Sperimenta il BioLab

“Sperimenta il BioLab”
DNA e Computer:
conoscenze molecolari propedeutiche
all'analisi bioinformatica
Università degli Studi di Milano
Settore Didattico, via Celoria 20, Milano
Laboratorio 105
Indice
1. La doppia elica
2. Come è organizzato il DNA?
3. Caratteristiche strutturali dei cromosomi degli eucarioti
3.1
Le mappe cromosomiche e i bandeggi
4. Replicazione del DNA
5. Il concetto di gene
5.1 Il dogma centrale della biologia
5.2 Il genoma umano
6. Il gene eucariotico
7. RNA e trascrizione
7.1
RNA polimerasi eucariotiche
7.2
Promotori e fattori di trascrizione
7.3
Modificazioni post-trascrizionali dell’mRNA
7.4
Lo splicing
8. Il codice genetico e la traduzione
8.1
La sintesi proteica
9. Le mutazioni
9.1
Mutazioni genomiche
9.2
Mutazioni cromosomiche
9.3
Mutazioni geniche o puntiformi
pag. 2
pag. 3
pag. 4
pag. 5
pag. 6
pag. 7
pag. 7
pag. 8
pag. 9
pag. 10
pag. 11
pag. 11
pag. 13
pag. 13
pag. 15
pag. 16
pag. 19
pag. 19
pag. 19
pag. 20
10. Domande di autovalutazione
11. Glossario
pag. 22
pag. 29
1
1. LA DOPPIA ELICA
Una domanda cruciale che ci si poneva agli
inizi degli anni ’50 era come il DNA (sigla
dell'acido desossiribonucleico) svolgesse la sua
funzione. Per trovare la risposta a questo
quesito era indispensabile determinarne la
struttura chimica.
Nel 1953 James Watson e Francis Crick
riuscirono a decifrarla (Fig.1.1), determinando
l’inizio di una nuova era della biologia, quella
della biologia molecolare.
Oggi sappiamo che il DNA è un polimero, ossia
un insieme di tanti monomeri: i nucleotidi. Ogni
nucleotide è co-stituito da tre componenti (Fig.
1.2): uno zucchero (il desossiribosio) a cui sono
legati un gruppo fosfato e una base azotata
(adenina, A; guanina, G; timina, T; citosina, C).
Adenina e Guanina sono basi puriniche, Timina
e Citosina sono basi pirimidiniche. Gli atomi di
carbonio del deossiribosio vengono numerati da
1’ a 5’ (per distinguerli da quelli della base
Fig. 1.1 Struttura a doppio filamento di un breve segmento
azotata). La posizione 5’ è legata al gruppo
di DNA. I montanti della scala sono costituiti da molecole di
fosfato mentre l’ossidrile (OH) nella posizione
zucchero alternate a gruppi fosfato. La distanza tra i due
3’ è libero per formare il legame con il gruppo
montanti misura 2 nm. La distanza tra due basi azotate
successive lungo il filamento è di 0,34 nm. Le basi si
fosfato del nucleotide successivo. La molecola
incontrano sull’asse centrale dell’elica. Il passo dell’elica è di
di DNA è formata
3,4 nm (10 coppie di basi).
da due catene
polinucleotidiche
avvolte l’una intorno
all’altra con andamento
destrorso. Le due catene
sono antiparallele (Fig.
1.3), ossia i due singoli
filamenti sono orientati
in direzioni opposte. Gli
Fig. 1.2 Un nucleotide è formato da un gruppo
scheletri
zucchero–
fosfato, da uno zucchero a cinque atomi di carbonio
e da una base azotata. In questo caso è mostrato un
fosfato
si
trovano
desossiribonucleoside monofosfato, il monomero
all’esterno
mentre
le
del DNA.
basi
azotate
sono
rivolte verso interno. Le basi delle due catene sono unite tra
loro mediante legami idrogeno e si appaiano secondo una
regola di complementarietà precisa: adenina con timina A=T
(con formazione di due legami a idrogeno) citosina con guanina
G≡C (con formazione di tre legami a idrogeno). Ne consegue
che il legame A=T è più debole di quello G≡C. L’appaiamento
di una base purinica (più grande) con una pirimidinica (più
piccola) consente di mantenere costante il diametro dell’elica
del DNA (2nm). In base alle regole di complementarietà delle
basi, conoscendo la sequenza di uno dei due filamenti di una
Fig. 1.3 Schema di una molecola di DNA. I
due filamenti hanno orientamento 5’→3’
molecola di DNA è quindi possibile prevedere esattamente
opposto. L’ordine delle basi azotate lungo un
quella del filamento complementare. Inoltre, in una molecola di
filamento determina l’ordine delle basi lungo il
DNA a doppio filamento, la frequenza con cui compare
filamento complementare. Tra Adenina e
Timina sono presenti due legami a idrogeno; tra
l’Adenina sarà sempre uguale a quella con cui compare la
Guanina e Citosina sono presenti tre legami a
Timina e anche la frequenza Citosina e Guanina saranno uguali.
idrogeno.
2
2. COM’È ORGANIZZATO IL DNA?
L’intero DNA genomico di una cellula eucariotica è contenuto nel nucleo. Dal momento che
la lunghezza totale del genoma umano, se potessimo distendere e allineare tutti i cromosomi,
sarebbe di circa 2 metri e il diametro medio del nucleo è di soli 5-10 µm, il DNA deve
compattarsi di almeno 100.000 volte, attraverso diversi livelli di avvolgimento. Il
compattamento avviene attraverso l’interazione del DNA con proteine (cromatina) (Fig. 2.1).
Il livello più semplice di avvolgimento è il nucleosoma, costituito dalla doppia elica del DNA
avvolta attorno a un nucleo di 8 proteine basiche, gli istoni (il DNA è acido per la presenza
dei gruppi fosfato) che si assemblano a formare un ottamero. Questa struttura è chiamata
anche “collana di perle” dove le perle sono i nucleosomi e il filo della collana sono i tratti di
DNA fra un nucleosoma e l’altro (chiamati anche DNA linker).
Questa struttura viene resa ancora più compatta con un ulteriore avvolgimento della collana di
perle su se stessa a formare una struttura a solenoide, una fibra di 30 nm. Questa fibra, per
aumentare ulteriormente l’impacchettamento, è ancorata su una struttura di proteine acide,
chiamata matrice o scaffold, a formare vere e proprie anse. Il maggior grado di compattazione
del DNA si ottiene durante la mitosi. Alla metafase i singoli cromosomi risultano visibili
anche al microscopio ottico come formazioni bastoncellari.
a)
b)
Fig. 2.1 I livelli di organizzazione della cromatina
che danno origine ad un cromosoma euariotico.
a) Doppia elica di DNA
c)
d)
e)
f)
3
b)
“Collana di perle” di nucleosomi
c)
Fibre di nucleosomi addensati a forma di
solenoide
d)
Domini ad anse
e)
Spirali condensate
f)
Cromosoma metafasico
3. CARATTERISTICHE STRUTTURALI DEI CROMOSOMI DEGLI EUCARIOTI
Il cromosoma degli eucarioti è costituito da cromatina, un complesso di DNA, proteine
cromosomiche e RNA, che può presentarsi sotto forma di:
• Eucromatina che si colora debolmente perché despiralizzata; è geneticamente attiva;
• Eterocromatina che si colora bene perché condensata; è per lo più considerata come
geneticamente inattiva; replica nella fase S (Sintesi) del ciclo cellulare dopo
l’eucromatina e può, a sua volta, essere suddivisa in costitutiva (sempre spiralizzata)
e facoltativa (potenzialmente despiralizzabile).
Le proteine cromosomiche possono essere suddivise in:
• Proteine istoniche: hanno una carica positiva che facilita il loro legame col DNA. Ci
sono 5 tipi di istoni: H1 che sigilla il nucleosoma (Fig. 3.1), H2A, H2B, H3, H4 che
formano gli ottameri. Le sequenze amminoacidiche degli introni indicano un elevato
grado di conservazione tra specie filogeneticamente distanti;
• Proteine non istoniche: alcune hanno un ruolo strutturale, altre sono implicati in
diversi aspetti del metabolismo del DNA, quali replicazione, trascrizione, riparazione
e ricombinazione.
Core costituito
da 8 istoni
Istone H1
Fig. 3.1 Struttura dei nucleosomi
Nei cromosomi mitotici il centromero corrisponde al punto di collegamento dei due
cromatidi (Fig. 3.2). Da essi dipende il comportamento dei cromosomi alla mitosi ed alla
meiosi. Se i centromeri non funzionano correttamente avviene una non-disgiunzione dei
cromosomi. La regione del centromero contiene il cinetocoro al quale si attaccano le fibre del
fuso durante la divisione. Per l’attacco dei microtubuli ad un
centromero sono necessarie proteine che interagiscono con il DNA
centromerico.
Alle estremità dei cromosomi si trovano delle strutture speciali, i
telomeri, costituiti da una corta sequenza di nucleotidi ripetuta
migliaia di volte; nell’uomo la sequenza è TTAGGG. I telomeri
hanno la funzione di proteggere le estremità dei cromosomi ed
aiutano i sistemi di riparazione del DNA a distinguere le normali
estremità dei cromosomi da quelle generate dalla rottura della doppia
elica. Sono essenziali per impedire riarrangiamenti cromosomici che
Fig.3.2 Struttura del
possono essere deleteri per la cellula.
cromosoma
La localizzazione del centromero è una caratteristica costante dei
singoli cromosomi. In base alla posizione del centromero i cromosomi vengono classificati:
• se il centromero ha una posizione centrale, il cromosoma è definito metacentrico
(Fig. 3.3A);
• se è localizzato non esattamente in posizione mediana, il cromosoma è definito
submetacentrico (Fig. 3.3B);
• se infine il centromero è localizzato all’estremità del cromosoma, questo è definito
acrocentrico (Fig. 3.3C).
