La tecnica del patch clamp
Era noto da lungo tempo che attraverso la membrana
plasmatica è possibile un rapido scambio di ioni. Tuttavia,
Neher e Sakmann a cavallo tra gli anni ’70 e ’80 furono i
primi a mostrare l’esistenza di canali ionici specifici
Erwin Neher & Bert Sakmann Premi Nobel
per la medicina nel 1991 per lo sviluppo della
tecnica del patch-clamp rendendo possibile la
caratterizzazione di singoli canali ionici
La tecnica del PATCH CLAMP
L "idea di base del PATCH CLAMP fu sviluppata da Neher e Sakmann tra il 1976 e il
1981. Il principio è riassunto nella figura seguente.
Impiega un solo microelettrodo in intimo contatto con la membrana
cellulare
Lo stesso elettrodo è impiegato sia per variare il potenziale che per
misurare direttamente la corrente della membrana.
E’ possibile caratterizzare, a secondo della configurazione usata, sia i
canali ionici sottostanti l’orifizio dell’elettrodo, che quelli presenti in una parte
o in tutta la membrana
Il setup per il patch-clamp
microelettrodo
microscopio
micromanipolatore
computer
preparato
oscilloscopio
amplificatore
gabbia di Faraday
La configurazione di cell-attached
Registrazione di una corrente elettrica che
fluisce attraverso un singolo canale ionico
Amplificatore
Elettrodo di registrazione:
micropipetta di vetro ~10-6 m
Resistenza della saldatura: >1 GW
Con un opportuno equipaggiamento
elettronico e opportune condizioni
sperimentali è possibile misurare
questa corrente “microscopica”
Quando un singolo canale si apre,
gli ioni si muoveranno attraverso il
canale come una corrente elettrica
Pipetta di vetro
Formazione del “Gigaseal”
Rs = 109 – 1010 ohm
Spazio
extracellulare
Membrana
cellulare
Spazio
intracellulare
Correnti di membrana
dovute ad un singolo canale
aperto o chiuso.
A – membrana elettricamente
eccitabile
B – Membrana chimicamente
eccitabile
Rs=resistenza del seal
Rp=resist. della pipetta
Rin=resist. d’ingresso
Vp=potenziale della pipetta
Una registrazione da patch richiede una forte
saldatura tra pipetta e membrana
la qualità della misura dipende da quanto si riesce a minimizzare le perturbazioni
della cellula. Nel caso di una registrazione di potenziale tale aspetto può essere
rappresentato in questo modo.
resistenza del seal Rs
infatti:
I=EK/(RK+RS)
I=V/RS
CIRCUITO EQUIVALENTE
intracellulare
V/RS=EK/(RK+RS)
V=EKRS/(RK+RS)
extracellulare
L’elettrodo sta misurando il potenziale di riposo di una cellula la cui membrana
contiene solo canali del K aperti. All’aumentare della resistenza di seal Rs, la
misura si avvicina sempre di più al valore di EK
Seals buoni e cattivi
Nel caso di una registrazione da patch, le correnti attraverso la saldatura (seal) non
distorcono il voltaggio o la corrente misurati, ma si sommano al rumore della
corrente.
seal buono
AMPL.
seal cattivo
evento di singolo canale
In una registrazione da patch (cell-attached, inside- o outside-out), anche la
corrente attraverso il seal fluisce lungo il circuito di misurazione, aumentando il
rumore sulla corrente misurata.
Ad es., se la corrente attraverso il seal è dieci volte più ampia di quella attraverso il canale,
allora le fluttuazioni statistiche nel flusso di corrente prodotta dal seal sono √10 (316%) più
ampie di quanto sarebbero in un seal “perfetto”.
• La pipetta di vetro in questo caso ha una punta più grande di un elettrodo tradizionale,
perchè non deve bucare la membrana plasmatica. Ha un diametro interno di 0.5-2 µm ed è
più o meno arrotondata. E' inserita in un portaelettrodo a tenuta, a sua volta collegato con
un tubicino ad una fonte di suzione.
• Viene avvicinata alla cellula, ed a questo punto viene applicata una leggera pressione
negativa; se tutto va bene, cellula ed elettrodo aderiscono saldamente.
• Non si ottiene solo un'adesione stabile meccanicamente (se la cellula è isolata e non
aderisce al fondo della vaschetta è possibile sollevarla e spostarla a piacere), ma anche un
sigillo ad altissima resistenza elettrica (Rs) (da 1 a centinaia di Gohm - 109 ohm), cioè tale
da presentare una elevata resistenza al passaggio di corrente fuori dalla zona di contatto
fra elettrodo (riempito anche qui di soluzione conduttrice) e membrana.
