Il Nucleo
Come abbiamo visto, il DNA è la macromolecola che contiene tutte le informazioni
necessarie per la struttura ed il funzionamento cellulare. Queste informazioni vengono trasmesse da
cellula a cellula e, quindi, da organismo ad organismo, così da avere cellule ed organismi uguali ai
progenitori.
La scoperta che una cellula deriva da un'altra cellula è stata fatta a metà del XIX secolo,
mentre agli inizi di questo secolo è stato dimostrato che i cromosomi sono i depositari
dell'informazione genetica. La dimostrazione che il DNA è il materiale ereditario è avvenuta molto
più tardi grazie ad esperimenti del 1944 e del 1952. Prima di allora, sebbene fosse chiaro che i
cromosomi fossero il "veicolo" dell'ereditarietà e si sapesse che i cromosomi erano costituiti da
acidi nucleici, la maggior parte dei ricercatori riteneva che fosse la componente proteica dei
cromosomi la responsabile della informazione genetica.
La struttura del nucleo
Nelle cellule eucariotiche, il DNA non è libero nel citoplasma, bensì racchiuso in una porzione
cellulare ben definita, il nucleo. Questo è separato dal resto della cellula da una membrana, la
membrana nucleare. Il DNA presente nel nucleo interagisce con specifiche proteine con funzioni
strutturali e di controllo dell'espressione del DNA stesso, che formano la cromatina. Il DNA
eucariotico si trova organizzato in lunghi segmenti lineari, i cromosomi, che si trovano in differente
stato di compattamento a seconda del momento del ciclo cellulare.
La membrana nucleare è una differenziazione del reticolo endoplasmatico (RE) e si trova in
continuità con quest'ultimo.Consta di due membrane, la cui struttura è sostanzialmente simile a
quella del RE e che delimitano uno spazio peri-nucleare. La membrana nucleare è costellata di pori
che rappresentano zone in cui le due membrane dell'involucro nucleare si continuano l'una nell'altra.
I pori nucleari sono strutture ottagonali attraverso cui transita selettivamente tutto il materiale
molecolare per e dal nucleo
.
Le proteine destinate al nucleo portano nella loro struttura un segnale specifico, che consente loro di
accumularsi nel nucleo e solo in esso. La membrana nucleare scompare all'inizio del processo di
divisione cellulare per ricomparire quando il processo si è quasi concluso.
La duplicazione del DNA
Tutte le cellule di un determinato organismo contengono lo stesso quantitativo costante e
specifico di DNA. Quando una cellula si divide in due cellule figlie, queste ultime hanno la stessa
quantità di DNA della cellula madre, cioè la stessa quantità e qualità di informazione genetica.
Tutto questo è assicurato dal processo di duplicazione del DNA, che avviene prima che la cellula
madre si divida nelle due cellule figlie.
Il meccanismo di duplicazione del DNA è di fatto implicito nella struttura stessa della
doppia elica. Affinchè il DNA possa duplicarsi è necessario che i due filamenti che compongono
una doppia elica si separino e ciò avviene per mezzo di un enzima specifico presente nel nucleo, la
elicasi, che provvede a rompere i ponti idrogeno presenti tra le basi affacciate delle doppia elica.
Nelle cellule eucariotiche i filamenti di DNA sono molto lunghi e la duplicazione avviene
contemporaneamente in vari punti della molecola; in caso contrario occorrerebbero 800 ore per
replicare l'intero genoma umano. I punti dove i due filamenti della doppia elica si separano sono
detti bolle di replicazione. I due filamenti singoli a questo punto potranno fungere da stampo
ciascuno per un nuovo filamento, dando origine, alla fine del processo, a due nuove doppie eliche,
ciascuna composta da un un filamento vecchio e da uno di nuova sintesi. Per questo la duplicazione
del DNA viene detta semiconservativa.
Sui due filamenti stampo i singoli nucleotidi trifosfato presenti nel nucleo si appaiano
secondo la legge della complementarietà.
