Muscillo - Istituto Superiore di Sanità

.
CORSO 017C:
Acque destinate al consumo umano:
l'applicazione del Decreto Legislativo 31/2001
.
Roma Istituto Superiore sanità,
Lunedì 29 ottobre 2007, 14.30-15.30
Michele Muscillo, Marcello Iaconelli, Mannocher Pousharban, Giuseppina La Rosa.
Isolamento e identificazione di enterovirus,
adenovirus e norovirus nell’acqua ed altre matrici
ambientali
Per eventuali comunicazioni contattare:
([email protected])
Tel 0649902718
Fax 0649902718
Virologia ambientale
Corso ISS 017C del 29-10-2007
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Sommario
Le principali metodologie in questo campo si
basano essenzialmente su:
- concentrazione dell’acqua da 100-10 L a 200 µl
in due step,
-Identificazione dei virus con sistemi biologici o
molecolari (PCR e sequenziamento genico).
Nuove prospettive
-Uso della PCR quantitativa o Real Time-PCR
-(Identificazione mediante microchip-microarray)
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I punti essenziali della
problematica
CONCENTRAZIONE DI GROSSI VOLUMI D’ACQUA
Ultrafiltrazione a flusso tangenziale
Cartucce a filtri elettropositivi o elettronegativi
Lana di vetro
IDENTIFICAZIONE DEI VIRUS
–
Biologica: inoculo su cellule, poi saggi LBM ed IFA
–
Molecolare: PCR, RealTime PCR, analisi sequenze
–
Integrata: inoculo su cellule, RealTime PCR (T0-T3)
VALUTAZIONE DELL’ESPOSIZIONE
- molto empirica in quanto l’ applicazione di modelli matematici
è poco attendibile
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Cosa sono i virus enterici
• I virus enterici sono parassiti ultramicroscopici
endocellulari, dotati di affinità elettiva verso un
determinato ospite. La barriera interspecifica
può, talvolta, essere superata.
• Sono privi dell’organizzazione necessaria per la
replicazione e quindi hanno la necessità di
impadronirsi dell’apparato citoplasmatico o
nucleare della cellula eucariotica specializzato
nella sintesi di proteine o acidi nucleici
• Si replicano prevalentemente nell’intestino ma
sono spesso neurotropici e cardiotropici.
Hanno talvolta anche tropismo respiratorio.
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PECULIARITA’ DEI VIRUS COME AGENTI DI
RISCHIO BIOLOGICO AMBIENTALE
1.hanno una bassa carica infettante
2.possono causare infezioni asintomatiche
3.possono sviluppare nell’ospite un’immunità breve
4.hanno un’elevata variabilità genetica
5.sono eliminati in gran numero
6.hanno molteplici vie di trasmissione
7.hanno una elevata resistenza ambientale ed ai
trattamenti di disinfezione
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La contaminazione virale dell’ambiente idrico da parte di virus
patogeni per l’uomo rappresenta una problematica emergente nella
valutazione del rischio biologico.
Norovirus
ssRNA
Adenovirus
dsDNA
Enterovirus
ssRNA
VIRUS ENTERICI TRASMESSI
COME CONTAMINANTI
DELL’ACQUA
HAV
ssRNA
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Rotavirus
dsRNA
HEV
ssRNA
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Famiglia Picornaviridae:
•
Genere Enterovirus (64 sierotipi)
1. (PV) Poliovirus
:3 tipi (1-3)
2. (HEV-A) Human Enterovirus A: 11 coxsackievirus A (CA) ed
enterovirus 71,
3. (HEV-B) Human Enterovirus B: 36 Coxsackievirus B, tutti gli
echovirus, enterovirus 69 e Coxsackievirus A9
4. (HEV-C) Human Enterovirus C: 11 Coxsackievirus A
5. (HEV-D) Human Enterovirus D: Enterovirus 68 e 70.
– Enterovirus sp non umani:
34 tipi
Genere Hepatovirus:
Genere Rinovirus:
Genere Cardiovirus (encefalomiocardite)
Genere Aftovirus (Virus malattia piedi e mani)
Fields, B. N., Knipe, D. M., Howley, P. M, Chanock, R. M., Melnick, J., Monath, T. P., Roizman, B., and
Straus, S. E. Virology. Fields, B. N. 3[1], 1-1473. 1995. Philadephia, Lippincott-Raven.
Oprisan, G., M. Combiescu, S. Guillot, V. Caro, A. Combiescu, F. Delpeyroux, and R. Crainic. 2002.
Natural genetic recombination between co-circulating heterotypic enteroviruses. Journal of General Virology
83:2193-2200.
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I VIRUS ENTERICI
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ENVIRONMENTAL SAMPLES
CONCENTRATION
a) 10 L water:Tangential ultrafiltration + PEG prec.
b) 50 ml sewage: 10.000xg +200.000xg ultracent.
HUMAN FECES
1 ml of PBS suspension: 140µl, RNA extraction
REAL TIME RT-PCR
DATA ANALYSES
QUALITATIVE RT-PCR
ELETTROPHORESIS
QUANTIFICATION
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SEQUENCING
IDENTIFICATION
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Concentrazione di 10 L mediante cartucce
verticali. L’uso del controllo positivo richiede, in ottemperanza alle norme di
sicurezza, una cappa Biohazard. Il controllo positivo è un virus ed è necessario per la
valutazione dell’accuratezza e sensibilità del metodo.