• In queste condizioni, se nell'area di membrana sottesa all'elettrodo, dell'ordine di pochi
µm2, ci sono dei canali ionici, la corrente che fluisce attraverso di essi quando sono nella
conformazione "aperta" passerà attraverso l'elettrodo, senza disperdersi nello spazio
esterno, e potrà essere rilevata da un sistema di amplificazione che abbia un rumore
intrinseco sufficientemente basso (le correnti di singolo canale sono dell'ordine di 0.1-50
pA).
• Questa configurazione, chiamata CELL ATTACHED PATCH, è quella di base, da cui si
parte per tutte le successive modificazioni e applicazioni della tecnica. Essa consente
quindi di effettuare registrazioni di singolo canale ( figura seguente) in condizioni in cui la
cellula è intatta, il suo mezzo intracellulare imperturbato, in condizioni quindi il più libere
possibile da artefatti sperimentali. Si lavora in VOLTAGE CLAMP, in quanto il voltaggio
della pipetta è mantenuto ad un valore costante e che può essere variato a piacere con il
potenziale di comando; in condizioni opportune è possibile misurare l'ampiezza della
corrente in funzione del voltaggio applicato e ricavare informazioni sulla conduttanza di
singolo canale.
Inconvenienti della configurazione di cell-attached patch
• Il principale inconveniente è che il potenziale di membrana (Vm) della cellula è
sconosciuto, perchè nessun contatto con l'ambiente interno è stato realizzato, per cui è
ignoto il valore della ddp (Vc-Vm) presente ai capi del singolo canale di cui si misura la
corrente. Per ricavarlo bisogna introdurre un elettrodo tradizionale (ma così si complicano
di nuovo le cose), oppure distruggere il patch e passare alla configurazione WHOLE CELL
(vedi sotto): a volte, più semplicemente, si prende un valor medio di Vm ottenuto con
misurazioni separate, con tutti i limiti di una simile assunzione.
Sommando un gran numero di registrazioni di SCC sincronizzate,
otterremo l’evoluzione temporale della corrente macroscopica
Differenti tipi di“Patch
Micropipetta
Apertura 0.5-1 mm
Bassa resistenza
Saldatura (50 MW)
Corrente di
leakage
Membrana cellulare
Whole-cell patch clamp:
Simile alla tecnica di derivazione
intracellulare.
Una bassa resistenza di accesso
produce registrazioni a basso
rumore.
Molti canali contribuiscono al
segnale.
Un certo tipo di canali viene
isolato con protocolli di voltaggio
e farmaci.
Corrente di
membrana
Suzione
Gigaseal
(>1 GW)
Una breve
suzione
rompe il
patch di
membrana
Il ponte
citoplasmatico
collassa
Outside-out patch clamp:
Usato per valutare la risposta di singoli
canali al voltaggio e a sostanze
extracellulari (neurotrasmettitori ecc.).
Inside out patch clamp:
Usato per valutare la risposta di singoli
canali al voltaggio e a sostanze
intracellulari (secondi messaggeri
ecc.).
Trazione
Trazione
Il ponte
citoplasmatico
collassa
Resistenza
dell’elettrodo
2-10 MW
Trazione
in un
mezzo a
basso
Ca2+
L’esposizione
all’aria rompe
la vescicola
Configurazione di WHOLE-CELL
Finora ci siamo riferiti alla condizione chiamata “cell attached” (A).
Questa è necessaria per la registrazione delle correnti di singolo canale, ma non è
l’unica “configurazione” della tecnica del patch clamp.
La condizione di ”whole cell” (B) è quella più usata. Essa
permette di registrare le correnti ioniche che attraversano
tutta la membrana, effettuando un “voltage clamp” con un
solo elettrodo anzichè due elettrodi
Naturalmente la soluzione che riempie l’elettrodo dev’essere tale da
perturbare il meno possibile la composizione ionica intracellulare.
Che caratteristiche dovrà avere in linea di massima ?