Ad esempio, dato che la adenina può legarsi solo alla timina e la
citosina solo alla guanina, se il filamento stampo è costituito dalla
sequenza
3'-TACCGATAAGGCTA-5'
il filamento di nuova sintesi sarà necessariamente
5'-ATGGCTATTCCGAT-3'
La specificità della sequenza di basi lungo i filamenti di
nuova sintesi è assicurata dalla legge della complementarietà,
mentre la costituzione dello scheletro di zucchero-fosfato viene
assicurata dall'azione di un enzima chiamato DNA polimerasi e
deputato alla formazione del legame fosfodiesterico tra il gruppo
fosforico in posizione 5' ed il gruppo ossidrile del deossiribosio del nucleotide precedente che si
trova in posizione 3'.
Panorama generale della replicazione del DNA
La DNA polimerasi è in grado di catalizzare il
legame tra un nucleotide ed un altro solo in direzione 5'-3' e
non viceversa e non esiste alcun enzima in grado di
catalizzare il legame fosfodiesterico in direzione 3'-5'. La
DNA polimerasi, inoltre, può catalizzare solo l'aggiunta di
nucleotidi all'estremità 3'-OH di una già catena esistente. Per
iniziare serve, quindi una catena già formata che funga da
innesco o primer, a cui aggiungere i nucleotidi in sequenza.
Una volta che le eliche sono separate una RNA
polimerasi, chiamata primasi, che, contrariamente alla DNA
polimerasi, può iniziare una nuova catena da singoli
nucleotidi, catalizza la formazione di una breve catena di
RNA, che fungerà da innesco o primer per la DNA polimerasi. Anche l'innesco di RNA è
naturalmente dettato dalla complementarietà, con la sola differenza che al posto della timina verrà
introdotto un uracile.
A questo punto la DNA polimerasi sostituirà la primasi e provvederà a catalizzare la sintesi
delle due nuove eliche. A mano a mano che le catene figlie si estendono, la doppia elica si apre
come una cerniera e poichè, come abbiamo visto, i due filameti dell'elica del DNA sono
antiparalleli, vanno, cioè, uno in direzione 5'-3' e l'altro in direzione 3'-5', la bolla di replicazione si
estenderà in tutte e due le direzioni.
Poichè, come abbiamo ricordato, i due filamenti dell'elica corrono in direzione opposta e la DNA
polimerasi catalizza il legame solo in direzione 5'-3', la duplicazione avviene in maniera continua
solo sul filamento che corre in direzione 3'-5', cioè su quello che presenta un 3'-OH disponibile per
la DNA polimersi, e con modalità leggermente differente sull'altro. Infatti, sul filamento che corre
in direzione 5'-3', detto filamento in ritardo, si formeranno numerosi inneschi, ad una distanza di
qualche centinaio di basi l'uno dall'altro e la DNA polimerasi provvederà ad estendere la catena da
un innesco di RNA all'altro; questi frammenti di catena "sintetizzati all'indietro" vengono chiamati
Frammenti di Okazaki Nel crescere all'indietro un frammento di Okazaki andrà ad incontrare
l'innesco di RNA del frammento precedente e l'attività esonucleasica associata alla DNA polimerasi
provvederà a demolire, nucleotide per nucleotide, l'innesco e ad aggiungere deossinucleotidi alla
catena di DNA che si sviluppa all'indietro. Quando tutto l'innesco è stato eliminato si troveranno
faccia a faccia l'estremità 3'-OH di un frammento con la estremità 5'-P del frammento di Okazaki
precedente; tali estremità verranno saldate con un legame fosfodiesterico da un enzima chiamato
DNA ligasi
La cromatina
La lunghezza di tutto il DNA contenuto nel nucleo di una singola cellula umana, se si trovasse in
forma lineare distesa, raggiungerebbe circa i 2 metri. In realtà, però, il DNA si trova diviso in 23
coppie di segmenti separati, i cromosomi, ed organizzato nella cromatina.
Questa serve al tempo stesso a rendere compatibile la lunghezza del DNA con le dimensioni
del nucleo cellulare e a fornire una organizzazione strutturale altamente ordinata che permetta lo
svolgimento di tutti i processi nei quali il DNA è coinvolto. Le proteine associate al DNA nelle
varie fasi di organizzazione della cromatina svolgono anch'esse sia un ruolo strutturale che di
controllo e regolazione.