4
Alcuni cromosomi possono presentare, oltre a quella
del centromero, un’ulteriore strozzatura detta
costrizione secondaria. La porzione di cromosoma
che sporge viene denominata satellite e nelle
preparazioni citologiche è visibile sotto forma di una
masserella globoide di cromatina separata dal resto del
cromosoma per mezzo di un sottile filamento
cromatinico. Nei cromosomi umani, la costrizione
secondaria si trova sul braccio corto di tutti i
cromosomi acrocentrici.
3.1 Le mappe cromosomiche e i bandeggi
Fig. 3.3 Diversi tipi morfologici di
cromosoma (p, braccio corto; q, braccio
lungo; c, centromero; c.s., costrizione
secondaria; s, satellite).
Una differenza fondamentale tra procarioti ed eucarioti risiede nel fatto che i procarioti
hanno un singolo cromosoma, mentre la maggior parte degli eucarioti ha un numero
diploide di cromosomi (ogni cromosoma è presente in due copie) in quasi tutte le cellule
somatiche ed è quindi necessario poterli riconoscere e classificare.
L’insieme completo di tutti i cromosomi metafasici di
una cellula è definito cariotipo; il cariotipo è speciespecifico; quello umano normale diploide è costituito
da 46 cromosomi (22 paia di autosomi e un paio di
cromosomi del sesso o eterocromosomi: XX nella
femmina, XY nel maschio).
La ricostruzione del cariotipo o mappa
cromosomica viene effettuata attraverso la
costruzione del cariogramma (Fig. 3.1.1), ottenuto
appaiando i cromosomi metafasici omologhi e
ordinandoli secondo un sistema di classificazione
Fig. 3.1.1. Cariogramma dei cromosomi
metafasici dell’uomo.
internazionale.
L’identificazione inequivocabile di ogni cromosoma del cariotipo si ottiene con tecniche di
colorazione di specifiche regioni cromosomiche, chiamate bandeggi (Fig. 3.1.2). Esistono
diversi tipi di bandeggi e i principali sono:
• Bande Q ottenute mediante l’impiego di un colorante fluorescente, la quinacrina: le
bande più luminose corrispondono alle zone ricche in Adenina e Timina;
• Bande G ottenute col colorante Giemsa: le bande più scure corrispondono alle zone
ricche in Adenina e Timina e risultano quindi corrispondenti alle bande Q;
• Bande R ottenute mediante denaturazione al calore e opportuna colorazione: risultano
complementari alle Q e G perché la colorazione ha affinità per le basi Citosina e
Guanina.
Il bandeggio dei
cromosomi serve
per l’analisi citogenetica e per
disporre di punti di
riferimento per la
mappatura
dei
geni.
a
Fig. 3.1.2. Differenti esempi di tecniche di bandeggio di cromosomi umani:
a) Le bande Q si ottengono con la tecnica di bandeggio con quinacrina;
b) Le bande G si ottengono con la tecnica di bandeggio Giemsa.
5
b
4. REPLICAZIONE DEL DNA
Caratteristica peculiare del DNA è la sua capacità di autoreplicarsi, che rappresenta il
fondamento della trasmissione dell’informazione genetica. La modalità di duplicazione del
DNA era già stata intuita da Watson e Crick nel 1953, come conseguenza della struttura della
molecola stessa.
Il processo di duplicazione del DNA avviene nella fase S (sintesi) del ciclo cellulare (Fig. 4.1)
e deve essere completo perché la cellula possa andare incontro alla divisione cellulare.
G0
Ad ogni ciclo di divisione cellulare, ciascun
cromosoma deve essere fedelmente duplicato
in modo che ciascuna delle due cellule figlie
ne possa ricevere una copia identica. La
replicazione del DNA in tutte le cellule
viventi, dai batteri all’uomo, è un processo
complesso, che richiede l’intervento di più di
una dozzina di enzimi diversi.
La replicazione inizia in corrispondenza di
siti detti origini di replicazione (Fig. 4.2)
presenti ad intervalli lungo i cromosomi. In
questi siti, alcune proteine enzimatiche (ad
Fig. 4.1 Le quattro fasi principali del ciclo cellulare, G1, S,
esempio la DNA elicasi) srotolano la doppia
G2 e mitosi.
elica di DNA, rompendo i legami a idrogeno
tra le basi dei due filamenti complementari. Questo processo porta alla formazione delle bolle
di replicazione, ciascuna con due forcelle replicative in cui la replicazione del DNA procede
in senso opposto. I cromosomi eucariotici si duplicano rapidamente poichè la sintesi inizia a
partire da molte origini di replicazione presenti nel genoma. La velocità di sintesi della DNA
polimerasi eucariotica è di 50 basi al secondo: se in un cromosoma eucariotico fosse presente
una sola origine di replicazione, il cromosoma impiegherebbe 35 giorni per completare la sua
replicazione!
Negli eucarioti è detto replicone o unità di replicazione la porzione di DNA che va
dall′origine della replicazione ai due punti di terminazione della stessa, ovvero dove due
forcelle di replicazione di due bolle adiacenti si incontrano.
Fig. 4.2 L’immagine al microscopio
elettronico mostra il DNA che si
replica. Le particelle visibili lungo il
filamento sono i nucleosomi.
1, 2 e 3 sono disegni dello stesso tratto
di DNA come apparirebbero in stadi
successivi di replicazione, con in
evidenza l’origine della replicazione e
le forcelle di replicazione; le linee gialle
sono il filamento di DNA di partenza,
mentre le linee rosse sono il DNA di
nuova sintesi.
6
La polimerizzazione di una nuova catena di DNA (Fig. 4.3) si realizza grazie all’appaiamento
successivo di nucleotidi complementari alla catena "stampo“ che vengono uniti tramite
legami fosfodiesterici ad opera dell’enzima DNA polimerasi. La DNA polimerasi, per
iniziare il processo, ha anche bisogno di un innesco, detto primer, a cui attaccarsi per
procedere con la polimerizzazione. Durante la replicazione del DNA, il primer è costituito da
una corta sequenza specializzata di RNA (sintetizzata ad opera di una RNA polimerasi,
chiamata DNA primasi). Poichè la polimerizzazione avviene solo in direzione 5‘→ 3‘ la
sintesi dei nuovi filamenti può avvenire senza interruzione solo nella direzione di
avanzamento della forcella di replicazione (filamento guida), mentre nella direzione opposta
(filamento in ritardo) avviene attraverso l’assemblaggio di corti frammenti di 100-2000
nucleotidi, detti frammenti di Okazaki, da parte della DNA ligasi.
La replicazione è semiconservativa: ogni emielica (singolo filamento) della molecola madre
serve da stampo per la
sintesi di un nuovo
filamento, per cui ogni
doppia elica figlia sarà
costituita
da
un
filamento vecchio e da
un filamento nuovo
(Fig. 4.3). Le molecole
risultanti sono copie
esatte
dell’originale
quindi, da una doppia
elica madre derivano
due doppie eliche
figlie uguali tra loro e
Fig. 4.3 Rappresentazione grafica della replicazione del DNA, con la formazione dei due
uguali alla molecola
nuovi filamenti complementari ai filamenti “stampo” della molecola originaria.
madre.
5. IL CONCETTO DI GENE
La molecola del DNA, in quanto portatrice di informazioni, svolge un’importantissima
funzione nella riproduzione, nello sviluppo e nel normale funzionamento degli esseri viventi;
essa contiene infatti le informazioni per la sintesi delle proteine, le quali svolgono negli esseri
viventi i più svariati compiti. Queste informazioni sono codificate da unità funzionali
chiamate geni: ogni gene corrisponde ad un tratto di una molecola di DNA ed è caratterizzato
da una particolare sequenza di basi azotate. L’ordine con cui le basi azotate si succedono
lungo un gene specifica la proteina codificata dal gene stesso.
5.1 Il dogma centrale della biologia
Il dogma centrale della biologia è basato sul principio che l'informazione genetica fluisca dal
DNA verso l'RNA e che dall'RNA sia poi tradotta in PROTEINE (Fig. 5.1). Il DNA serve
come stampo per la propria duplicazione e per la sintesi di una molecola intermedia, detta
RNA messaggero (mRNA), che contiene le informazioni necessarie per la sintesi delle
proteine.
Questo processo è articolato in due tempi: nel primo, detto trascrizione, il DNA serve come
stampo per la sintesi di un filamento di RNA complementare; nel secondo, detto traduzione,
la sequenza di basi dell'mRNA è convertita in una sequenza di amminoacidi e dà luogo alla
sintesi della proteina. Inizialmente si pensava che le informazioni contenute nel DNA fossero
trasferite unidirezionalmente dal DNA all’RNA, ma nel 1970 la scoperta da parte di David
Baltimore e Howard Temin di un enzima, chiamato trascrittasi inversa, in grado di
sintetizzare DNA su stampo di RNA, ha rivoluzionato il dogma centrale, evidenziando come
in realtà le informazioni possano essere trasferite anche da RNA a DNA. Tuttavia non tutti i
7
geni codificano proteine; esistono alcuni geni il cui unico prodotto è una molecola di RNA (
ad esempio i geni per gli RNA ribosomiali, per i tRNA, ecc).
