Insegnamento: Basi Molecolari della funzione cellulare: ricadute

Insegnamento:
Basi Molecolari della funzione cellulare: ricadute applicative
Modulo IBP: Analisi delle strutture e dei meccanismi preposti alla funzione cellulare
Molecular bases of the cellular function: applications
Docenti
Analysis of the structures and mechanisms controlling the cell function
Docenti a contratto
Anno
I° anno
Corso di studi
Corso di Laurea Magistrale in Biotecnologie per la Salute
Tipologia
Attività affini e integrative
Crediti
3
SSD
BIO13
Anno Accademico
2016/2017
Periodo didattico
secondo semestre
Propedeuticità
nessuna
Frequenza
obbligatoria
Modalità di esame
Prova orale
Sede
IBP-CNR Via P. Castellino 111, 80131 Napoli
Organizzazione della
didattica
Obiettivi formativi
Lezioni frontali
Acquisire le tecniche ed i principi fondamentali di microscopia necessari per lo studio delle
strutture nonché di particolari funzioni/meccanismi cellulari. In particolare, lo studio dei
meccanismi di replicazione/riparazione/ricombinazione del DNA nelle cellule eucariotiche con
particolare riferimento alla risposta cellulare al danno del DNA: meccanismi di base e
metodologie di imaging. Studio delle dinamiche di interazione nonché dei meccanismi
molecolari e cellulari coinvolti nella risposta immunitaria degli organismi eucariotici. Il corso si
propone di fare acquisire allo studente la consapevolezza dell’importanza di nozioni teoriche
fondamentali per lo studio della struttura cellulare, che riguardano la scelta dello strumento,
la preparazione del campione, lo studio/caratterizzazione di specifici meccanismi cellulari.
The aim of this course is to provide the techniques and the fundamental principles of the
microscopy for the analysis of the cell structure as well as of specific cell
functions/mechanisms. In details, the course includes the study of the mechanism of DNA
replication/repair/ recombination in eukaryotic, particularly in the cellular response to DNA
damage: basic mechanisms and imaging methodologies. The study of the interaction
dynamics as well as the molecular and cellular mechanisms involved in the immune response
of eukaryotic organisms. The purpose of this course is to make students aware of the
importance of fundamental theoretical concepts for the study of cell structure, concerning
the choice of instrument, sample preparation, study/characterization of specific cellular
mechanisms.
Prerequisiti
Conoscenze e abilità fornite dal corso di Genetica, Biologia Cellulare, Biologia Molecolare
Knowledge and skills provided by the course of Genetics, Cell Biology and Molecular Biology
Contenuti del corso
Microscopia: principi fondamentali dell’osservazione microscopica, tecniche di contrasto e
studio di cellule viventi, varie tecniche di microscopia a fluorescenza per lo studio statico e
dinamico di funzioni cellulari, super-risoluzione e microscopia elettronica per lo studio della
struttura cellulare. Meccanismi di replicazione/riparazione/ricombinazione del DNA nelle
cellule eucariotiche e loro tecniche di analisi. Evoluzione della risposta immunitaria dell’ospite
ai patogeni: le dinamiche dell’interazione ospite-patogeno, la coevoluzione dei meccanismi
molecolari e cellulari delle specie interagenti, modelli e metodi per ricostruire la storia
evolutiva di una specie.
Microscopy: fundamental principles of the microscopic observation, contrast techniques and
study of living cells, several fluorescence microscopy techniques for the static and dynamic
study of cellular functions, super-resolution and electron microscopy for the study of cell
structure. Mechanisms of DNA replication/repair/recombination in eukaryotic cells and
analytical methods. Evolution of the host immune response to pathogens: the dynamics of
the host-pathogen interaction, co-evolution of the molecular and cellular mechanisms of the
interacting species, models and methods for the analysis and reconstruction of the
evolutionary history of the species.