Il primo livello di organizzazione della cromatina è generalmente chiamato "a collana di perle". A
questo livello organizzativo contribuiscono delle proteine basiche chiamate istoni. Esistono cinque
diversi tipi di istoni: H1 e H2A, H2B, H3, H4. Due molecole di istoni H2A, H2B, H3, H4
interagiscono tra di loro a formare due tetrameri sovrapposti, di forma cilindrica (come due dischi
sovrapposti), intorno ai quali la doppia elica di DNA si avvolge ad intervalli regolari di 200 basi:
160 basi intorno al cilindro e 40 di intervallo con la struttura analoga successiva (Fig. 50 a). Ogni
singolo complesso DNA-istoni prende il nome di nucleosoma. Gli istoni H1 hanno la funzione di
avvicinare ulteriormente i nucleosomi adiacenti. Ogni singola molecola di istone H1 lega
contemporaneamente due nucleosomi contigui e prende contatto con un'altra molecola di istone H1,
a sua volta legata a due nucleosomi, compattando ulteriormente la struttura. L'energia necessaria per
questo compattamento viene fornita dall'idrolisi dell'ATP.
Il secondo livello di organizzazione prevede che il filamento "a collana di perle" (A) si impacchetti
ulteriormente a formare le fibre di 30 nm (B), che a loro volta si ripiegano in anse che hanno una
dimensione di circa 300 nm (C) (terzo livello di organizzazione). La configurazione ad anse
rappresenta lo stato fisico nel quale si trova la cromatina delle cellule durante la interfase del ciclo
cellulare (D). Durante la mitosi, poi, il filamento ad anse si compatta ulteriormente e si rendono
individualmente visibili i cromosomi
La cromatina, a seconda del livello di organizzazione, si divide in eucromatina, che corrisponde ai
primi tre livelli strutturali e consente l'espressione funzionale del messaggio contenuto nel DNA, ed
eterocromatina, che corrisponde ad un livello di compattamento paragonabile al cromosoma visibile
e che impedisce l'espressione genica del segmento interessato. Vi sono normalmente passaggi
dinamici dalla eterocromatina all'eucromatina a seconda delle esigenze funzionali della cellula. Si
parla di eterocromatina facoltativa quando tale passaggio è possibile e di eterocromatina costitutiva,
quando tale passaggio non avviene. Nell'ambito dell'eucromatina, comunque, la grandissima parte
del DNA di ogni singola cellula (quasi il 90%) è inattivo ai fini dell'espressione genica, cioè della
trascrizione di RNA messaggero sullo stampo del DNA.
Organizzazione del gene
La struttura chimica e l'organizzazione tridimensionale del DNA garantiscono la stabilità nel
tempo e la trasmissibilità fedele dell'informazione genetica. La assenza dell'ossidrile del ribosio
rende stabile la molecola di DNA.
La maggior parte dell'informazione contenuta nel DNA serve per la sintesi delle proteine,
che svolgono tutte le funzioni cellulari. Di conseguenza, affinchè l'informazione contenuta nel DNA
diventi fruibile da parte della cellula essa deve essere tradotta in proteine.
Il trasferimento di informazione non può avvenire in modo diretto, per cui occorre un codice
di passaggio da un messaggio scritto nel linguaggio dei 4 nucleotidi ad uno scritto nel linguaggio
dei 20 amminoacidi (codice genetico).
L'informazione scritta sul DNA è organizzata in geni, cioè in sequenze di nucleotidi, la cui
trascrizione e traduzione dà luogo alla sintesi di una singola proteina, e vi sono specifici segnali che
indicano l'inizio e la fine di un gene. Inoltre, non tutta l'informazione contenuta nel DNA si deve
rendere disponibile in tutti i momenti della vita cellulare ed in modo uguale per tutte le cellule.
Il meccanismo di trasferimento dell'informazione genetica dal DNA alle proteine prevede
l'intervento di una classe di RNA specifici, detti RNA messeggeri (mRNA). La sintesi dell'RNA
(trascrizione) è un processo fortemente selettivo, tanto è vero che solo l'1% della sequenza del DNA
viene copiata in sequenze funzionali di RNA (mRNA maturi e RNA strutturali, come RNA di
trasferimento ed RNA ribosomali).