Fig. 5.1 Il flusso dell’informazione genetica.
5.2 Il genoma umano
Genoma è il termine utilizzato per descrivere l’insieme delle informazioni genetiche
contenute nel DNA delle cellule. In realtà i genomi delle cellule animali sono due: un
genoma nucleare, che comprende circa il 99,9995% dell’informazione genetica totale e un
piccolo genoma mitocondriale, che copre il rimanente 0,0005% .
Nell’uomo il genoma nucleare (Fig. 5.1.1) è costituito da 3.300 Mb, a sua volta suddivisibile
in un 25% che costituisce i geni e le sequenze correlate ai geni e in un 75% di DNA
extragenico. Del 25% di geni e sequenze correlate, il 10% è DNA codificante, mentre il 90%
è costituito da DNA non codificante.
Il DNA non codificante è costituito da pseudogeni, frammenti genici, introni, sequenze non
tradotte.
Il DNA extragenico (il 75% del genoma nucleare) è costituito per il 40% da sequenze
mediamente o altamente ripetute (ripetizioni in tandem, raggruppate o interperse) e per il 60%
da sequenze uniche o con un basso numero di copie.
Fig. 5.1.1 Organizzazione del genoma umano nucleare.
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6. IL GENE EUCARIOTICO
I geni eucariotici codificanti per la produzione
di proteine, presentano una differenza
sostanziale rispetto a quelli dei procarioti; essi
hanno infatti una struttura “discontinua”, vale a
dire che sono costituiti da regioni codificanti
chiamate esoni, intervallate da tratti non
codificanti, denominati introni (Fig.6.1). Il
trascritto primario (o pre-mRNA chiamato
anche hn-RNA, RNA eterogeneo nucleare)
negli eucarioti viene sintetizzato come molecola
precursore contenente esoni e introni, e deve
subire una serie di modificazioni a livello
nucleare prima di poter essere esportato nel
citoplasma (come mRNA) dove verrà tradotto
in proteine.
Fig.6.1 Schema della struttura di un gene nelle cellule
eucariotiche con la presenza di introni ed esoni alternati.
Gli introni sono una costante in quasi tutti i geni
degli eucarioti. Sono porzioni di gene che
vengono copiate nel trascritto primario di RNA, ma vengono eliminate durante il processo di
maturazione del mRNA. Gli introni si alternano con gli esoni che sono le porzioni di gene che
vengono mantenute nella molecola di un RNA maturo che esce dal nucleo per venire tradotta.
Il numero delle sequenze introniche e la loro lunghezza è molto variabile, ma hanno tutte
come basi d’inizio la coppia GT e come fine la coppia AG.
Gli introni rimossi dal pre-mRNA (Fig. 6.2), vengono trattenuti nel nucleo e degradati in sede
intranucleare. Gli esoni sono i tratti di pre-mRNA che vengono mantenuti e che sono esportati
dal nucleo sotto forma di mRNA maturo. Il processo maturativo che prevede la rimozione
degli introni dal pre-mRNA è chiamato “splicing”.
Più recentemente si è scoperto che esistono anche esoni “non codificanti” e quindi una
definizione più moderna di esone può essere questa: un tratto del trascritto primario che entra
a far parte della molecola di RNA maturo.
Trascrizione
Trascritto
primario
(pre-mRNA)
Splicing
mRNA maturo
Traduzione
Fig. 6.2 Schema riassuntivo delle fasi di maturazione di una molecola di mRNA trascritta da un gene strutturale di un
organismo eucariotico, prima di essere tradotta in proteina (CDS = sequenza codificante).
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7. RNA E TRASCRIZIONE
Chimicamente l’RNA è molto simile al
DNA: anch’esso è un polimero di nucleotidi
composto da quattro tipi di monomeri (Fig.
7.1). Una delle differenze è rappresentata
dallo zucchero, che è il ribosio in luogo del
desossiribosio
(Fig.7.2).
La
seconda
differenza è costituita da una delle basi, che è
l’uracile (U) al posto della timina. In questo
caso è l’uracile a legarsi all’adenina, mentre
la guanina si lega sempre alla citosina. La
terza differenza consiste nel fatto che, nella
maggior parte dei casi, l’RNA esiste come
catena singola e non a doppio filamento.
Fig. 7.1
Fig. 7.2 Differenze tra i costituenti molecolari
dell’RNA e del DNA.
Confronto fra la struttura del DNA e dell’RNA.
Le molecole di RNA vengono sintetizzate
attraverso un processo, conosciuto come
trascrizione del DNA, dove un filamento di
DNA funziona da stampo per la sintesi di un
filamento di RNA complementare.
La trascrizione presenta alcune similitudini con
la duplicazione del DNA: una delle due catene
del DNA funge da stampo, mentre i
ribonucleotidi, legati per azione dell’enzima
RNA-polimerasi, si allineano appaiando le
proprie basi a quelle esposte del DNA (Fig.
7.3).
Il processo può essere diviso in tre fasi:
• Fase di inizio: l’RNA-polimerasi si lega al sito promotore del DNA per mezzo dei
fattori trascrizionali. A seguito della formazione del complesso di inizio della
trascrizione i due filamenti del DNA si separano localmente in modo da esporre una
delle due catene alla copiatura. Il sito di inzio della trascrizione generalmente
corrisponde ad una base purinica.
• Fase di allungamento: l’RNA-polimerasi aggiunge altri nucleotidi al primo, e si
forma un tratto di catena ibrida DNA-RNA in corrispondenza del DNA a singola
elica. L’RNA-polimerasi si muove lungo il DNA, despiralizzando via via nuovi
segmenti di DNA. A monte dell’enzima la doppia catena di DNA si riforma lasciando
libero il filamento di RNA neoformato.
• Fase di terminazione: riconoscimento del punto di fine della sintesi dell’RNA, cioè
del sito terminatore. Quando l’ultima base è stata aggiunta alla catena di RNA, la
RNA polimerasi e la molecola di RNA si distaccano dallo stampo e la doppia catena
di DNA si riavvolge.
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RNA
RNA polimerasi
RNA
RNA
Fig.7.3
a) Rappresentazione schematica della trascrizione dell’RNA in cui è mostrato sopra il filamento stampo che
viene copiato durante la trascrizione e sotto il filamento complementare che ha la stessa sequenza della
molecola di mRNA trascritto, salvo la U al posto della T.
b) Lungo una molecola di DNA alcuni geni vengono trascritti utilizzando come stampo un’elica, altri
utilizzando l’elica complementare.
7.1 RNA polimerasi eucariotiche
Negli eucarioti sono presenti tre RNA polimerasi, che sintetizzano RNA per diversi tipi di
geni; quella per i geni codificanti le proteine è la RNA polimerasi II.
La tabella 1 illustra le differenti funzioni delle tre RNA polimerasi.
Posizione nella cellula
Geni trascritti
RNA pol I
nucleolo
rRNA 18S, 28S, 5,8S
RNA pol II
nucleo
mRNA
RNA pol III
nucleo
tRNA, rRNA 5S,
sn RNA
Tab 1: rRNA=RNA ribosomale; tRNA=RNA transfer; mRNA=RNA messaggero; snRNA= small nuclear RNA.
Gli RNA ribosomali (rRNA) vengono classificati in base alla loro velocità di sedimentazione misurata in Svedberg (S). Le unità
Svedberg sono unità di misura della velocità di sedimentazione di particelle in sospensione sottoposte a centrifugazione.
7.2 Promotori e fattori di trascrizione
In un gene, la regione a monte del sito di inizio della trascrizione (cioè il punto da cui la RNA
polimerasi inizia a “copiare” uno dei due filamenti del gene in una molecola di RNA) viene
chiamata promotore. Questa regione contiene i siti di legame per le RNA polimerasi e per
numerosi fattori trascrizionali “generali” che facilitano il legame delle polimerasi al DNA
(Fig. 7.2.1).
Il promotore dei geni degli eucarioti contiene una sequenza specifica che viene riconosciuta
dall’RNA polimerasi II; tale sequenza è la TATA box (dove box sta per contenitore, T è la
timina e A l’adenina) che si trova a circa 30 coppie di basi a monte del sito di inizio della
trascrizione. La presenza di una regione ricca di basi Adenina e Timina vicina al sito d’inizio
della trascrizione facilita l’apertura della doppia elica, dal momento che A e T sono unite da
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due legami idrogeno (mentre la coppia C e G è stabilizzata da 3 legami idrogeno) e sono
quindi più facilmente separabili.
L’integrità della TATA-box è essenziale affinché la RNA polimerasi possa iniziare
correttamente la trascrizione. La TATA-box è tipica dei promotori degli eucarioti, ma anche
nei procarioti è presente una sequenza molto simile con le stesse proprietà, la TATAAT-box.
Prima che l’RNA polimerasi possa legarsi al promotore è necessario che un fattore di
trascrizione, chiamato TFIID, si leghi al DNA in corrispondenza della TATA-box; a questo
primo fattore se ne legano in successione altri che formano il complesso di inizio della
trascrizione.
Un'altra sequenza importante del promotore è la CAAT-box (a una distanza di circa 80 coppie
di basi dal sito di inizio della trascrizione) la quale è un altro sito di riconoscimento per la
RNA polimerasi. Mutazioni della sequenza CAAT causano la riduzione della trascrizione.