Programma dettagliato
1. Microscopia per lo studio delle cellule:
• Principi fondamentali dell’osservazione microscopica
• Microscopio Ottico: componenti, strumenti ed accessori
• Tecniche di contrasto e studio di cellule viventi:
o Microscopia in campo scuro
o Microscopia a contrasto di fase
o Microscopia a contrasto interferenziale (DIC)
• Introduzione alla microscopia a fluorescenza
• Immunofluorescenza: principi e applicazioni
• Microscopia confocale
• La microscopia a due fotoni
• Le tecniche “F” e le loro applicazioni: “Fluorescence Resonance Energy Transfer”
(FRET), “Fluorescence Recovery After Photobleaching” (FRAP), “Fluorescence Loss In
Photobleaching” (FLIP), "Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy" (FLIM), ecc.
• La microscopia a super-risoluzione
• Principi e applicazioni della microscopia elettronica
• La microscopia correlativa
2. Meccanismi di replicazione/riparazione/ricombinazione del DNA nelle cellule eucariotiche.
Descrizione delle tecniche biochimiche, biofisiche e di “bioimaging” per lo studio di tali
processi:
• Esperimenti di immunoprecipitazione da frazioni cromatiniche per la analisi della
associazione dei fattori proteici replicativi alle sequenze di origine della replicazione
del DNA.
• Analisi della velocità delle forcine replicative mediante “DNA fibre track assays” e
“DNA combing”.
• Isolamento e identificazione di proteine sul DNA nascente (iPOND).
• Tecniche di “molecular imaging” per la analisi della co-localizzazione di proteine ai
siti danneggiati del DNA.
• Studio degli eventi di ricombinazione omologa in cellule di mammifero mediante
saggi di “sister-chromatid exchange” (SCE) ed analisi basata sull’uso di marcatori
fluorescenti.
• Studio dei meccanismi molecolari di replicazione/riparazione/ricombinazione del
DNA mediante sistemi in vitro basati su estratti di cellule di mammifero infettate con
virus e su estratti di uova di Xenopus laevis.
• Ricostituzione in vitro di complessi multi-molecolari mediante co-espressione di
proteine in cellule di insetto (sistemi MultiBac e BigBac).
• Studio di enzimi e fattori replicativi mediante analisi su molecole singole con “tools”
biofisici (“optical tweezers”).
3. Evoluzione della risposta immunitaria dell’ospite ai patogeni: le dinamiche dell’interazione
ospite-patogeno e la coevoluzione dei meccanismi molecolari e cellulari delle specie
interagenti.
• Principali strategie di adottate dai patogeni per eludere il sistema immunitario
dell’ospite. Meccanismi alla base della variabilità antigenica di virus e batteri.
• Evoluzione del sistema immunitario dell’ospite. Generazione della diversità dei geni
dell’immunità negli invertebrati (alcuni esempi: Artropodi, Protocordati,
Echinoidermi). Generazione della diversità dei geni dell’immunità nei vertebrati
(Agnati e Gnatostomi). Meccanismi alla base della generazione della diversità delle
immunoglobuline. Correlazione struttura e funzione delle molecole anticorpali. Basi
strutturali del legame antigene-anticorpo. Meccanismi effettori dell'immunità
umorale.
• Ruolo dei fattori biotici e dei fattori abiotici, ad es. cambiamenti ambientali quali
quelli climatici, nel modellamento della diversità delle specie nel tempo.
Modelli per l’analisi dell’ evoluzione delle sequenze. Analisi delle sostituzioni
nucleotidiche, essenziale per comprendere i meccanismi di evoluzione del DNA. I
cambiamenti delle sequenze nucleotidiche. Analisi della selezione naturale
(sostituzioni sinonime e non sinonime) per stimare il tasso di evoluzione e quindi
ricostruire la storia evolutiva di una specie.
• Metodi computazionali per la ricostruzione filogenetica.
• Costruzione di Alberi filogenetici:
• Matrici di distanza. UPGMA, Neighbour joining
• Metodi basati sul criterio di ottimizzazione. Massima Parsimonia, Massima
Verisimiglianza, Metodi Bayesiani
Dispense/appunti
•
Testi di riferimento