Epatite C: epidemia antica o moderna?

Epatite C:
epidemia antica o moderna?
Luigi Tagliaferro
Lab. “Dr. Pignatelli” Lecce
Taranto, 25 Ottobre 2004
Epatite C



Storia delle Epatiti Virali
Virus Epatopatici
HCV






Quasispecie
Struttura/Biologia Molecolare
Epidemiologia
Sintomi
Fattori di Rischio
Diagnosi
Le Epatiti
 "Epatite virale" è un termine spesso adoperato
per indicare una serie di patologie epatiche
provocate da virus diversi (virus A-G, CMV, EBV,
ecc.).
 Anche se hanno nomi simili,
i virus delle epatiti
A-G hanno strutture diverse e sono classificati in
diverse famiglie.
 Molte infezioni sono tanto lievi da poter essere
trascurate, mentre altre evolvono verso
un'epatite fulminante che può rivelarsi fatale.
Le Pietre Miliari nella ricerca sui virus delle
epatiti (1)
EVENTI
ANNO
Prima descrizione di ittero epidemico (Ippocrate)
460 AC
Isolamento di pazienti itterici (Papa Zaccaria)
Possibile origine dei diversi genotipi di HCV
751
1000
(Smith et al., 1997)
Possibile origine dei diversi sottotipi 2 di HCV in Africa
(Simmonds, 2004)
1750
Epidemia di epatite nell’esercito di Napoleone in Egitto
1799
Casi di epatite associati con la vaccinazione del vaiolo
1883
Primo uso del termine “Epatite”
1900
Associazione fra epatite e infezione gastrointestinale
1916
Epatite
da
siero
immunoglobuline
associata
con
somministrazione
di
1945
Comparsa dell’epatite di “Nuova Delhi”, poi identificata come HEV
1955
Le Pietre Miliari nella ricerca sui virus delle
epatiti (2)
EVENTI
ANNO
Identificazione antigene Australia (HBsAg)
1963
Identificazione virus epatite B
1965
Identificazione virus epatite A
1973
Proposta dell'esistenza di un virus dell'epatite non A e non B
1975
Identificazione virus epatite D
1980
Identificazione virus epatite C
1988
Identificazione virus epatite E
1989
Introduzione dei test sierologici per l'epatite C
1990
Identificazione virus HGV/GBV-C
1995
Identificazione virus TTV
1997
Fonte: Christopher L. et al “Viral hepatitis”
Epatiti Virali
“infettiva”
Epatite virale
“da siero”
trasmissione
E
enterica
A
NANB
trasmissione
C parenterale
B D
F, G,
? altro
Epatiti Virali - Quadro Biologico
A
Vettore biologico
Via di
trasmissione
Infezione
cronica
Prevenzione
Tipologia delle Epatiti
B
C
D
feci
sangue/
emoderivati
fluidi corporei
sangue/
emoderivati
fluidi corporei
sangue/
emoderivati
fluidi corporei
oro-fecale
percutanea
permucosale
percutanea
permucosale
percutanea
permucosale
no
sì
sì
sì
E
feci
oro-fecale
no
pre/postpre/postscreening delle
pre/post- igiene ambientale;
esposizione;
esposizione
esposizione
donazioni;
potabilità
immunizzazione immunizzazione valutazione Immunizzazione,
idrica
Valutazione
del rischio
comportamentale del rischio
comportamentale
Epatite C (HCV)

L’HCV, un piccolo virus appartenente alla
famiglia delle Flaviviridae, è stato
identificato nel 1988 mediante clonazione
molecolare da un campione di sangue di
paziente infetto

E’ ritenuto il principale responsabile delle
epatiti che venivano precedentemente
definite non-A non-B.