Inoltre nei promotori dei geni eucariotici sono presenti molte altre sequenze regolatrici in
grado di legare fattori trascrizionali “specifici”, che modulano l’espressione di uno specifico
gene sia in senso positivo (aumentandola) che in senso negativo (diminuendola). Alcune di
queste sequenze regolatrici dei promotori sono comuni a molti geni, mentre altre sono
specifiche solo di alcuni geni e riconosciute da fattori di trascrizione presenti solo in alcuni
tessuti; in questo modo è possibile ottenere una trascrizione selettiva, importante nel
differenziamento cellulare.
Fig. 7.2.1 Reclutamento di fattori trascrizionali su sequenze di regolazione del gene.
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7.3 Modificazioni post trascrizionali dell’mRNA
Mentre nei procarioti l’mRNA
trascritto viene immediatamente
tradotto, negli eucarioti il pre-mRNA
subisce una serie di modificazioni
all’interno del nucleo (Fig.7.3.1). Il
processo di maturazione del premRNA prevede l’aggiunta di una
struttura in posizione 5’ chiamata
“cap”, di una sequenza “poli-A” in
posizione 3’e la rimozione degli
introni.
Il cap è costituito da un nucleotide
metilato della guanina, la 7-metil
guanosina, legato mediante tre gruppi
fosfato
al
primo
nucleotide
dell’mRNA. Esso viene aggiunto alla
Fig. 7.3.1 Modificazioni delle estremità del pre-mRNA eucariotico; il
molecola di RNA poco dopo l’inizio
cappuccio G e la coda di poli-A sono importanti per il corretto
della sua sintesi, quando il filamento
funzionamento dell’mRNA.
ha raggiunto la lunghezza di 20-30
nucleotidi. Il cap ha la funzione di stabilizzare la molecola di RNA e di favorirne
l’associazione con i ribosomi. Si è notato che le molecole di RNA prive di cap vengono
degradate velocemente. Dopo il cap si trova una sequenza di basi, di lunghezza variabile,
detta 5’UTR (UnTranslated Region), regione che non viene tradotta, a cui fa seguito la
regione codificante. A valle del codone di stop si trova invece la 3’UTR, una sequenza di
lunghezza variabile che rappresenta l’ultima parte del trascritto, a valle del codone di fine
trascrizione (codone di stop) e contenente la coda di poli-A.
La sequenza di poli-A viene aggiunta dopo la completa trascrizione dell’RNA a quasi tutti gli
mRNA (con l’eccezione degli mRNA codificanti per le proteine istoniche) con una serie di
fasi che prevedono il distacco degli ultimi 10–30 nucleotidi del trascritto, mediante taglio
enzimatico ad opera di una endoribonucleasi, e l’aggiunta di una serie di 100-250 nucleotidi
di adenina all’estremità del filamento. Il riconoscimento della posizione precisa dove
aggiungere il poli-A è determinato dalla presenza di una sequenza specifica (normalmente
AATAAA) chiamata segnale di poliadenilazione. Il poli-A partecipa al trasferimento
dell’mRNA nel citoplasma, alla traduzione e serve a stabilizzare la molecola di mRNA; la sua
lunghezza diminuisce con l’invecchiamento dell’RNA. Inoltre il poli-A è risultato essere
costituito da un numero maggiore o minore di nucleotidi a seconda della proteina da produrre;
per esempio, la sintesi di un ormone richiede un mRNA poco degradabile, e quindi con una
lunga coda di poli-A, mentre un fattore di crescita dovrà essere sintetizzato da un RNA
rapidamente degradabile e quindi con un corto poli-A. Infine è importante ricordare che sia
l’hnRNA (o pre-mRNA) che l’mRNA maturo sono associati a ribonucleoproteine che li
proteggono dalla degradazione e ne determinano una relativa stabilità, come nel caso degli
RNA presenti nella cellula uovo che devono essere stabili perché si attivano solo dopo la
fecondazione.
7.4 Lo splicing
Il processo di eliminazione degli introni e di saldatura degli esoni, o processo di splicing, è
essenziale per produrre una molecola di mRNA da cui tradurre una proteina con una sequenza
amminoacidica corretta. Un gene umano medio contiene 8/9 esoni, però esistono anche geni
di 363 esoni; un esone è lungo mediamente 150 bp mentre la lunghezza di un introne va da
3000 bp a 800.000 bp. Il meccanismo di rimozione degli introni, nella maggior parte dei premRNA nucleari, prevede l’intervento di piccole molecole di RNA chiamate snRNA (small
13
nuclear RNA) associate a catene polipeptidiche per formare un complesso denominato snRNP
(particelle ribonucleoproteiche nucleari piccole, si pronuncia snurp).
Una di queste snRNP, detta U1, riconosce un segnale specifico al confine esone-introne, sul
lato 5’ dell’introne, a cui si lega per complementarietà delle basi; una seconda snRNP, detta
U2, si lega all’estremità 3’ della sequenza intronica. Dopo le prime due, altre snRNP si legano
al complesso che prende il nome di spliceosoma; le proteine avvicinano le due estremità
dell’introne formando un’ansa a livello della quale vengono operati dei tagli che portano
all’eliminazione degli introni a cui segue la saldatura degli esoni.
Per circa la metà dei geni presenti nel genoma umano è possibile operare uno splicing
alternativo, eliminando, insieme agli introni, anche un esone. In questo modo, dallo stesso
trascritto primario, è possibile ottenere più mRNA maturi che porteranno alla formazione di
proteine differenti ( Fig. 7.4.1).
Siti di poliadenilazione
Fig. 7.4.1 Trascrizione e maturazione alternative tramite la scelta di vari siti di splicing e vari siti di
poliadenilazione. Il gene in questione codifica per la tropomiosina che è una proteina che regola la
contrazione nelle cellule muscolari.
L’inserimento nel trascritto maturo di alcuni esoni e non di altri dà come risultato messaggeri
che codificano per proteine diverse. Lo schema di splicing alternativo costituisce un
importante possibilità di regolazione dell’espressione genica, in tessuti diversi.
Un ulteriore vantaggio dello splicing alternativo consiste nel notevole aumento del contenuto
informativo del genoma: nell’uomo da cira 20.000 geni possono essere prodotte più di 80.000
proteine diverse.
Una volta terminato il processo di maturazione, gli mRNA passano nel citoplasma per
svolgere la loro funzione nella sintesi proteica.
14
8. IL CODICE GENETICO E LA TRADUZIONE
Una volta identificato l’mRNA come
molecola
deputata
a
trasferire
l’informazione dal DNA alle proteine
(Fig.8.1), resta da comprendere come i
4 nucleotidi di cui sono composti gli
acidi nucleici possano specificare la
sequenza delle proteine, che sono
costituite da 20 amminoacidi diversi.
• Se ogni nucleotide “codificasse” per
un amminoacido, le quattro basi
potrebbero determinare solo quattro
amminoacidi. Se un amminoacido
corrispondesse a due nucleotidi, vi
sarebbero un massimo di 16 possibili
combinazioni (42) , mentre se si fanno
corrispondere a un amminoacido tre
Fig.8.1
L’informazione genetica passa dal DNA all’RNA per essere
nucleotidi in sequenza (ovvero un
utilizzata per dirigere la sintesi proteica nel citoplasma.
“codone”),
il
numero
delle
combinazioni possibili (43 = 64) è sufficiente e addirittura ridondante, per codificare 20
amminoacidi diversi. Il codice a triplette (Fig.8.2) fu universalmente accettato come ipotesi di
lavoro, e decifrato, negli anni ’70, molti anni dopo la scoperta della struttura del DNA, da
Marshall Nirenberg e Heinrich Matthaei.
• Delle 64 possibili combinazioni di triplette 61 codificano per amminoacidi e tre sono
segnali di arresto della sintesi proteica. Essendoci 61 combinazioni codificanti per 20
amminoacidi è chiaro che devono esserci più codoni per ogni amminoacido (si dice che il
codice è ridondante).
• Insieme alla decifrazione del codice, si arrivò alla elencazione delle sue più importanti
proprietà generali:
-
è composto da triplette nucleotidiche: ogni codone è composto da tre nucleotidi;
-
non è sovrapposto: ogni nucleotide dell’mRNA appartiene soltanto ad un codone;
-
è privo di virgole: durante la traduzione, i codoni sono letti consecutivamente, non ci
sono né virgole né altre forme di punteggiatura all’interno delle regioni codificanti le
molecole dell’ mRNA;
-
è degenerato: tutti gli amminoacidi, eccetto due (metionina, met e triptofano, trp), sono
specificati da più di un codone;
-
è ordinato: i molteplici codoni specifici per un amminoacido e quelli codificanti
amminoacidi con proprietà chimiche simili, risultano essere correlati, differendo di solito
per un singolo nucleotide;
-
contiene codoni di inizio e di termine;
-
è quasi universale: con poche eccezioni (ad esempio, il DNA mitocondriale e quello dei
cloroplasti), i codoni hanno lo stesso significato in tutti gli organismi viventi.
15
Fig. 8.2 Il codice genetico formato dalle 64 possibili triplette (codoni) e, a
fianco, i corrispondenti amminoacidi indicati con l’abbreviazione inglese a tre
lettere.
8.1 La sintesi proteica
Una volta decifrato il codice genetico ci si può chiedere come l’informazione codificata dal
DNA e trascritta nell’mRNA possa specificare la sintesi di una determinata catena
polipeptidica contenente una sequenza definita di amminoacidi.