Una delle caratteristiche salienti dell'RNA è quello di avere una struttura molecolare che, a
causa della presenza dell'ossidrile nel ribosio dei nucleotidi che lo compongono, lo rende
particolarmente instabile, con una breve vita media, nel citoplasma cellulare. Ciò rende conto della
possibilità della cellula di modulare finemente la sintesi proteica a seconda delle proprie necessità
funzionali.
Gli RNA vengono sintetizzati come catene lineari sullo stampo di uno dei filamenti della
doppia elica del DNA. La trascrizione avviene ad opera di uno specifico complesso enzimatico, la
RNA polimerasi. Negli eucarioti, esistono tre tipi di RNA polimerasi, che si differenziano a seconda
delle specie di RNA che sintetizzano e la cui diversità è stata scoperta per la loro differente
sensibilità ad una droga, l'a-amanitina (estratta dal fungo amanita phalloides, quello rosso con i
puntini bianchi). L'RNA polimerasi I è localizzata esclusivamente nel nucleolo, trascrive gli RNA
ribosomali 18 S, 28 S e 5.8 S ed è insensibile all'azione dell'a-amanitina; la RNA polimerasi II
trascrive per gli mRNA ed è sensibilissima all'a-amanitina; la RNA polimerasi III trascrive gli RNA
di trasferimento, l'RNA ribosomale 5 S e l'RNA 7 S coinvolto nel processo di maturazione
dell'mRNA e presenta una sensibilità intermedia all'a-amanitina.
La RNA polimerasi II riconosce delle seguenze specifiche sulla doppia elica del DNA,
chiamate promotore, e legandosi in quel punto, provoca una destabilizzazione della doppia elica con
conseguente separazione dei due filamenti. I ribonucleotidi liberi si appaiano sul filamento stampo
del DNA secondo la legge della complementarietà delle basi, sempre ricordando che l'uracile si
appaia all'adenina, e la RNA polimerasi II catalizza la formazione del legame fosfodiesterico solo in
direzione 5'-3'.
L'organizzazione generale dei geni negli eucarioti prevede ampie sequenze nucleotidiche
che non portano alcuna informazione per la struttura delle proteine (introni, IN) intervallate alle
sequenze codificanti (esoni, EX).
Esempio: è come se la frase "OGGI E' UNA BELLA GIORNATA" fosse scritta così:
OGxxxxxxxxGI È yyyyyyyyyyUNA BzzzzzzzzzzzELLA GIORvvvvvvvvNATA
EX
IN
EX
IN
EX
IN
EX
IN
EX
Si forma così una copia fedele di tutto il gene, compensivo di esoni ed introni, che prende il nome
di RNA eterogeneo nucleare gigante (hRNA).
Negli eucarioti il processo di trascrizione avviene nel nucleo, ma la sintesi delle proteine
avviene nel citoplasma, per cui gli mRNA devono passare dal nucleo al citoplasma. Le modalità di
questo passaggio non sono ancora del tutto chiare. Si conoscono, invece, le trasformazioni che
l'hRNA subisce per divantare mRNA maturo, utilizzabile per la sintesi dell proteine. Tali
modificazioni, complessivamente indicate come maturazione dell'mRNA, avvengono tutte nel
nucleo e sono di tre tipi:
1) Capping o incappucciamento. Al nucleotide
posto all'estemità 5' viene aggiunta una 7 metilguanosina, che serve ad impedire inizi casuali
della traduzione.
2) Aggiunta di una coda di poli-A all'estemità
3'. Si tratta di un catena di adenosine in serie
luga dai 100 alle 200 unità monomeriche e
sembra abbia le funzioni di facilitare il trasporto
in uscita attraverso il poro nucleare e di
stabilizzare nel tempo la vita della molecola di
mRNA.
3) Splicing o giuntatura. Attraverso questo processo vengono rimosse le sequenze di RNA
corrispondenti agli introni. Al 5' ed al 3' di ogni introne vi sono sequenze nucleotidiche specifiche
che guidano il processo di taglio e cucito, che avviene grazie all'intervento di un complesso di
riconoscimento ribonucleoproteico, lo spliciosoma. Tale processo deve realizzarsi con estrema
precisione, poichè da errori nell'esecuzione dello splicing possono derivare patologie gravi, come,
ad esempio, la talassemia. D'altra parte la cellula può, a seconda delle proprie esigenze funzionali,
utilizzare nell'ambito della maturazione dello stesso hRNA dei siti di splicing alternativi per la
produzione di proteine con porzioni uguali e porzioni differenti, come nel caso delle
immunoglobuline.