Il virus non può essere coltivato in vitro in
maniera riproducibile e ciò ha ostacolato
le ricerche
Virioni di HCV
Fonte: EASL Consensus Statement (J. Hepatol. 1999, 30, 956-961)
The Flaviviridae
Phylogenetic tree of the NS3 helicase sequences
GBV-C/HGV
GBV-A
100
GBV-B
100
70
Flaviviruses
100
Pestiviruses
Hepaciviruses
(Hepatitis C viruses)
Fonte: EASL Consensus Statement (J. Hepatol. 1999, 30, 956-961)
Epatite C (HCV)
VARIABILITA’

La caratteristica forse più importante dell’HCV è la
grande variabilità della sequenza genomica.

Sulla base di questa eterogeneità genetica, gli isolati
virali che maggiormente differiscono nella sequenza
genomica sono stati suddivisi in sei genotipi (1 - 6).

All’interno di ogni genotipo sono stati successivamente
raggruppati in numerosi “sottotipi”, più di 90.

Recentemente (Mitchell et al, 2002) è stato proposto di
aggiornare la classificazione, aggiungendo i genotipi 7,
8, 9 (Vietnam e Thailandia, dapprima classificati come
“non 1-4”) e 10 (molto simile al 3a)
Albero filogenetico degli HCV
4d
4a(E)
4c
4g
4a(B) 4e 4h
4f
2(I)
5a
6a
6b
7c/NGII/VII
a
b
f
e
c
b
f
7b
d
c
d
7d
7a
e 11a
5
4
a
g
6
n
NGI
2
m
1
l
3
8a
k 8b
1b
h
i
1c(E)
9a
1(I)
1c(O)
1(II)
j 9c
9b
3c
1(a)
3e
3d
3f
3b
3(VI) 3a
3(III)
TD3
10a
(Simmonds, 1999; mod.)
Epatite C: quasispecie

La natura di quasispecie dell’HCV costituisce un fattore di
grande importanza nella storia naturale dell’infezione da
HCV.

La quasispecie è definita come una popolazione eterogenea
di virioni ciascuno dei quali può differire dall’altro anche
solo per una mutazione puntiforme del genoma.

Solitamente, in un singolo soggetto con infezione primaria
predomina una popolazione di virus omogenea dal punto di
vista genetico.

Sotto la pressione della risposta immunitaria dell’ospite
essa può modificarsi nel corso del tempo, portando
all’emergenza di una o più popolazioni virali che, a seguito
della modificazione genetica, abbiano ottenuto un
"vantaggio" in termini di sopravvivenza della specie.
Origine della quasispecie di HCV

Il genoma di HCV è costituito da un
filamento di RNA a polarità positiva

Il filamento intermedio replicativo, a polarità
negativa, è sintetizzato da un enzima (RNA
polimerasi-RNA dipendente) privo dell‟attività di
correzione della sintesi

Questo difetto causa la formazione di una
popolazione di HCV, simile ma distinta:
una quasispecie
singolo
O.E. Varnier (Microbiology upgrade)
Varianti dell‟HCV

E‟ importante sottolineare che la quasispecie nasce prima
ancora che il virus venga sottoposto a stress dovuti alla
pressione selettiva del sistema immunitario o dei farmaci
antivirali.

La quasispecie di HCV può avere conseguenze biologiche
importanti, fra cui :




