Western Blotting 12 stud

…Perché fare un Western Blotting?
Perché complicarsi la vita?
La proteina è imbrigliata nelle maglie della poliacrilammide
che ne ha consento la separazione per peso molecolare, che
però non ne ferma la lenta diffusione e ne impedisce
l’ibridazione con anticorpi.
È necessario quindi spostare la proteina, su di un supporto
che sia in grado di:
• Bloccare la diffusione incontrollata
della proteina, bloccando permanentemente la posizione.
• Permettere la rilevazione degli EPITOPI
proteici della struttura primaria da parte di anticorpi.
Membrane Immobilizzanti 
La Membrana
Film porosi di diverso materiale caratterizzati da:
I materiali più utilizzati sono:
•
•
Capacità di Binding (quanta proteina è in grado di assorbire);
Dimensione dei pori (più il poro è piccolo più trattiene le
proteine leggere ma fatica ad accogliere proteine ad alto peso
molecolare);
•
•
•
Compatibilità con i diversi sistemi di
trasferimento (Capillarità, Vacuum, Wet, Semi-dry, Dry);
Compatibilità con diversi metodi di blocking
(NFDM, BSA, Chemical, Drying);
Compatiblità con i diversi metodi di detection
(Colorimetrico, Luminolo, Fluorescente).
• Nitrocellulosa,
• Nylon,
• PVDF (poli-vinil-difluoride)
Il «primo» trasferimento
Buffer
Il Trasferimento «Wet» o «Tank»
60 – 90 min @ 70 – 90 V
•
•
•
Richiede una discreta manualità e
la preparazione di tutti i buffer
Abbastanza riproducibile
Essenzialmente economico
Il Trasferimento «Semi-Dry» e «Dry»
5 – 15 min
•
•
•
For Dummies
Estremamente riproducibile
Molto costoso
Blocking
Per le sue caratteristiche TUTTA la membrana è altamente recettiva alle proteine ed è in grado
legarle anche per semplice contatto è necessario quindi bloccare i siti aspecifici cioè tutti i
possibili siti recettivi ai quali non sono legate le proteine che abbiamo trasferito.
• NFDM
(Non-Fat Dry Milk)
Mix di proteine del latte senza grassi
* Non compatibile con le cianine
• BSA
(Bovine Sierum Albumin)
Albumina derivata da siero bovino
• Chemical Blocking
agenti chimici che bloccano le membrane
• Drying
semplice asciugatura del filtro
L’ibridazione
Vengono utilizzati anticorpi che
riconoscono epitopi della struttura
primaria della proteina in analisi
Come si ?
• Anticorpo direttamente coniugato con l’enzima o l’agente che ne consente la
rilevazione.
• Utilizzo di un anticorpo secondario marcato
Riconoscimento diretto o indiretto
Riconoscimento diretto, Un solo anticorpo
riconosce direttamente l’epitopo ed è
coniugato con il sistema di detection.
Riconoscimento indiretto, un anticorpo
riconosce l’epitopo ed un altro anticorpo,
al quale è coniugato il sistema di
detection, riconosce l’anticorpo primario.
Detection
Perossidasi (HRP) / luminolo
Perossidasi (HRP) o Fosfatasi Alcalina (AP)
colorimetrico
Fluorescente (cianine etc..)
Detection (Luminolo)
H2O2 + perossidasi
producono l’ossigeno
che
entra
nella
reazione e consente
l’ossidazione
del
luminolo.
Detection (Luminolo)
Detection (Para-nitrofenil-fosfato)
L’interpretazione delle bande
Differenze di espressione proteica