Il meccanismo dello splicing
La sintesi delle proteine
La sintesi delle proteine è un processo complesso in cui intervengono l'mRNA maturo, che
trasporta il messaggio genetico, gli RNA di trasferimento (tRNA), che trasportano gli aminoacidi,
ed i ribosomi, che sono deputati all'accoppiamento tra mRNA e tRNA.
L'informazione contenuta nel DNA è scritta come una sequenza lineare dei 4 nucleotidi. Gli
aminoacidi utilizzati per la sintesi proteica sono 20. Ciò implica che non può esservi una
corrispondenza unicoca tra un singolo nucleotide ed un singolo aminoacido e neppure che un
aminoacido possa essere specificato da una coppia di nucleotidi adiacenti: infatti, in tal caso, si
ritroverebbero solo 16 combinazioni di coppie di nucleotidi rispetto ai 20 aminoacidi. Con una serie
di esperimenti condotti intorno agli anni '60 è stato dimostrato che ogni aminoacidi è specificato da
una combinazione di tre nucleotidi adiacenti, detti tripletta o codone. Considerato che la tutte le
permutazioni possibili dei 4 nucleotidi a gruppi di tre porta a 64 combinazioni, ne deriva che alcuni
aminoacidi possono essere specificati da più di una tripletta (degenerazione del codice).
Il codice genetico, dunque, è il sistema di traduzione del messaggio genetico dal linguaggio
dei nucleotidi, proprio del DNA e dell'mRNA, a quello degli aminoacidi, proprio delle proteine.
Esso presenta alcune caratteristiche generali:
1) è universale, cioè è uguale in tutti gli organismi viventi;
2) è degenerato, cioè più triplette codificano per lo stesso aminoacido;
3) non è ambiguo, cioè una tripletta codifica solo per un aminoacido;
4) non ha segni di interpunzione, cioè non vi è nulla che separi una tripletta da un'altra adiacente,
per cui la lettura è continua.
Tre dei 64 codoni non codificano per nessun aminoacido e rappresentano un segnale di fine
della sintesi proteica (UAA, UAG, UGA).
I tRNA sono piccole molecole di RNA, generalmente della lunghezza di 70-80 nucleotidi. Essi
vengono sintetizzate in forma lineare ed hanno la capacità di formare doppie eliche intracatena che
delimitano delle porzioni strutturali specifiche. La forma tridimensionale assunta dalla molecola di
tRNA è detta atrifolio o ad L, a seconfda del modello seguito. La struttura a trigoglio presenta uno
stelo in cui si trovano appaiate, leggermente sfalsate le estremità 5' e 3' della molecola ed al 3'-OH,
dopo il trinucleotide CCA, è legato un aminoacido. Gli altri tre bracci del trifoglio presentano nella
porzione terminale delle strutture ad occhiello, senza porzioni appaiate, caratterizzate dalla presenza
di basi anomale (dette basi insolite o buffe). Partendo dal 3' si incontra un'ansa importante per il
legame con la superficie del ribosoma; fa seguito l'ansa variabile; e quindi il braccio lungo con
l'ansa di 7 basi non appaiate contenenti l'anti-codone.
Esistono 20 famiglie di tRNA, una per ognuno degli aminoacidi che entrano a far parte delle
proteine. A livello dell'ansa dell'anti-codone si trovano tre nucleotidi che costituiscono, appunto,
l'anti-codone e sono deputati a riconoscere, in base alla legge della complementarietà, le tre basi del
codone sull'mRNA.
Gli aminoacidi, per potersi legare al tRNA, devono essere attivati mediante il legame con
una molecola di AMP, che viene catalizzato dall'enzina aminoacil-tRNA sintetasi L'aminoacido
così attivato rimane strettamente legato all'enzima, fino a quando non incontra una molecola di
tRNA specifica per quell'aminoacido. Lo stesso enzima attivante trasferisce l'aminoacido al residuo
3' terminale di adenina del tRNA, che diventa così carico e può partecipare alla sintesi proteica. La
specificità di queste reazioni viene garantita dalla presenza nella cellula di tante sintetasi quanti
sono gli aminoacidi.