Questo processo viene chiamato traduzione (Fig. 8.1.1).
I princìpi base della sintesi proteica sono comuni alle cellule procariotiche ed eucariotiche,
anche se esistono alcune differenze notevoli che saranno meglio evidenziate al termine di
questa trattazione.
La sintesi delle proteine richiede oltre
all’mRNA anche altri due tipi di RNA:
l’RNA ribosomale (rRNA) e l’RNA di
trasferimento (tRNA). Queste molecole
differiscono dall’mRNA sia per la struttura
che per la funzione. Vengono trascritte da
geni presenti in copie multiple nel DNA della
cellula;
come
l’mRNA,
subiscono
maturazione nel nucleo e vengono esportate
nel citoplasma.
I ribosomi, il macchinario molecolare
deputato alla sintesi proteica, sono dei
complessi macromolecolari costituiti da
proteine e da rRNA, presenti sia nelle cellule
eucariotiche che procariotiche. Sebbene i
ribosomi eucariotici siano più grandi di
quelli procariotici, la loro struttura generale è
Fig. 8.1.1 La sintesi proteica: rappresentazione schematica di una
la stessa. Ogni ribosoma risulta infatti
molecola di mRNA percorsa da un ribosoma. La traduzione della
costituito da una subunità maggiore ed una
sequenza nucleotidica in una sequenza amminoacidica avviene tramite
l’appaiamento tra i codoni dell’mRNA e gli anticodoni portati dai tRNA
subunità minore. Le dimensioni delle
che a loro volta recano uno specifico amminoacido legato all’estremità 3’.
subunità ribosomiali e delle molecole di
16
rRNA che le compongono vengono in genere
espresse in unità Svedberg (S).
Negli eucarioti i ribosomi (80S) sono costituiti da
una subunità maggiore di 60S e una minore di 40S
(si noti che le unità Svedberg non sono additive).
La subunità minore (40S) contiene una singola
molecola di rRNA (18S), mentre quella maggiore
(60S) contiene tre rRNA (28S, 5,8S e 5S). La
struttura dei ribosomi procariotici è più semplice
comprendendo solo tre rRNA, un rRNA (16S) per
la subunità minore (30S) e due rRNA (23S e 5S)
per la subunità maggiore (50S).
Le subunità ribosomiali negli eucarioti si
assemblano all’interno del nucleolo, dove avviene
la sintesi degli rRNA, e poi passano nel citoplasma
attraverso i pori nucleari. Le due subunità si
associano a formare il ribosoma funzionante solo in
presenza di molecole di mRNA e di tRNA
Fig. 8.1.2 Struttura di una molecola di tRNA.
iniziatore.
I tRNA (Fig.8.1.2) sono molecole relativamente
piccole, costituite da circa 80 nucleotidi legati insieme in un’unica catena con una
caratteristica configurazione a trifoglio dovuta a legami idrogeno che tengono uniti alcuni
nucleotidi.
La catena termina sempre con la tripletta CCA all’estremità 3’; a questa estremità avviene il
legame con l’amminoacido portato dallo specifico tRNA. Un secondo sito d’attacco è
costituito dai tre nucleotidi che formano l’anticodone, il quale è complementare a uno
specifico codone dell’mRNA. Una terza regione della molecola funziona come sito di
riconoscimento per l’enzima amminoacil-tRNA-sintetasi, che catalizza l’attacco di uno
specifico amminoacido alla corrispondente molecola di tRNA, in modo che l’amminoacido
sia pronto per essere inserito in un punto preciso della catena polipeptidica in via di
formazione.
Le cellule contengono più di 20 tipi diversi di molecole di tRNA, almeno uno per ciascun
amminoacido.
La traduzione si svolge in tre fasi: inizio, allungamento e terminazione.
 La fase d’inizio comincia quando la subunità ribosomale minore si attacca all’estremita 5’
del filamento di mRNA e lo percorre in direzione 3’ fino ad incontrare il primo codone di
inizio.

Questo codone è, in genere, 5’-AUG3’ ed è complementare all’anticodone 3’UAC-5’ del t-RNA che porta la metionina,
detto tRNA iniziatore. Nei procarioti questo
tRNA porta con sè una forma modificata
dell’amminoacido metionina, la formilmetionina (fMet), che sarà perciò il primo
amminoacido della catena polipeptidica in via di formazione. Generalmente, tuttavia,
completata la traduzione questo amminoacido viene rimosso dal polipeptide. L’unione fra
la subunità ribosomale minore, l’mRNA e il tRNA d’inizio costituisce il complesso
d’inizio. Una volta formatosi il complesso d’inizio, la subunità maggiore del ribosoma si
unisce alla minore e il tRNA d’inizio con la fMet si trova ad occupare il sito peptidilico
(sito P) della subunità maggiore che è uno dei due siti di legame con il t-RNA.
 Nella fase di allungamento sul secondo codone dell’mRNA che è esposto nel sito
amminoacilico (sito A) della subunità maggiore del ribosoma si lega un tRNA con un
anticodone complementare che porta l’amminoacido corrispondente. Si forma
17
successivamente un legame peptidico tra i due amminoacidi, con l’attacco della fMet al
secondo residuo della proteina nascente.

Il primo tRNA viene liberato, il ribosoma si sposta in avanti di un codone lungo la
catena di mRNA e, di conseguenza, il secondo tRNA a cui sono attaccati fMet e il secondo
amminoacido passa dalla posizione A alla posizione P; un terzo complesso amminoacidotRNAsi inserisce nella posizione A, adesso libera, di fronte al terzo codone dell’mRNA, e
l’operazione si ripete. A mano a mano che il ribosoma si sposta lungo la catena di mRNA,
la parte iniziale del messaggero rimane libera e un altro ribosoma può formare con essa un
complesso d’inizio, formando strutture chiamate polisomi (o poliribosomi), cioè un gruppo
di ribosomi che avanzano in fila indiana lungo una stessa molecola di mRNA.
 La fase di termine si verifica quando sul sito A del ribosoma si affaccia uno dei tre codoni
che hanno la funzione di terminare la traduzione (UAA, UAG e UGA). Non esistono tRNA
con anticodoni corrispondenti a questi codoni e, di conseguenza, nel sito A non entrerà più
alcun tRNA.

Quando si giunge a un codone di terminazione, la traduzione cessa, la catena
polipeptidica viene liberata e le due subunità ribosomali si separano.
Lo schema descritto è quello della sintesi proteica nei procarioti.
Le differenze più importanti nei processi di trascrizione-traduzione che si osservano negli
eucarioti rispetto ai procarioti sono:
 Negli eucarioti il primo amminoacido inserito è la metionina, portata da un tRNA
iniziatore che ha affinità per il sito P. Esiste un secondo tRNA per la metionina che, come
tutti gli altri tRNA, ha affinità per il sito A e consente l’inserimento delle metionine
interne alle proteine;

i geni procariotici sono raggruppati in operoni (gruppi di geni strutturali che vengono
trascritti in un’unica molecola di mRNA);

negli eucarioti trascrizione e traduzione sono separate nello spazio (nucleo e citoplasma) e
nel tempo;

di conseguenza, negli eucarioti la regolazione dell’espressione genica per ottenere
specifici prodotti può avvenire a molti livelli differenti: a livello di trascrizione, durante la
maturazione dell’mRNA, nella fase di trasporto dell’mRNA, nella fase di traduzione
dell’mRNA in proteine e a livello del controllo dell’attività proteica.
Il percorso che va dal DNA alle proteine ha molte tappe (Fig. 8.1.3), ognuna delle quali è
regolabile; una cellula può regolare le proteine da sintetizzare controllando quando trascrivere
un certo gene e con quale frequenza, controllando come modificare un trascritto primario di
RNA nello splicing o in altre fasi della sua maturazione, selezionando gli mRNA da tradurre
sui ribosomi, attivando o inattivando selettivamente proteine già sintetizzate.
Pur esistendo tutti questi meccanismi regolativi, per la maggior parte dei geni il controllo
della trascrizione è il meccanismo di regolazione prevalente. In questo modo non si formano
molecole intermedie inutili.
DNA
Fig. 8.1.3 L’espressione dei geni eucariotici può essere regolata a
diversi livelli.
18
9. LE MUTAZIONI
Le mutazioni sono alterazioni del corredo genetico (genoma) di un individuo.
Spesso derivano da errori nella replicazione del genoma. Le mutazioni possono essere
spontanee o indotte.
L'induzione di mutazioni si ottiene con mutageni fisici, chimici o biologici. I fattori fisici più
comuni nella mutagenesi sono le radiazioni UV, X e gamma. I raggi UV inducono la
formazione di un legame covalente tra due pirimidine adiacenti, bloccando così replicazione e
trascrizione del DNA; invece le altre radiazioni (dette ionizzanti) rimuovono elettroni dalle
molecole biologiche generando prodotti intermedi molto reattivi che causano diversi tipi di
danni DNA.
I mutageni chimici agiscono sul DNA già esistente oppure provocano errori nella sintesi del
nuovo DNA.
Non sempre l'azione di agenti mutageni causa una mutazione perchè il DNA non è l'unico
potenziale bersaglio. In alcuni casi, possono esserlo anche l’RNA o le proteine con
conseguenze meno rilevanti nella cellula. Inoltre, l'effetto mutageno è in relazione con la dose
e con l'efficacia dei meccanismi di riparazione pre-replicativa e post-replicativa di cui la
cellula dispone.
