nazionale che hanno preso parte al Ring test Ø Ø Ø Ø Ø SFR SFR SFR SFR SFR Trentino (Laimburg)! Emilia Romagna! Lombardia! Valle d’Aosta! Friuli Venezia Giulia (ERSA)! 15 1. Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali (ARNADIA)! METODOLOGIE SCELTE E SOTTOPOSTE A VALIDAZIONE ELISA con antisieri Agritest (8), Bioreba (9), Sediag (8)! Virus: GLRaV 1, 2, 3, GVA, GVB, GFLV, ArMV, GFkV! Multiplex RT-PCR rif. Gambino G. and Gribaudo I. 2006. Phytopathology 96 (11): 1223-1229)! Estrazione Kit commerciale, ! Virus: GLRaV 1, 2, 3, GVA, GVB, GFLV, ArMV, GFkV 16 ! 1. Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali (ARNADIA)! CAMPIONAMENTO La matrice vegetale da utilizzare per tutti i protocolli è il floema prelevato da tessuto sottocorticale Periodo di prelievo: durante tutto il periodo di dormienza Tipologia: tralci lignificati di un anno. 2 porzioni legnose prelevate nella parte basale. Conservazione: i campioni da saggiare devono essere conservati asciutti, posti in buste di plastica e conservati in luogo fresco fino all’utilizzo Tracciabilità: ogni campione deve essere etichettato sulla busta e sulla pianta Spedizione: i campioni devono essere consegnati al laboratorio diagnostico entro 72 ore dal prelievo in pacchi refrigerati 17 Lista dei campioni (122) e loro stato sanitario 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 GLRaV 1 + GLRaV 2 + GLRaV 3 + GVA+ GFkV GVA GVB SANO SANO SANO GLRaV3 + GVA GFLV GFkV POOL DA 42 (GLRaV1, GVA,GFLV) GLRaV 3 , GFLV GVA, GLRAV1, GLRaV3 ArMV, GFLV, GLRaV1 GLRaV-1 POOL DA 107 (GLRaV1) sano POOL DA 106 (GFKV) ArMV ArMV (GRSPaV) GVA, GRLaV2, GLRaV3 GLRaV-3+GVA GLRaV-1 , GFkV, GFLV SANO SANO GVA + GFLV GLRaV-1 GLRaV-3 GVA POOL DA 93 (GFLV) GFkV sano GLRaV 3 GVA SANO sano SANO ArMV, GFLV, GFKV, GLRaV1, GVA POOL DA 63 (GLRaV2-3, GVA) GLRaV 2 + GFkV POOL DA 66 (GLRaV2, GLRaV3,GVA) GLRaV-1 ArMV GVA – GFkV – GLRaV-3 GFLV + GLRaV1 + GVA 22/09/15 POOL SANO GLRaV1 GLRaV3 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 SANO SANO POOL DA 18 (ArMV) SANO GLRaV 3, GFkV, GFLV SANO sano POOL DA 44 (GLRaV1) SANO GVA + GFkV +GLRaV-3+GLRaV2 GFLV GLRaV3 SANO GVA+GLRaV1+GFLV sano sano Sano GLRaV 2 + GLRaV 3 + GVA POOL DA 12 (GVA,GLRaV1-3) SANO GLRaV 2, GLRaV 3 GVA SANO GLRaV 2 (isolato BD) GFLV – GFkV – GLRaV-3 GFLV GVA – GFkV – GLRaV-3 GFkV+ GLRaV 2 + GLRaV 3 + GVA GFkV POOL DA 1 (GLRaV1-2-3,GVA,GFkV) ArMV, GFKV GLRaV2 GLRaV3 GFkV + GLRaV2 GFLV, GFKV GLRaV3 GLRaV1 SANO Sano SANO POOL SANO sano Sano GVA, GRLaV2, GLRaV1 GLRaV2 (isolato BD) SANO GLRaV-1 e GVA 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 GFLV, GLRaV 3 GLRaV 1-3 e GVA GFLV SANO ArMV GVA SANO sano sano SANO SANO GFLV – GFkV – GLRaV-3 GLRaV 2 (isolato BD) GFkV, GLRaV3 GFKV GFkV GLRaV1 GVA sano SANO GLRaV 3 + GVA GLRaV 3, GVA, GFLV GFKV GLRaV 2 (isolato RG) POOL DA 70 (GFLV) POOL DA 112 (GLRaV3, GVA, GFLV) POOL GFLV POOL DA 72 (GFKV, GLRaV2-3,GVA) POOL DA 95 (ArMV) POOL DA 25 (GVA,GFLV) POOL DA 71 (GVA, GFKV,GLRaV3 POOL DA 113 (GFKV) I campioni sono stati analizzati in forma “anonima” dai laboratori 18 1. Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali (ARNADIA)! PARAMETRI DI VALIDAZIONE CALCOLATI ISO 17025; ISO 16140 (2003) – EPPO – Diagnostics PM7/76 e PM7/98 § Sensibilità diagnostica § Specificità diagnostica § Sensibilità analitica § Ripetibilità § Riproducibilità Campioni di riferimento ‘target’ Campioni di riferimento ‘non target’ 19 1. Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali (ARNADIA)! RISULTATI METODO ELISA Parameter Sensitivity Specificity Accurancy Repeatability Reproducibility Sensitivity pool Specificity pool Accurancy pool Repeatability pool AGRITEST GLRaV1 GLRaV2 GLRaV3 GFKV ArMV 89 86 81 85 64 97 100 100 100 85 93 90 84 88 74 100 94 100 100 100 92 88 98 92 94 85 32 66 72 64 100 95 94 100 94 89 59 75 84 81 100 94 100 100 100 GFLV 75 96 80 100 87 65 100 79 100 GVA 74 100 80 95 92 73 100 81 95 GVB 86 100 92 100 100 nt nt nt nt 20 RISULTATI METODO MOLECOLARE Sensitivity Specificity Accuracy Analytical sensitivity Repeatability Reproducibility GLRaV-1 74% 100% 94% 10-2 100% 70% GLRaV-2 84% 98% 85% 10-2 95% 83% GLRaV-3 100% 93% 95% 10-3 100% 100% GVA 96% 99% 98% 10-2 100% 94% GVB 100% 100% 100% 10-2 100% 100% ArMV 92% 99% 98% 10-2 100% 100% GFLV 68% 100% 90% 10-3 100% 76% GFkV 95% 95% 95% 10-2 100% 95% TOTAL 89% 98% 95% 99% 90% VIRUS/PARAMETER 21 ARNADIA: Grapevine-RING TEST– ACCURACY 100 Accuratezza relativa: il valore risultante dal calcolo della sensibilità diagnostica e della specificità diagnostica; 1:ELISA-A; 2:ELISA-B; 3:ELISA-S; 4:multiplex RT-PCR OPTIMAL ACCURACY 90 HIGH ACCURACY 75 MEDIUM ACCURACY 50 POOR ACCURACY 1 2 3 4 0 22 2. Trasferimento dei protocolli ufficiali a tutti i laboratori della rete Protocolli includono: q q Descrizione della malattia Campionamento: Numero di campioni! Periodo! Matrice! ü ü ü q q Descrizione del metodo Punti critici del metodo Sito istituzionale www.strateco.it Pubblicati su “PETRIA” 3. Formazione del personale della rete 1. Organizzazione di meeting/stage per il personale del settore (es.) • • “Il settore fitosanitario e l’EPPO: contributi e criticità”, Roma 23 febbraio 2011. Convegno “Potato spindle tuber viroid nel settore del vivaismo ornamentale: risultati di tre anni di ricerca e messa a punto di un modello di gestione aziendale certificante per piante viroid-free”. Sabaudia 25 Maggio 2012 2. Organizazione di corsi di formazione teorici(es.) • Corso di formazione per ispettori fitosanitari del Lazio • Corso di formazione per ispettori fitosanitari della Sicilia 3. Organizazione di corsi di formazione pratici (lab) es. • Phytophthora ramorum: PCR/nested PCR • Ceratocystis platani : real time PCR • Potato spindle tuber viroid : RT-PCR and real time RT-PCR 24 4. Mantenimento di collezioni ufficiali di isolati patogeni di riferimento! Col.Mia: collezione di riferimento Italiana per i microrganismi La collezione contiene riferimenti dettaglaiti di più di 1.350 microorganismi sia di interesse agro-industriale, sia fitopatogeni, entomopatogeni e del suolo COLMIA è membro del World Federation for Culture Collection (WFCC) con il numero WDCM945. Informazioni dettagliate disponibili sul sito: www.colmia.it 25 5. Organizzare test inter-laboratorio (PT e RT)! ! Quali patogeni? • • • Malattie emergenti Patogeni per i quali esiste un protocollo ufficiale Patogeni che rappresentano un “problema”fitosanitario Spedito un questionario a tutti i S.F.R. 26 Il Laboratorio di riferimento nazionale DEVE essere accreditato secondo ISO 17025 ACCREDIA è l’ente nazionale accreditatore CREA-PAV ha fatto domanda per l’accreditamento dei seguenti protocolli:! • • • • • • ELISA per la diagnosi di Plum pox virus e di Pepino mosaic virus! RT-PCR per la diagnosi di Pospiviroidi! PCR per la diagnosi di Monilinia fructicola ! Real time PCR per la diagnosi di Guignardia citricarpa! PCR per la diagnosi di Pseudomonas syringae pv actinidiae! PCR per la diagnosi di Clavibacter michiganensis pv michiganensis ! Organigramma:! DIRECTOR TECHNICAL AREA MANAGERs QUALITY MANAGER LABORATORY TECHNICIANS Criticità: • Alti costi