incapacità dell‟individuo di reagire al virus
aumento delle resistenze all‟interferone ed agli antivirali
difficoltà di approntare un vaccino
Recenti evidenze suggeriscono che esista un diverso
tropismo da individuo a individuo correlato alla quasispecie
[fegato, midollo osseo, reni, monociti/macrofagi (CD14),
linfociti B (CD19) e granulociti (CD15)]
O.E. Varnier (Microbiology upgrade)
Elementi Strutturali di HCV
Envelope
gp70 (E2)
gp31 (E1)
Proteine del
Capside
Core (p21)
RNA
Struttura Genomica
della frazione UTR di HCV
Regione Ipervariabile
5’ UTR
Strutturale
C
E1
E2
Proteina
del Core
Non strutturale
NS2
NS3
NS4
Metallo-proteasi
Glicoproteine
dell‟Envelope
NS5A
NS5B
Cofattori
3’ UTR
Replicasi
Proteasi / Elicasi
omologia: % dei nucleotidi tra differenti isolati
92
81
55
65
57
70
65
66
26
Prevalenza Pandemica di HCV
5 mio
8,9 mio
17,9 mio
28,0 mio
32,2 mio
59,4 mio
7,6 mio
Fonte: World Health Organization
Genotipi HCV: nomenclatura
Simmonds
1a
1b
2a
2b
Okamoto
I
II
III
IV
Mori
I
II
III
Cha
GI
GI
GII
GII
Nakao
Pt
Pt
Prototipo
Isolati
3a
3b
IV
V
VI
GIII
GIII
GIII
GIV
K1
K1
K2a
K2a
K2b
K3
HCV-1
HCV-J
HCV-J6
HCV-J8
E-b1
HCV-H
HCV-BK
4
5
6
GV
Tb
Z6
SA3
HK1
Ta
EG-1
SA4
HK2
HCV-T
BR36
to
SA1
HK3
HCV-JK1
BR33
EG-33
SA7
HK4
HCV-J1
HD10
BU79
BU74
SA11
HCV-J4
GB80
GB116
GB549
GB809
Fonte: OPTION/BIO (1994): 121,1.
PC
Distribuzione Geografica dei Genotipi HCV
2,3,1
1,3,2
1,2,3,4,5
1
1,2
1,2,3
1,6,2
4
1,2
1,3,2,5
La distribuzione geografica dei genotipi predominanti nella popolazione (donatori di sangue)
in differenti contesti geografici, viene segnalata in ordine di decrescente prevalenza
Fonte: C. L. van der Poel et al. (1994): Lancet 344, 1475, modif.
Sintomatologia da Epatite C
Principali evidenze asintomatiche o subcliniche
Periodo di Incubazione:

4-8 settimane di media (intervallo compreso da 2 a 26 settimane)
Sintomi:

affaticamento, letargia, nausea

epatosplenomegalia, “malessere epatico”

ittero
Malattia epatica scompensata:

edema tissutale (es. ascite)

sanguinamento gastrointestinale

setticemia
Malattia cronica epatica:

fibrosi

cirrosi

carcinoma epatocellulare
Categorie di Rischio per Infezione
da HCV
RISCHIO
• Tossicodipendenti da droghe iniettabili
• Pazienti dializzati
• Emofilici
• Emotrasfusi
Categorie a basso rischio:
• Operatori del settore sanitario esposti al contatto con materiali biologici infetti
• Neonati provenienti da madri sieropositive
(rischio più elevato se la madre è sieropositiva da HIV)
• Partner sessualmente attivi
(rischio più elevato se il partner è sieropositivo da HIV)
• Persone a stretto contatto con pazienti con infezione in fase acuta
Efficiency of HBV and HCV
Transmission
Exposure
Transfusion
Injecting drug use
Perinatal
Needlestick
Sexual
Mucous membrane
Non-intact skin
Intact skin
HBV
++++
HCV
++++
++++
++++
+++
+++
++
+
-
++++
++
+
+
+/+/-
Protocolli Diagnostici per HCV

Screening:



Conferma:




ALT
EIA o altro
LIA (Line Immune Assay)
RIBA (Recombinant ImmunoBlot Assay)
PCR Qualitativa
Paziente / Monitoraggio della Terapia:


PCR Quantitativa
ALT
Procedure Diagnostiche
Test Specifici (indiretti)
Indagini sierologiche di rilevazione anticorpale
anti-HCV