I ribosomi sono particelle, che si trovano in tutte le cellule e contengono RNA e proteine in
quantità approssimativamnte uguali. I ribosomi delle cellule eucariotiche hanno un coefficiente di
sedimentazione di 80 S. Essi sono costituiti da due subunità: una minore di 40 S ed una maggiore di
60S. Il coefficiente di sedimentazione (S -Svedgerg-) è funzione sia del peso molecolare che della
forma e ciò spega perchè la somma di 60 +40 S dà 80 S.
La subunità 40 S è costituita da una molecola di rRNA di 18 S associata con 33 proteine
specifiche, mentre la subunità maggiore è composta da tre molecole di rRNA (28 S, 5 S e 5.8 S) e
49 molecole proteiche. Gli rRNA vengono sintetizzati nel nucleo, a livello di una struttura virtuale,
il nucleolo. I geni che portano l'informazione per la sintesi degli rRNA si trovano in molte copie e
su più cromosomi; durante l'interfase i vari cromosomi avvicinano le porzioni contenenti
l'informazine per la sintesi di tali RNA in una stessa zona del nucleo, dove comincia ad avvenire
trascrizione di rRNA in un'unica lunga molecola di 45 S, che verrà poi maturata per dare origine
alle tre specie molecolari di 28, 18 e 5.8 S (l'rRNA.5 S proviene da un altro luogo del nucleo).
Questo spiega la componente fibrillare della struttura del nucleolo, mentre la sua componente
garnulare è dovuta all'assemblaggio degli rRNA maturati con le proteine ribosomali specifiche
provenienti dal citoplasma. Le due subunità mature escono separatamente dal nucleo e si uniranno
nel citoplasma solo in presenza del mRNA.
Il ribosoma contiene tre siti di legame specifici: uno per l'mRNA e due per i tRNA, sito
peptidico o P e sito amionoacidico o A.
L'mRNA si lega, con l'aiuto di specifici fattori proteici, alla subunità minore del ribosoma a
livello di uno specifico codone che viene sempre riconosciuto come segnale di inizio della
traduzione, l'AUG. Il tRNA che ha come anticodone l'UAC e porta caricata alla sua estremità 3' la
formil-metionina si lega al codone AUG e solo a questo punto la subunità maggiore del ribosoma si
associa con quella minore.
A questo punto, un secondo tRNA specifico per il codone successivo all'AUG, coperto dalla
subunità maggiore, si andrà a posizionare nel sito A. Perchè si costituisca un legame peptidico tra
l'esremità carbossilica della formil-metionina e l'estremità aminica dell'aminoacido che occupa il
sito A occorre l'intervento dell'enzima peptidil-transferasi, che è una proteina strutturale della
subunità maggiore del ribosoma. Tale legame avviene nel sito A del ribosoma e l'energia per la
formazione di esso viene fornita dall'idrolisi del GTP.
Il tRNA che si trova nel sito P, privato dell'aminoacido, perde affinità per il sito P stesso,
mentre il tRNA carico della catena polipeptidica nascente si trasferisce nel sito P e
contemporanemente il ribosoma scorre di tre nucleotidi, per cui il sito A sarà vuoto e disponibile
per un nuovo tRNA. Questo trasferimento prende il nome di traslocazione del ribosoma.
Il processo continua fino a quando nel sito A non si verrà a trovare un codone di arresto. In
questo caso si legano al sito A delle proteine citoplasmatiche dette fattori di distacco, che alterano
l'attività della peptidil-transferasi inducendola ad aggiungere al peptidil tRNA una molecola di
acqua anzicchè un aminoacido. Questo libera la catena polipeptidica dal tRNA cui è ancora legata.
A questo punto, le due subunità del ribosoma si staccheranno e libereranno l'RNA, pronte a legarsi
ad un altro messaggero per una nuova sintesi.
Sebbene vi siano diversi AUG (codone che specifica per la metionina) nel mRNA, viene
scelto il primo dopo il cappuccio di 7 metil-guanosina come sito di inizio della sintesi, cui legare la
formil-metionina, che rappresenta l'aminoacido d'inizio poichè la formilazione mima un legame
peptidico. Questo meccanismo garantisce anche l'accurata griglia di lettura di tutto l'mRNA.