I prodotti genici che si ottengono dopo mutazione, quando questa non li renda del tutto privi
di senso o letali per la cellula, sono di solito inattivi o meno attivi di quelli originari oppure,
sebbene molto raramente, provvisti di attività maggiore o diversa.
Le mutazioni possono essere a carico delle cellule somatiche o germinali. Quelle a carico
delle cellule somatiche provocano danni all’individuo che le porta, invece quelle a carico
delle cellule germinali, cioè le cellule riproduttive, vengono trasmesse alla progenie.
Le mutazioni possono essere di tre tipi: genomiche, cromosomiche e geniche o puntiformi
9.1 Mutazioni genomiche
Consistono in una variazione del numero di cromosomi dovuta a perdita o aggiunta di interi
cromosomi. Si distinguono in:
•
•
Aneuploidie: sono molto gravi e si verificano quando ad un organismo diploide (2n)
viene a mancare (2n-1) oppure viene aggiunto (2n+1), un particolare cromosoma (es.
trisomia 21 o sindrome di Down, trisomia 13 o sindrome di Patau, trisomia 18 o
sindrome di Edwards, sindrome di Turner XO).
Poliploidie: compaiono quando si aggiungono uno o più corredi cromosomici
completi. In questo modo un individuo si trova a possedere, all'interno dei nuclei
delle sue cellule, un corredo cromosomico triplo (3n) o quadruplo (4n).
9.2 Mutazioni cromosomiche
Le mutazioni cromosomiche sono dovute a eliminazione di interi pezzi di cromosomi o
quando pezzi di cromosoma si fondono con altri già presenti o si duplicano cambiando la
struttura del cromosoma e influenzando la regolazione dell’attività dei geni in quanto questa
dipende, in parte, dalla localizzazione dei geni nel genoma. Le mutazioni cromosomiche
fortunatamente sono piuttosto rare. Si evidenziano i seguenti tipi di mutazioni cromosomiche
(Fig.9.2.1):
•
•
Delezioni e duplicazioni: portano alla perdita di piccoli segmenti durante la meiosi.
Questi s’inseriscono nel cromosoma omologo che viene quindi a possedere un tratto
del DNA duplicato. Dei due cromosomi omologhi, uno perde geni, mentre l’altro ne
acquista una quantità maggiore.
Traslocazioni: scambio di materiale cromosomico tra due cromosomi non omologhi.
19
•
•
•
Inversioni: sono dovute a pezzi di cromosoma che si staccano e s’inseriscono in
posizione capovolta.
Fusione centrica: fusione di due cromosomi con perdita di un centromero
Dissociazione centrica: fenomeno inverso alla fusione; in questo caso da un
cromosoma se ne ottengono due con formazione di un nuovo centromero.
delezione
Basi perse
traslocazione
inversione
Fig.9.2.1 Mutazioni cromosomiche
9.3 Mutazioni geniche o puntiformi
Le mutazioni geniche o puntiformi consistono in cambiamenti nella sequenza delle basi del
DNA. Le mutazioni puntiformi comprendono: le sostituzioni, le inserzioni e le delezioni.
Nello schema seguente sono mostrati diversi tipi di mutazioni puntiformi:
GAC-AAA-GGA-TGA-CTG SEQUENZA ORIGINALE
GAC-AAA-CGA-TGA-CTG SOSTITUZIONE DI G CON C
GAC-AAA-TGG-ATG-ACT-G
GAC-AA~G-GAT-GAC-TG
INSERZIONE DI T
DELEZIONE DI A
La sostituzione di una base azotata puo’ provocare:
a) Una mutazione “sinonima” se la tripletta codifica per lo stesso amminoacido. Questo
puo’ avvenire perche’ il codice genetico e’ degenerato, cioe’ ridondante e uno stesso
amminoacido può essere codificato da diverse triplette.
b) Una mutazione "missense" se l’effetto è quello di formare una tripletta che codifica
per un amminoacido diverso da quello iniziale. La proteina che incorporerà
quell’amminoacido può perdere o modificare la sua attività.
c) Una mutazione "non sense" se si forma una tripletta che non codifica per alcun
amminoacido (tripletta di stop o di arresto). Questo comporta l’arresto prematuro
della sintesi proteica a livello ribosomale.
d) Una mutazione di “allungamento” se una tripletta di stop viene sostituita da una
tripletta codificante.
La delezione o l’inserzione di basi determina uno slittamento (frameshift) nella lettura del
codice genetico che, come si usa dire, e’ un codice privo di punteggiatura. Quindi se in un
20
gene si inserisce o si perde una base, le triplette da quel punto in poi cambiano con
conseguente produzione di una catena polipeptidica completamente alterata.
E’ importante osservare che le mutazioni puntiformi dovute a sostituzioni di basi azotate
possono essere silenti, cioe’ non avere alcun effetto fenotipico. Questo puo’ avvenire per
diverse ragioni:
• la mutazione avviene in un gene che controlla la sintesi di una proteina non
indispensabile;
• La sequenza mutata non si esprime (zone introniche);
• la mutazione forma una tripletta che codifica per lo stesso amminoacido della tripletta
originaria;
• la mutazione viene soppressa da un’altra mutazione;
• la mutazione è una mutazione missense che inserisce un amminoacido
funzionalmente simile a quello originale e che quindi non altera la funzionalita’ della
proteina.
21
10. DOMANDE DI AUTOVALUTAZIONE
1) I cromosomi sono costituiti da:
a) DNA e proteine
b) RNA e proteine
c) solo RNA
d) DNA e RNA
e) solo DNA
2) Le diverse forme di un gene ad un dato “locus” sono dette:
a) caratteri
b) cariotipi
c) alleli
d) genotipi
e) fenotipi
3) Negli eucarioti superiori i cromosomi sessuali sono presenti:
a) solo nelle cellule diploidi
b) in tutte le cellule
c) solo nelle cellule somatiche
d) solo nelle cellule sessuali
e) solo nei gameti
4) Le aneuploidie cromosomiche possono consistere:
a)
nella presenza di un autosoma in più
b)
nella presenza di un cromosoma sessuale in più
c)
nell’assenza di un cromosoma sessuale
d)
nell’assenza di un autosoma
e)
tutte le risposte sono corrette
5) Quale tra le seguenti è una coppia complementare di basi nel DNA?
a) adenina e citosina
b) guanina e adenina
c) timina e guanina
d) timina e adenina
e) tutte le risposte sono corrette
6) Nel DNA quali componenti sono rivolte verso l’esterno della doppia elica?
a) zuccheri
b) basi azotate
c) gruppi fosfato
d) zuccheri e basi azotate
e) zuccheri e gruppi fosfato
7) Grazie all’enzima DNA polimerasi:
a) i nucleotidi si legano tra loro
b) si formano legami ad idrogeno
c) si rompono legami ad idrogeno
d) si uniscono basi complementari
e) il DNA viene trascritto in mRNA
8) Le informazioni contenute in un gene determinano la produzione di:
a) un lipide
b) un nucleotide
c) una proteina
22
d)
e)
un acido nucleico
uno zucchero
9) Nel codice genetico:
a) il linguaggio è lo stesso per tutti gli esseri viventi
b) non esiste “punteggiatura”
c) un amminoacido può essere codificato da più triplette
d) l’unità di codice è la tripletta
e) tutte le risposte sono esatte
10) Quale delle seguenti molecole non interviene nel processo di traduzione?
a) DNA
b) mRNA
c) rRNA
d) amminoacil-tRNA-sintetasi
e) tRNA
11) Una mutazione nella quale un frammento di DNA viene spostato su un altro cromosoma
viene detta:
a) traslocazione
b) duplicazione
c) delezione
d) sostituzione
e) clonazione
12) Quale dei seguenti è un esempio di mutazione genica?
a) uno scambio di frammenti tra cromosomi
b) la perdita di un frammento di cromosoma
c) la trisomia del cromosoma 21
d) la mancanza di un intero cromosoma
e) la sostituzione di un nucleotide
13) Quale dei seguenti codifica per un polipeptide?
a) un nucleotide
b) una tripletta
c) un gene
d) un telomero
e) un introne
14) Quale di queste affermazioni sul codice genetico è corretta?
a) si basa sulla combinazione di tre nucleotidi
b) a ogni amminoacido corrisponde una sola tripletta
c) ad ogni tripletta corrisponde un solo amminoacido
d) sia a che b
e) sia a che c
15) Fra le molecole/strutture indicate, quale non partecipa direttamente alla sintesi di
polipeptidi?
a) tRNA
b) mRNA
c) DNA
d) la subunità minore del ribosoma
e) la subunità maggiore del ribosoma
23
16) Qual è la sequenza di RNA complementare alla sequenza 3’ACAGT5’?
a) 5’AUAUA3’
b) 5’ACUGU3’
c) 5’UCUGA3’
d) 5’GCGCU3’
e) 5’UGUCA3’
17) Quale delle seguenti affermazioni in merito alle mutazioni è errata?