Test di screening anticorpali anti-HCV


(EIA, PA, ecc...)
Test di sierologia supplementare/conferma

(LIA, RIBA)
Procedure Diagnostiche
Test Specifici (diretti)
Indagini molecolari che rilevano, stimano e/o
caratterizzano il genoma di HCV RNA presente
nel campione in esame
a) Test qualitativi per ricerca di HCV RNA
b) Saggi quantitativi per quantificazione dei livelli di HCV
c) Determinazione del genotipo virale
Procedure Diagnostiche
Test Para-Specifici
Enzimi Epatici, ALT o AST
(alanina o aspartato transaminasi)

presenti a titoli elevati in caso di danno agli epatociti, forniscono
indicazioni di sofferenza epatica (non necessariamente associata
ad infezione virale)

solitamente fluttuanti in corso di infezione da HCV

normalmente espressi con valori compresi tra 0 e 45 U/ml

circa metà dei pazienti con epatite cronica da HCV,
istologicamente confermata, presentano livelli di ALT nella norma
o prossimi ad essa
HCV: diagnostica indiretta
Supplementare (LIA, RIBA 3a
generaz.)
 Test
Evidenzia: anticorpi
“
“
“
“
anti-core (c22)
anti-E/NS1 (envelope)
anti-NS3 (c33c)
anti-NS4 (c100-3, 5-1-1)
anti-NS5 (RNA polimerasi)
NS 5
NS 4
NS 3
NS 2
E2
E1
Core
Test Specifici
HCV - RIBA
Control
5-1-1
C100-3
C33-C
C22-C
SOD
POS
NEG
POS
IND
IND
Andamento dei marcatori
dell‟HCV
ALT
Anti-c100
Anti-c33
Anti-c22
HCV-RNA
INFEZIONE
MALATTIA
GUARIGIONE
HCV: diagnostica indiretta
 GIUDIZI
DIAGNOSTICI
1) Screening positivo / Test Supplem. negativo
“Infezione da HCV improbabile: si consiglia un
controllo fra 4-6 mesi”
2) Screening positivo / Test Supplem. indeterminato
“Possibile infezione da HCV: si consiglia la ricerca del
genoma virale (HCV-RNA)”
3) Screening positivo / Test Supplem. positivo
“Infezione da HCV pregressa o in atto: si consiglia la
ricerca del genoma virale (HCV-RNA)”
Procedure Diagnostiche:
Test Specifici Diretti
Indagini
molecolari
che
rilevano,
stimano
e/o
caratterizzano il genoma di HCV RNA presente nel
campione in esame
a) Test qualitativi per ricerca di HCV RNA
b) Saggi quantitativi per quantificazione dei livelli di HCV
c) Determinazione del genotipo virale
Test per la Ricerca di HCV RNA
Qualitativo




LightCycler con Hybr. probes
COBAS AMPLICOR™ HCV
National Genetics Institute SUPERQUANT assay (NGI)
“home-brew” RT-PCR
Quantitativo





LightCycler con Hybr. Probes (range: 5.3 x 101 – 1 x 1010 UI/ml)
COBAS AMPLICOR HCV MONITOR™ (range: 6 x 102 – 8 x 105 UI/ml)
Bayer/Chiron QUANTIPLEX bDNA assay
National Genetics Institute SUPERQUANT assay (NGI)
“home-brew” RT-PCR
Genotipizzazione dell‟HCV tramite sequenziamento degli
acidi nucleici (reazione di Sanger)
5 ’NC Amplicon
Roche AMPLICOR HCV MONITORTM
Sample
preparation
Purification
Sequencing
reaction
CLIP™ Sequencing / TRUGENE™ HCV 5’NC
Sequencing
detection
Long-ReadTower™
GeneObjects™
Sequencing
analysis
5 ’NC Amplicon
LightCycler
Gene Objects™ / HCV 5’NC GeneLibrarian™
TRUGENE™ HCV 5’NC report
(Type/Subtype/Isolate/accession number)
La PCR
5’
3’
3’
5’
DNA Target
Primer down
5’
3’
3’
5’
Primer up
5’
3’
3’
5’
Taq Polymerase
5’
3’
3’
5’
Amplicon
5’
3’
3’
5’
[amplicon]
La PCR cresce esponenzialmente
5’
3’
3’
5’
Numero di cicli
Perchè nasce la PCR
quantitativa?
[ amplicon ]
Perchè la PCR NON cresce
esponenzialmente!
Vari fattori limitano
la crescita esponenziale
Numero di cicli
[ amplicon ]
Quantità diverse di Target all’inizio della
PCR generano curve parallele ma traslate
in numero di cicli
Numero di cicli
[ amplicon ]
In una PCR con misurazione “end-point”
(Amplicor, DEIA, gel di agarosio) la quantità
di amplicon rilevato non è proporzionale alla
quantità di target iniziale
Numero di cicli
[ amplicon ]
In una PCR con misurazione “Real Time”
il numero di cicli necessario per raggiungere
un certa quantità di amplicon è proporzionale
alla quantità di target iniziale
Soglia di rilevamento
Numero di cicli
FRET
Fluorescence Resonance Energy Transfer
LC-640
495nm
FLU
La distanza fra le due sonde è cruciale!
LC-705
Maccanismo di azione delle Hyb. Probe
Meccanismo di azione delle Hyb. Probe
LigthCycler
Capillare
Caricatore
Ventola
Ottica
Obiettivi