per ottenere e mantenere lo status di ACCREDITAMENTO • Gestione tecnica (tarature strumenti ecc.) • Problemi amministrativi (la gestione riguarda tutto il CRAPAV) • Gestione di un laboratorio dove vengono svolte anche altre attività non in Accredia o di ricerca Nessun problema: per eseguire le procedure di validazione 6 . Fornire supporto tecnico-scientifico alle autorità competenti! ! Il Laboratorio di Riferimento fornisce supporto tecnico-scientifico al Mipaaf riguardo: - Gestione delle malattie emergenti - Raccolta dei dati di monitoraggio - Caratterizzazione molecolare dei patogeni coperti da normativa fitosanitaria - Competenza scientifica per l’emanazione di provvedimenti ufficiali nei confronti di agenti patogeni di quarantena - Valutazione di PRA In conclusione È in fase di pubblicazione il decreto per il riconoscimento dei laboratori che a vario livello faranno parte della rete laboratoristica nazionale Il laboratorio nazionale di riferimento farà parte della rete laboratoristica europea dei laboratori di riferimento 22/09/15 30 In conclusione L’EPPO svolge un ruolo di estrema importanza nella armonizzazione dei vari aspetti che riguardano i protocolli di diagnosi e le norme relative all’accreditamento dei laboratori Dal 7 all’11 settembre il CREA-PAV ospiterà il 3° workshop riservato ai responsabili dei laboratori europei di riferimento 22/09/15 31 In conclusione Una efficiente rete laboratoristica nazionale • È alla base di una corretta e tempestiva diagnosi • Riduce il rischio di contenziosi • Consente di uniformare quanto più possibile le procedure di analisi su tutto il territorio • Eleva la qualità dei laboratori responsabili delle analisi ufficiali • Favorisce la professionalità e l’aggiornamento degli operatori 22/09/15 32 22/09/15 Grazie per l’attenzione 33 1. Stabilire protocolli di diagnosi di riferimento ufficiali (ARNADIA)! PARAMETRI DI VALIDAZIONE CALCOLATI (ISO 17025; ISO 16140 (2003) - EPPO – Diagnostics PM7/76 e PM7/98): § Sensibilità diagnostica: capacità del metodo utilizzato di rilevare la presenza del patogeno nei campioni sicuramente infetti dal patogeno in esame; § Specificità diagnostica: capacità del metodo utilizzato di NON rilevare la presenza del patogeno nei campioni non infetti dal patogeno in esame; § Sensibilità analitica: la più piccola quantità di entità infettiva che può essere identificata dal metodo diagnostico (nel caso di patogeni virali vegetali, che non possono essere quantificati in vitro, corrisponde alla diluizione limite dell’estratto iniziale nella quale il metodo utilizzato riesce ad individuare il patogeno); § Ripetibilità : grado di conformità dei risultati ottenuti in replicazioni, effettuate a intervalli brevi di tempo, del metodo utilizzando lo stesso campione di riferimento e nelle stesse condizioni di lavoro (strumentazioni, operatore, laboratorio); § Riproducibilità : grado di conformità dei risultati ottenuti utilizzando lo stesso metodo con gli stessi campioni di riferimento in diversi laboratori. Tutte le prove di validazione sono state effettuate utilizzando una serie di campioni di riferimento: Campioni di riferimento ‘target’: campioni infetti da isolati che coprono la diversità genetica, la distribuzione geografica e le eventuali diverse specie ospiti del patogeno. Campioni di riferimento ‘non target’: campioni infetti da patogeni simili che colpiscono la stessa specie ospite, da patogeni geneticamente correlati (nel caso dei virus vegetali stesso genere), campioni non infetti appartenenti alla stessa specie ospite. 34