a) possono avvenire spontaneamente
b) si possono provocare
c) non sono ereditabili
d) non sempre sono letali
e) possono avvenire solo nelle cellule germinali
18) Come si definisce una mutazione che causa questa variazione nucleotidica? AATCGC -->
AATTGC
a) inserzione
b) delezione
c) sostituzione
d) inversione
e) mutazione frameshift
19) Una mutazione che consiste nell’aggiunta di un nucleotide alla sequenza di DNA è detta:
a) sostituzione
b) traslocazione
c) inversione
d) inserzione
e) delezione
20) Quando le cellule contengono tre copie di un cromosoma si parla di:
a) delezione cromosomica
b) trisomia
c) traslocazione cromosomica
d) poliploidia
e) allele multiplo
21) La sostituzione della timina con l’adenina in un gene è un esempio di:
a) inversione
b) mutazione cromosomica
c) mutazione puntiforme
d) traslocazione
e) mutazione dell’RNA
22) La poliploidia è un esempio di:
a) mutazione cromosomica
b) mutazione genica
c) mutazione puntiforme
d) traslocazione
e) mutazione genomica
23) La sequenza di basi azotate del DNA specifica:
a) la struttura del nucleo
b) l’attività dei ribosomi
c) la sequenza degli amminoacidi di una proteina
d) il cariotipo
24
e)
la struttura del cromosoma
24) L’informazione genetica del DNA è determinata:
a) dai 20 amminoacidi delle proteine
b) dalla sequenza di basi azotate
c) dall’alternanza di zuccheri e gruppi fosfato
d) dal numero di cromosomi
e) dal numero di geni
25) Che cos’è la cromatina?
a) un filamento di DNA che funge da stampo nella duplicazione del DNA
b) il centro organizzativo dei microtubuli di una cellula
c) il complesso di DNA e proteine presenti nel nucleo
d) i filamenti proteici che formano il fuso mitotico
e) il componente fondamentale dei ribosomi
26) Quanti cromosomi sono presenti nel nucleo di una cellula tetraploide, se il numero
diploide di cromosomi è 32?
a) 90
b) 16
c) 32
d) 48
e) 64
27) Che cosa si intende per aneuploidia?
a) un’alterazione nella struttura di un cromosoma
b) la condizione per cui si hanno cromosomi in più o in meno rispetto al normale
corredo cromosomico diploide
c) la mancanza di un tratto di cromosoma
d) l’inversione di un tratto di cromosoma
e) la presenza di un numero doppio di cromosomi rispetto al corredo diploide
28) Quando una porzione di cromosoma si stacca e si reinserisce capovolta si ha una:
a) inversione
b) delezione
c) poliploidia
d) traslocazione
e) duplicazione
29) Le due basi complementari di ogni coppia di basi azotate della doppia elica di DNA sono
legate una all’altra mediante legami:
a) fosfato
b) idrogeno
c) carbonio-carbonio
d) ionici
e) covalenti
30) La funzione della DNA polimerasi è:
a) rinforzare i legami tra le basi azotate
b) sintetizzare molecole di DNA
c) sintetizzare molecole di RNA
d) trasportare il DNA dal nucleo al citoplasma
e) inserire mutazioni nel DNA
31) Una mutazione puntiforme:
25
a)
b)
c)
d)
e)
interessa un’unica cellula
interessa una sola via metabolica
determina la perdita di un cromosoma
è sempre letale
comporta una variazione di uno o pochi nucleotidi
32) Le mutazioni che avvengono nelle cellule somatiche:
a) non sono trasmesse alla progenie
b) sono trasmesse alla progenie
c) non sono mai dannose
d) sono sempre dannose
e) sono sempre spontanee
33) Il codice genetico è uguale:
a) in tutti gli organismi, eccetto le piante
b) in quasi tutti gli organismi
c) in tutti gli organismi eccetto i batteri
d) in tutti gli organismi eccetto gli esseri umani
e) in tutti gli organismi eccetto i virus
34) Che cos’è un codone?
a) un tratto di cromosoma che codifica per un mRNA
b) una tripletta di mRNA che codifica per un amminoacido
c) una sequenza di tre amminoacidi in una proteina
d) una sequenza del DNA che funge da stampo per l’RNA polimerasi
e) un enzima coinvolto nella sintesi proteica
35) Quale o quali dei seguenti processi avviene/avvengono nel nucleo?
a) solo la duplicazione del DNA
b) solo la trascrizione del DNA
c) la trascrizione e la traduzione del DNA
d) la duplicazione e la trascrizione del DNA
e) la duplicazione, la trascrizione e la traduzione del DNA
36) Individua i due completamenti corretti.
Le proteine sono:
a) grandi monomeri
b) raggruppamenti di amminoacidi e acidi nucleici
c) molecole costituite da monomeri identici ripetuti
d) catene costituite da mattoni caratterizzati da specifici gruppi funzionali
e) polimeri di amminoacidi
37) Individua il completamento corretto.
L’emoglobina è costituita da quattro subunità
a) uguali
b) uguali a due a due
c) tutte diverse tra loro
d) completamente indipendenti
e) sono corrette le risposte c e d
38) Quali fra questi gruppi funzionali non sono presenti nella molecola di un generico
amminoacido?
a) un gruppo amminico
b) il gruppo alcolico
c) il gruppo variabile R
26
d)
e)
il gruppo carbossilico
il gruppo aldeidico
39) Per denaturazione di una proteina si intende:
a) un’alterazione della sua configurazione tridimensionale specifica
b) l’eliminazione di alcuni tratti della catena polipeptidica
c) un processo mediante cui la proteina diventa solubile in acqua
d) la possibilità per una proteina di trasformarsi in un altro composto organico
e) l’effetto di una mutazione
40) L’esatta sequenza del passaggio d’informazione genica nella cellula è:
a) DNA, traduzione, t-RNA, trascrizione, proteine
b) DNA, trascrizione , m-RNA, traduzione, proteine
c) m-RNA, trascrizione, , t-RNA, traduzione , proteine
d) RNA, trascrizione, DNA, traduzione, proteine
e) DNA, m-RNA , traduzione, trascrizione, proteine
41) Individua il completamento corretto.
In ogni ribosoma, i siti di legame per gli RNA di trasporto:
a) ospitano una coppia di amminoacidi attaccandoli con un legame peptidico
b) sono tre come i nucleotidi che compongono i codoni
c) si trovano nella subunità maggiore
d) sono i siti in cui si posiziona l’m-RNA che deve essere trascritto
e) facilitano il diretto legame tra gli amminoacidi e i codoni dell’mRNA
42) Individua il completamento corretto.
Senza le molecole di t-RNA una cellula non potrebbe:
a) trasportare nel citoplasma le molecole presenti nel nucleo indispensabili alla sintesi
proteica
b) copiare il messaggio contenuto nel filamento di DNA
c) separare i due filamenti che compongono la doppia elica del DNA
d) tradurre l’informazione genica contenuta nell’mRNA
e) sintetizzare molecole di mRNA
43) Il numero di codoni possibili in una cellula procariotica è
a) 4
b) 3
c) infinito
d) 64
e) tante quante sono le proteine
44) Nel DNA di una data specie, l’adenina costituisce il 28% in peso; in quale percentuale è
presente la guanina?
a) 72%
b) 28%
c) 22%
d) 50%
e) non si può determinare
45) Che cosa è un gene?
a) un cromosoma
b) una sequenza di amminoacidi
c) una sequenza di nucleotidi che può essere trascritta in RNA
d) una struttura costituita da due cromatidi contenuta nel nucleo di una cellula
e) un segmento di cromosoma che viene trascritto in DNA o in RNA
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46) La fase S del ciclo cellulare si verifica:
a) dopo la fase G2
b) prima della fase G1
c) fra la fase G1 e la fase G2
d) subito dopo la citodieresi
e) solo nel ciclo meiotico
47) Per quali aspetti differiscono il DNA e l’RNA?