Messa a punto di un sistema di quantificazione
di HCV RNA:
–
–
–
–

accurato
rapido
in grado di identificare tutte le specie di HCV
dotato di una buona riproducibilità
Tipizzazione diretta degli ampliconi di HCV
prodotti con la real time PCR
Studio

2.470 campioni di plasma di pazienti HCV
positivi in “follow up” (periodo: Ott 2002 - Set 2004)
–
HCV quantitativa: single step real time RT-PCR
con LightCycler (LC) e tecnologia FRET
–
tipizzazione: sequenziamento di ampliconi
purificati
HCV quantitativa: caratteristiche



Elaborazione e memorizzazione di una curva di
calibrazione standard mediante diluizioni scalari 1:10
di plasma umani di riferimento certificati dall‟OMS:
HCV Accurun 305 (170.000 UI/ml) o Accurun 405
(910.000 UI/ml), BBI
Dosaggio quantitativo di HCV RNA in campioni
clinici basato sull‟amplificazione di un singolo
standard di riferimento (170.000 or 910.000 UI/ml),
interpolato con la curva standard memorizzata
Soglia teorica: 53 UI/ml
Primer e sonde utilizzate per HCV
Tipo di
sonda
KY80s
KY78s
HCV 3FL
HCV 5LC
Sequenza nucleotidica
AgCgTCTAgCCATggCgT
CAAgCACCCTATCAggCAgT
gCAgCCTCCAggACCCCCC X
LC640-CCCgggAgAgCCATAgTggTCTg p
Posizione
74-91
308-288
107-125
128-150
Temp. di
melting
59.1°C
57.2°C
67.5°C
66.9°C
Curva di calibrazione per LightCycler
con lo standard 170.000 UI/ml (1)
Curva di calibrazione per LightCycler
con lo standard 170.000 UI/ml (2)
1,00E+06
1,00E+05
1,00E+04
IU/ml log
1,00E+03
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00
calculated IU/ml
Accurun HS (BBI)
1
2
3
4
5
0,000E+00
1,681E+02
1,737E+03
1,684E+04
1,698E+05
0,0E+00
1,7E+02
1,7E+03
1,7E+04
1,7E+05
standard dilutions
Dosaggio quantitativo di HCV RNA in LC:
risultati

Carica virale: range dinamico osservato
–

min 5.7 x 101 UI/ml;
max 2.5 x 109 UI/ml
Riproducibilità del crossing point dello standard:
Accurun
–
–
–
–
–
N° di esperimenti
Media
inter-assay:
Mediana
“
“ :
DS
“
“ :
CV
“
“ :
170.000 UI/ml
80 (Ott „02 – Ago „03)
30.43 (28.02 – 33.71)
30.48
1.08
3.55 %
910.000 UI/ml
107 (Ago „03 – Set „04)
28.02 (25.27 – 32.38)
28.10
1.34
4.78 %
Distribuzione della carica virale
nei pazienti in follow up
HCV viral loads
500
450
426
n. of samples
400
406
350
300
250
IU/ml log
200
162
150
104
100
70
50
39
12
5
0
1,0E+01
1,0E+02
1,0E+03
1,0E+04
1,0E+05
IU/ml log
1,0E+06
1,0E+07
1,0E+08
2
1,0E+09
HCV: genotipizzazione