Però le proteine intracellulari (protein-chinasi, calmoduline ecc.) vengono
inevitabilmente dilavate.. Per aggirare questo problema, si può usare le tecnica
del “perforated patch”, che consiste nel restare in ”cell-attached” aggiungendo
nell’elettrodo delle molecole che formano canali ionici non selettivi, ad es. la
Nistatina …
Configurazione di whole cell patch-clamp
E' l'applicazione della tecnica del PATCH CLAMP utilizzata per ottenere i risultati di
un VOLTAGE CLAMP tradizionale. Sempre partendo dalla configurazione CELL
ATTACHED, con un 'ulteriore suzione si può rompere il patch di membrana, e
stabilire così un accesso diretto fra microelettrodo e citoplasma (vedi figura),
senza, se tutto va bene, peggiorare la qualità del sigillo.
perfusione
elettrodo
suzione
Cellula
Cellattached
patch
Whole-cell
recording
• L'accesso è migliore di quello che si può realizzare perforando la membrana
plasmatica con un microelettrodo tradizionale, in quanto la resistenza della pipetta è
minore, e la dispersione di corrente verso il mezzo esterno è minore, grazie al sigillo ad
alta resistenza. Sempre a causa della bassa (massimo qualche Mohm) resistenza della
pipetta (dovuta al suo diametro relativamente grande), il potenziale a cui è mantenuto
l'elettrodo dal sistema elettronico di amplificazione e controllo può essere considerato in
prima approssimazione lo stesso della cellula, e le correnti che fluiscono attraverso tutta
la membrana cellulare possono essere registrate dall' elettrodo.
• Si possono così effettuare registrazioni di correnti totali in condizioni di VOLTAGE
CLAMP utilizzando un solo elettrodo.
• Tutto questo è in realtà vero se forma e dimensioni della cellula sono adeguate; se
no, il sistema non permette un mantenimento della costanza del potenziale in tutta
l'estensione della cellula, cioè un vero VOLTAGE CLAMP.
• Un importante aspetto di questa configurazione è che, dato il grande diametro della via
di accesso fra elettrodo e cellula, e dato che il volume dell'elettrodo è infinitamente più
grande di quello della cellula, ci sarà un mescolamento fra i contenuti dei due
scomparti, ed in sostanza l'ambiente citosolico si porterà in equilibrio con i soluti
contenuti nell'elettrodo. Questo può essere importante in alcuni casi, in cui si vogliano
effettuare registrazioni con un ambiente controllato sulle due facce della membrana, ma
comporta l'inconveniente che componenti citosolici importanti per la risposta che si vuole
studiare (enzimi, messaggeri interni) possono essere lavati via, diluiti.
•D'altra parte, se la cellula è di grosse dimensioni e/o di forma molto lontana da quella
sferica, può essere molto difficile non solo ottenere un buon VOLTAGE CLAMP, ma
anche una buona perfusione intracellulare.
LE ALTRE CONFIGURAZIONI DEL PATCH-CLAMP
Dalla configurazione di cell-attached, con alcune manovre sperimentali, se ne
possono ottenere delle altre, oltre a quella del whole-cell patch:
- L'INSIDE OUT PATCH
Se si ritrae l'elettrodo, è possibile, se il sigillo è molto buono, che il patch si stacchi
insieme all'elettrodo. Si ha così (figura pagina seguente) un frammento di
membrana, con uno o più canali ionici, sotteso all'orifizio dell' elettrodo, con la faccia
citoplasmatica rivolta verso la soluzione presente nella vaschetta; questa soluzione
può essere rapidamente e ripetutamente cambiata, e si può così studiare, ad
esempio, il ruolo di messaggeri intracellulari nella regolazione delle proprietà dei
canali ionici. Lo svantaggio è che, separando il canale dall'ambiente citoplasmatico,
può andare perso un qualche fattore indispensabile per l'apertura del canale stesso,
e difficilmente identificabile.
- L'OUTSIDE OUT PATCH
Quest'ultima configurazione può essere ottenuta ritraendo l'elettrodo dalla cellula
dopo che si è realizzata la configurazione WHOLE CELL. Si forma un ponte
citoplasmatico che può, spezzandosi, lasciare attaccato all'elettrodo un frammento di
membrana plasmatica con la faccia esterna rivolta verso il contenuto della vaschetta,
e quella citoplasmatica verso l'interno dell'elettrodo. Si possono così effettuare
registrazioni di singolo canale, con l'opportunità in questo caso di cambiare
facilmente la composizione del mezzo presente sulla faccia esterna della membrana,
e studiare gli effetti di sostanze (agonisti, bloccanti) che possono influenzare le
proprietà dei canali presenti in quel patch.
Configurazione di OUTSIDE-OUT
Dalla configurazione “whole cell” si può facilmente passare alla
configurazione di “outside out”, nella quale il patch presenta
all’esterno dell’elettrodo il versante extracellulare della membrana.