a) per il fatto di essere costituiti da nucleotidi
b) perché solo il DNA contiene un gruppo fosfato
c) per la presenza di una diversa base azotata
d) perché solo l’RNA contiene uno zucchero pentoso
e) per la presenza di legami fosfodiesterici
48) Indicare il corretto ordine decrescente di dimensioni:
a) gene, cromosoma, nucleotide, codone
b) cromosoma, gene, codone, nucleotide
c) nucleotide, cromosoma, gene, codone
d) cromosoma, nucleotide, gene, codone
e) gene, cromosoma, codone, nucleotide
49) In un nucleotide del DNA:
a) il gruppo fosfato è legato allo zucchero ribosio
b) è presente solo una delle quattro basi azotate
c) vi è un atomo di ossigeno in più rispetto al corrispondente nucleotide dell’RNA
d) lo zucchero è un esoso
e) vi possono essere differenti tipi di gruppo fosfato
50) La replicazione del DNA:
a) richiede l’intervento di pochi enzimi e proteine
b) avviene in seguito alla rottura dei legami covalenti che uniscono tra di loro i
nucleotidi di un filamento
c) assicura la formazione di due molecole figlie identiche
d) è un processo molto lento
e) si verifica solo nelle cellule degli eucarioti
28
11. GLOSSARIO
Sequenza guida (leader) presente all’estremità 5’ della molecola di
5’UTR
mRNA maturo; tale sequenza non viene tradotta e varia in lunghezza tra
gli mRNA dei diversi geni
Una delle possibili forme alternative che un gene, localizzato in uno
Allele
specifico sito cromosomico, può assumere
Molecola contenente un gruppo amminico (NH2) ed un gruppo
Amminoacido
carbossilico (COOH)
Annealing
Formazione di molecole ibride di acidi nucleici basata sulla
(appaiamento)
complementarietà delle basi
Aploide
Cellula o individuo con una sola copia (n) di ciascun cromosoma
Indica una implementazione di un insieme di dati riguardanti uno stesso
argomento, o più argomenti correlati tra loro, strutturata in modo tale da
Banca dati
consentire che i dati possano venire utilizzati per diverse applicazioni e
possano essere aggiornati
Colorazione con cui si possono distinguere lungo il cromosoma
alternanze di aree chiare o scure. In seguito a colorazione specifica, ogni
Bandeggio
cromosoma umano può essere identificato attraverso il suo specifico
bandeggio
Molecole costituenti il filamento del DNA insieme allo zucchero
Basi azotate
deossiribosio e al gruppo fosfato. Sono quattro e si classificano in basi
puriniche (A e G) e pirimidiniche (T e C)
Approccio multidisciplinare al problema della gestione e della
elaborazione delle informazioni biologiche che combina competenze di
tipo computazionale, quali l’informatica, la matematica e la statistica con
conoscenze di tipo biomolecolare, quali la genomica, la proteomica, la
Bioinformatica
filogenetica, la biologia strutturale. L’obiettivo fondamentale della
bioinformatica è estrarre dalla sequenza del genoma degli organismi
viventi informazioni utili per la comprensione dei fenomeni biologici e
per lo sviluppo di nuove strategie biomediche e biotecnologiche per la
cura e la prevenzione delle malattie
Bolla di
Struttura in cui entrambi i filamenti dell’elica del DNA sono separati uno
replicazione
dall’altro e servono da stampo per la sintesi del nuovo DNA
La più piccola unità di costruzione di un organismo pluricellulare ed essa
Cellula
stessa, come unità singola, un organismo elementare
Cellula germinale Cellula deputata alla riproduzione (cellula uovo e spermatozoo)
Cellula destinata alla formazione del corpo (in greco “soma” )
Cellula somatica dell’organismo e contrapposta a quella della linea germinale, deputata
alla riproduzione
La costrizione primaria di un cromosoma che separa il braccio corto dal
Centromero
braccio lungo. Costituisce anche il punto di attacco delle fibre del fuso
per separare i cromosomi durante la divisione cellulare
Una tripletta nucleotidica che specifica un amminoacido o un segnale di
Codone
termine della traduzione
Dalla fine della fase S del ciclo cellulare fino all’anafase della divisione
cellulare, un cromosoma è costituito da due cromatidi fratelli identici.
Cromatidio
Ciascuno contiene una doppia elica completa ed è una esatta copia
dell’altro
Complesso di DNA, istoni e proteine non istoniche presenti nel nucleo di
Cromatina
una cellula eucariotica
Struttura formata da DNA e proteine dove sono localizzati in successione
Cromosoma
lineare i geni, osservabile nella cellula in divisione
Cromosomi
I membri di un paio di cromosomi, identici nella disposizione dei geni
29
omologhi
Denaturazione
Diploide
DNA
DNA
complementare
(cDNA)
DNA polimerasi
Elettroforesi
Enzima
Enzimi di
restrizione
Esone
Fenotipo
Gene
Geni omologhi
Geni ortologhi
Geni paraloghi
Genoma
Genotipo
Introne
Istoni
Locus
Mappa
cromosomica
Mutageno
Mutazione
presenti e nella loro struttura
Perdita della configurazione originale di una macromolecola, dovuta ad
es. all’aumento di temperatura, a cambiamenti estremi di pH, a
trattamenti chimici o altro; generalmente è accompagnata da una perdita
dell’attività biologica. Nel caso del DNA, la denaturazione consiste nella
separazione dei due filamenti della doppia elica, per rottura dei legami a
idrogeno tra le basi azotate
Organismo o cellula con due assetti cromosomici (2n) o due genomi
Abbreviazione di acido deossiribonucleico. Il DNA costituisce il
materiale genetico di tutti gli organismi e ha per lo più struttura a doppia
elica
DNA sintetizzato usando come stampo l'RNA messaggero e utilizzando
l’enzima trascrittasi inversa. La sequenza del DNA risulta pertanto
complementare a quella dell'RNA stampo
Enzima che sintetizza DNA unendo insieme nucleotidi e usando un
filamento di DNA come stampo
Tecnica che consente di separare molecole caricate elettricamente
mediante la migrazione in un campo elettrico
Proteina che accelera o catalizza una specifica reazione chimica in un
sistema vivente
Chiamati anche endonucleasi di restrizione, sono enzimi che tagliano il
DNA a doppia elica in corrispondenza di specifiche sequenze
nucleotidiche, dette siti di restrizione. La loro presenza all'interno delle
cellule è importante perché consente di degradare molecole di DNA
estraneo
DNA codificante che separa due introni vicini all’interno di un gene
eucariotico. Durante l’espressione genica gli esoni, come gli introni,
vengono trascritti in RNA, ma solo le sequenze esoniche vengono
mantenute nel trascritto maturo.
Caratteristiche osservabili in un organismo che risultano dall’interazione
tra genotipo e ambiente
Unità funzionale di eredità che corrisponde di solito al segmento di DNA
che codifica una proteina
Due o più geni le cui sequenze siano significativamente correlate a causa
di una stretta parentela evolutiva
Due o più geni le cui sequenze siano significativamente correlate a causa
di una stretta parentela evolutiva tra specie diverse
Due o più geni le cui sequenze siano significativamente correlate a causa
di una stretta parentela evolutiva all’interno della stessa specie
Quantità totale di materiale genetico di una cellula; negli eucarioti indica
anche l’assetto aploide dei cromosomi di una specie
Costituzione genetica di un organismo
DNA non codificante che separa due esoni vicini all’interno di un gene
eucariotico. Durante l’espressione genica gli introni, come gli esoni,
vengono trascritti in RNA, ma le sequenze introniche trascritte vengono
successivamente rimosse mediante lo splicing dell’RNA
Proteine basiche ricche in arginina e lisina che partecipano alla
formazione dei nucleosomi nei cromosomi eucariotici
Posizione fissa su un cromosoma occupata da un dato gene
Costituzione cromosomica di una cellula o di un individuo. Cromosomi
ordinati in base alla lunghezza e alla posizione del centromero
Agente ambientale, fisico o chimico, in grado di indurre mutazioni
Cambiamento del DNA in un particolare locus di un organismo; può
verificarsi spontaneamente oppure essere indotta da agenti chimici o
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fisici
Subunità sferica della cromatina eucariotica costituita da una parte
Nucleosoma
centrale ottamerica di istoni e da 146 coppie di basi non associate a
proteine (DNA linker)
Unità base del DNA e dell'RNA, formato da gruppo fosfato, zucchero
Nucleotide
pentoso e base azotata
Corta molecola di DNA (o RNA) a singolo filamento, costituita da poche
Oligonucleotide
decine di basi
Sequenza di 50/250 adenine aggiunte come modificazione postPoli (A)
trascrizionale alla estremità 3’ della maggior parte degli mRNA
eucariotici
Esistenza di forme diverse di: alleli (polimorfismo allelico), proteine
Polimorfismo
(polimorfismo proteico), DNA (polimorfismo del DNA)
Polinucleotide
Molecola costituita da più nucleotidi uniti da legami fosfodiesterici
Aumento del numero cromosomico per aggiunta di uno o più corredi
cromosomici completi. Ad esempio un individuo può possedere,
Poliploidia
all'interno dei nuclei delle sue cellule, un corredo cromosomico triplo
(3n) o quadruplo (4n)
Specifica regione del DNA che contiene il sito a cui si lega la RNAPromotore
polimerasi per avviare la trascrizione del gene
Sequenze del DNA che regolano l'espressione di un gene. La loro
Regioni di
presenza è pertanto necessaria per la corretta e efficace espressione del
controllo
gene
Replicone
DNA replicato a partire dall’origine di replicazione
Enzima che catalizza la sintesi di molecole di RNA da uno stampo di
RNA polimerasi
DNA, nel processo detto trascrizione
RNA ribosomale Molecole di RNA che, insieme alle proteine ribosomiali, compongono i
rRNA
ribosomi di procarioti ed eucarioti
Molecola di RNA coinvolta nella sintesi proteica; questa molecola porta
RNA transfer
gli amminoacidi al ribosoma dove vengono fatti corrispondere al
(tRNA)
messaggio trascritto sull’mRNA
RNA-messaggero RNA che trasporta ai ribosomi l'informazione genetica. A livello dei
(m-RNA)
ribosomi avviene la sintesi della proteina specifica (traduzione)
Sequenza di basi ben determinata riconosciuta e tagliata da un enzima di
Sito di restrizione
restrizione
Una struttura specializzata all’estremità dei cromosomi; consiste in una
Telomero
serie di corte ripetizioni in tandem, che proteggono le estremità del
cromosoma
Enzima ricavato dai retrovirus, una classe di virus che utilizzano come
materiale genetico RNA. L'enzima catalizza la sintesi di DNA
utilizzando come stampo la molecola di RNA genomico (attività DNA
sintetasi–RNA dipendente). Queste molecole, inizialmente a singolo
Trascrittasi
filamento, verranno trasformate a doppia elica (DNA copia o DNA
inversa
complementare o c-DNA) sempre ad opera della stessa trascrittasi
inversa (attività DNA sintetasi–DNA dipendente). I retrovirus
posseggono la trascrittasi inversa in quanto, per potersi replicare, devono
prima convertire il loro RNA in DNA e integrarsi nel genoma della
cellula ospite
Trascritto
RNA prodotto dalla trascrizione del DNA
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