266 ampliconi purificati con trattamento termochimico (PCR Purification, DiaTech)

Tipizzazione di 35 differenti sottotipi di HCV con
un kit commerciale (TruGene HCV genotyping assay) e un
sequenziatore automatico (OpenGene DNA, Visible
Genetics inc., Bayer)

Valutazione della temperatura di melting per
ciascun genotipo
possibile tipizzazione?
Distribuzione dei genotipi di HCV
HCV genotypes distribution
50,0
45,0
40,0
36,1
35,0
30,8
30,0
% of sam ples 25,0
20,0
15,0
10,0
8,6
5,3
5,0
4,1
0,8
0,0
1
1a
1b 1c
2
2,3 6,0 3,0
0,4 0,8
0,8
0,4 0,4 0,4
2a
2b 2c
2d
3
3a
genotypes
% of genotypes
4
4a 4e 5a
1
1a
1b
1c
2
2a
2b
2c
2d
3
3a
4
4a
4e
5a
5,3
8,6
36,1
0,8
30,8
4,1
0,4
0,8
0,8
2,3
6,0
3,0
0,4
0,4
0,4
Temperatura di melting e genotipi di HCV
(su n° 112 campioni – periodo Ott 2002 – Mag 2003)
Conclusioni

Il dosaggio quantitativo di HCV RNA con LightCycler è:
–
–
–
–
–

accurato
riproducibile
in grado di quantificare tutta la quasispecie di HCV
cost/effective
rapido
Questioni aperte:
–
–
La PCR su LC ha la stessa efficienza per tutti i genotipi di HCV?
Potrebbe essere possibile tipizzare direttamente su LC (temp. di
melting) usando differenti sonde in differenti posizioni?
Decorso diagnostico nella
Epatite C Acuta
RNA-PCR
ALT
anti-core/NS3
IgM
anti-core
anti-NS4
6
settimane
12
sintomatologia
Epatite Acuta
18
24
1
anni
4
7
10
13
Decorso diagnostico nella
Epatite C Cronica
RNA-PCR
ALT
anti-HCV-EIA
//
IgM
//
6
settimane
12
18
24
1
anni
5
10
15
20
sintomatologia
Epatite Acuta
CAH
CPH
CAH
Cirrosi
/HCC
Algoritmo diagnostico per le
infezioni da HCV
Negativo
EIA per AntiHCV
(non reattivo)
STOP
Positivo (ripetizione)
oppure
RIBA per Anti-HCV
Negativo
STOP
Negativo
Indeterminato
Ulteriori Indagini di
Laboratorio (PCR, ALT)
PCR negativa,
ALT normale
PCR positiva,
ALT alterata
Fonte: MMWR 1998;47 (No. RR 19) modificato da L. Tagliaferro
RT-PCR per HCV
RNA
Positivo
Valutazione Clinica
(eventuale genotipo)
Positivo
Progressione Clinica della
Infezione da Epatite C
20-25%
Epatite C Acuta
(100%)
75-80%
Anittericità, spesso
asintomaticità clinica
20-30%
70-80%
Remissione Totale
HCV-Persistenza
40-60%
20-30%
Epatite C Cronica
Portatore HCV
Asintomatico
Cirrosi
Carcinoma
Epatocellulare
20- 30 anni
Considerazioni finali

Probabilmente il virus dell’Epatite C esiste ed
infetta l’Uomo da molto tempo

Ciò che conta oggi è che rappresenta una sfida
drammaticamente attuale e più diffusa di altre
patologie infettive più “blasonate”
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Le moderne scienze bio-mediche, se ben
coordinate, potranno senz’altro raggiungere il
traguardo finale