Configurazione di OUTSIDE-OUT
L’outside-out è molto utile per studiare le correnti di singolo canale date dai
recettori-canale, come ad esempio il recettore nicotinico per l’acetilcolina …
Configurazione di INSIDE-OUT
La quarta config. è l’ “inside out” (B), nella quale il patch presenta
all’esterno dell’elettrodo il versante intracellulare della membrana.
La sua principale applicazione è
nello studio dei canali chemiodipendenti attivati per via
indiretta
dal
versante
intracellulare, facendo arrivare
sul patch ad es. proteine-G, o
secondi messaggeri, o proteinchinasi, ecc. .
Più avanti vedremo come questa
configurazione
sia
stata
fondamentale nello studio dei
canali “GIRK”
Alcune considerazioni generali sul patch clamp
• In tutti i quattro casi descritti sopra si parte, comunque, dalla formazione di un sigillo fra
pipetta e membrana. Perchè questo possa avvenire è necessario che sia l'elettrodo che il
mezzo in cui è tenuto il preparato siano il più puliti possibile, ma anche, che la membrana
plasmatica della cellula da cui si vuole registrare non presenti detriti o sostanze che
possano ostacolare il contatto col vetro della micropipetta. Per ridurre questi problemi è
consigliato filtrare il mezzo dell'elettrodo subito prima del riempimento e di avvicinarsi alla
cellula applicando una lieve pressione positiva che allontana eventuali frammenti dalla
punta dell'elettrodo.
Si può più facilmente realizzare una situazione di cellule pulite effettuando un leggero
trattamento enzimatico, o utilizzando cellule isolate, dissociate enzimaticamente o in
coltura. Ed è proprio lo sviluppo, soprattutto a partire dagli anni '70, delle tecniche di
preparazione di colture cellulari che ha consentito la grande e rapida diffusione del
PATCH CLAMP. Un successivo sviluppo, che ha avuto un impatto notevole in
neurobiologia, è legato alla possibilità di lavorare su fettine di SN: è stato così
possibile effettuare registrazioni da cellule che conservano, almeno in parte, le
loro normali relazioni funzionali.
• Nonostante la tecnica sia stata sviluppata all'inizio soprattutto per poter registrare gli
eventi di singolo canale, la configurazione più utilizzata è sicuramente quella di WHOLE
CELL. Questo sviluppo, in parte imprevisto, è attribuibile a vari fattori.
• Innanzitutto, le misure di singolo canale, molto importanti per determinare in maniera
diretta le proprietà molecolari dei canali (cinetiche, meccanismi di blocco, ecc.) hanno
senso compiuto solo se vengono utilizzate su preparati di cui siano note le proprietà
elettrofisiologiche macroscopiche. Nel caso di molti tipi cellulari le cui proprietà sono state
studiate solo nell'ultimo decennio, questo ha voluto dire fare prima (o comunque anche) gli
esperimenti di WHOLE CELL.
• Grazie a questa tecnica è stato possibile studiare le proprietà elettrofisiologiche di
piccoli neuroni, cellule ghiandolari, cellule muscolari lisce e cardiociti, fibroblasti, cellule
epiteliali e linfociti, tutte cellule che era molto difficile studiare con le tecniche di VOLTAGE
CLAMP tradizionali. Grazie a questi dieci e più anni di nuova elettrofisiologia, oltre che alle
nuove tecniche di biologia cellulare e molecolare, è scaturito un panorama molto più vario
e complesso della natura e del ruolo degli eventi elettrici a livello cellulare. Se la nuova
tecnica ha consentito di allargare la nostra visione al di là dei preparati "classici", nervo e
muscolo, ha avuto anche un impatto profondo sulla neurofisiologia: la possibilità di
registrare dalle arborizzazioni dendritiche e dai terminali pre- e postsinaptici ha fatto
sì che la concezione della cellula nervosa come semplice relè cedesse il posto ad una
visione più complessa ed articolata, e che si potessero gettare le basi, a livello cellulare,
della comprensione di fenomeni fondamentali come la memoria.
Ulteriori sviluppi ed applicazioni.
• In questi anni ci sono stati importanti sviluppi tecnici in varie direzioni (a parte l'uso
delle fettine di SN cui abbiamo già accennato), per allargare le potenzialità della tecnica
e cercare di superare alcuni suoi inconvenienti.
• Uno dei problemi principali legati all'uso del WHOLE CELL PATCH CLAMP, è come
abbiamo visto, legato alla perfusione interna della cellula da parte del contenuto dell'
elettrodo: questo problema è stato affrontato in due modi radicalmente diversi.
Il primo approccio consiste nello sfruttare compiutamente questo fatto, realizzando un
sistema che consenta di cambiare rapidamente la soluzione contenuta nell'elettrodo: se
la cellula non è troppo grande si può pensare che in tempi relativamente rapidi (decine di
secondi) le variazioni si ripercuotano sulla composizione dell 'ambiente intracellulare.
• E' una tecnica abbastanza difficile da usare come routine, ma è stata impiegata da vari
laboratori per studiare gli effetti di messaggeri intracellulari sulla regolazione delle
correnti ioniche. Una recente variazione sul tema consiste nell'uso dei cosiddetti caged
compounds, molecole o ioni legati ad un inibitore da cui possono .essere liberate per
fotolisi con un flash di luce UV. Si mette il composto caged nell'elettrodo, si realizza la
condizione di WHOLE CELL, si inizia la registrazione, e poi si libera per fotolisi la
sostanza (calcio, IP3' ecc.), la cui concentrazione aumenta così istantaneamente,
consentendo di osservare eventuali effetti rapidi sulle correnti.
• Il secondo approccio punta ad evitare gli inconvenienti della diluizione dei
componenti citosolici solubili: questa modificazione della tecnica di base va sotto il
nome di "perforated patch" o di "slow whole celI". Si tratta in sostanza di realizzare
un CELL ATTACHED PATCH con un elettrodo riempito con una soluzione che
contiene sostanze permeabilizzanti (ATP in alcuni casi, o più comunemente, nistatina
o anfotericina, tutte molecole che formano pori ionici nelle membrane): le piccole
molecole e gli elettroliti possono essere scambiati, mentre le macromolecole
citosoliche non possono uscire dalla cellula. Si possono così effettuare registrazioni di
eventi elettrici, anche in condizioni di VOLTAGE CLAMP, senza che la biochimica
della cellula sia perturbata.
• Un altro tipo di misure che si può realizzare in condizioni di WHOLE CELL CLAMP è
quello della capacità della membrana (con opportuni amplificatori): è stato così
possibile, ad esempio, studiare in maniera quantitativa l'accoppiamento eccitamentoesocitosi in diversi preparati.
• Sono state infine effettuate registrazioni da strutture subcellulari isolate, come i
mitocondri, la membrana nucleare, il reticolo endoplasmatico: da frazioni cellulari (il
"whole terminal" patch su terminali presinaptici; il "perforated vescicle patch", che
consiste nello staccare dalla cellula e trattenere nella pipetta, non un patch di
membrana isolato, ma una vescicola contenente anche organelli subcellulari).
AMPLIFICATORI OPERAZIONALI
L’amplificatore operazionale ideale (A.O.) è essenzialmente,
amplificatore di tensione, avente le seguenti caratteristiche:
guadagno infinito;
ingresso differenziale;
impedenza di ingresso infinita e impedenza di uscita nulla.
V1: tensione sull’ingresso
+Vccee -Vcc:tensioni di
alimentazione
invertente
+
V cc
–
V0: tensione di uscita
V1
V0
+
V2
-
V cc
V2: tensione sull’ingresso
non invertente
un
L’AO può essere definito funzionalmente come un amplificatore differenziale, cioè
un dispositivo attivo a tre terminali che genera al terminale di uscita una tensione
proporzionale alla differenza delle tensioni fornite ai due terminali di ingresso.
+
V1
V2
–
V cc
V0 = A V2 - A V1
+
V0
+
-
-
V cc
Il segnale di uscita V0 è il risultato della somma tra il segnale applicato
all’ingresso invertente, V1, invertito di segno e amplificato di un fattore A-, con
il segnale all’ingresso non invertente, V2 , a sua volta amplificato di fattore A+.
Compensazione dei potenziali di giunzione
Un notevole contributo ai potenziali misurati presenti all’uscita
dell’amplificatore è dato dalla somma dei vari potenziali di giunzione o di
diffusione.
Questi sono generati ogniqualvolta metalli (elettrodi) sono in contatto
con soluzioni ioniche oppure soluzioni con diverse concentrazioni sono in
contatto fra loro (punta del microelettrodo.
Si può eliminare la somma di tutti questi potenziali introducendo, per
mezzo del comando offset dell’amplificatore, un potenziale di segno
opposto quando il microelettrodo si trova nel bagno esterno, prima di
penetrare la cellula.