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Concentrazione a flusso tangenziale di 10L di acqua:
(sono disponibili cartucce di lunghezza variabile)
prefilter
pump
cartridge
waste
The concentrate
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Cartucce di ultrafiltrazione per
piccoli volumi, max 40 ml
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Concentrazione mediante
ultrafiltrazione di 38 ml di
sospensione
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Scarto dell’ultrafiltrato
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Unità contenente l’ultrafiltrato
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Recupero del concentrato
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Recupero del concentrato
mediante centrifugazione
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Volume finale = 100-200 ul
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Colonna di lana di vetro
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Filtrazione su lana di vetro
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Eluizione, flocculazione a pH acido, centrifugazione
7.000xg, formazione pellet proteine-virus
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Filtrazione su membrana elettronegativa: preparazione della
membrana elettronegativa
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Assemblaggio di membrana e
prefiltro nell’apparato filtrante
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Le membrane vengono strette tra la base ed il coperchio
dell’apparato filtrante
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L’apparato per la filtrazione viene fissato con appositi bulloni
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• Trascrizione
inversa RNA
RNA
DS
Marker
Il pellet creato come visto prima, viene utilizzato per :
a) estrazione acidi nucleici per analisi filogenetica
• Amplificazione
PCR del DNA
220 bp
201
154
134
75
cDNA
®
170 bp
RNA
5’NC
• Sequenziamento dei
frammenti amplificati
• analisi filogenetica
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b) Colture cellulari: inoculo del pellet, risospeso in
PBS, su monostrati cellulari e analisi delle placche
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Placche di adenovirus su monostrati cellulari dopo
3 gg di incubazione a 37°C, fissaggio delle cellule
e colorazione per evidenziare le aree di lisi
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Una collezione di 78 enterovirus umani, quando analizzata con
sieri di Melnick, presentava un gran numero di casi non identificati
(N.D.). Soltanto con l’analisi filogenetica è possibile identificare la
maggior parte dei non-poliovirus.
•
SET
A
B
C
N. of
samples
27polio
34 nonpolio
17N.D
Manzara, S., M. Muscillo, G. La Rosa, C. Marianelli, P. Cattani, and G. Fadda.
Molecular identification and typing of enteroviruses isolated from clinical
specimens. J.Clin.Microbiol. 40:4554-4560. 2002
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Un particolare di un albero filogenetico che evidenzia
altissime correlazioni genetiche tra enterovirus umani
ed alcuni ceppi di enterovirus porcini
Af363453
Pev9xx
Af363454
9421-v4
Pen295169
Af363455
Af085363
Pol15utrd
Pol5utrk
Ev25m1262
Ev25th222
Ev3vp2gen
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Porcine enterovirus 9
Porcine enterovirus type 9
Porc ine enterovirus 9
Ita93/DV/941 (2003)
Porcine enterovirus 9, ITA92-915BE915
Porcine enterovirus 10,
Coxsackievirus B2 strain Ohio-1
Poliovirus type 3 2141/Switz/80
Human echovirus 25
Human echovirus 3
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Dalla nostra esperienza sulle
acque di mare:
• Molti virus sono difficili da identificare,
soprattutto non-poliovirus ed in particolare
gli echovirus ed i coxsackievirus A
• Molti enterovirus sono ricombinanti
• Frequente è il rilevamento di reovirus,
spesso ricombinanti per i quali non è
possibile risalire all’ospite
• Possibilità di isolare enterovirus porcini,
spesso parzialmente simili agli umani
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Analisi quantitativa dei virus:
Real Time PCR e RT-PCR
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Principio della reazione PCR Real Time: nella RealTime vi è, in aggiunta ai primer, un probe
con un florocromo, generalmente il FAM, in 5’ ( R, reporter) ed una molecola all’estremità 3'
che blocca la fluorescenza ( Q, quencher). La fluorescenza non viene emessa quando
entrambe le molecole sono presenti sul probe.
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Ad ogni ciclo di PCR, la polimerasi estende
il probe utilizzando come stampo il
filamento di DNA su cui è ibridato.
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La polimerasi estende il primer e scorrendo lungo il DNA incontra il probe
e lo degrada per effetto della sua attività 5’ esonucleasica.
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Il fluorocromo emette fluorescenza in quanto non è più
bloccato dalla vicinanza del quencher.
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Piastra a 96 pozzetti per la preparazione delle miscele di reazione
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Sistemazione della piastra nella camera dell’incubatore a
programmazione ciclica.
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Emissione di fluorescenza liberata
dal fluorocromo
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La fluorescenza aumenta di intensità con il procedere degli
step di amplificazione
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La fluorescenza viene misurata dall’apparato
ottico dello strumento utilizzato per
l’esecuzione della Real Time
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La curva di emissione della fluorescenza
viene registrata in un file
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Condizione indispensabile per l’esecuzione della RealTime è la
disponibilità di uno standard.
Per i virus ad RNA (enterovirus, norovirus) occorre una soluzione di
RNA sintetico la cui concentrazione deve essere
spettrofotometricamente determinata. Per i virus a DNA (adenovirus)
lo standard è più facile da preparare in quanto si ricava da un
plasmide ove il target è stato precedentemente clonato.
La preparazione dello standard di RNA sintetico di un virus ad RNA
è complesso e richiede altissima specializzazione: la regione target
del virus viene trascritta, poi amplificata e quindi clonata in un
plasmide particolare. Successivamente l’RNA sintetico viene
prodotto da questo plasmide mediante trascrizione in vitro ottenuta
tramite SP6 o T7 RNA polimerasi. La soluzione di RNA viene privata
del DNA contaminante, purificata e determinata
spettrofotometricamente a 260 nm. Tramite il numero di Avogadro,
viene calcolato il numero esatto di molecole contenute nella nostra
soluzione. Opportune diluizioni di questa soluzione vengono
analizzate in doppio o in triplo parallelamente al campione.
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Preparazione della scheda
Realtime
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Tipico elettroferogramma dello
standard di poliovirus sintetico
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Tipica curva di calibrazione con uno standard di
RNA sintetico di poliovirus
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Infectious unit/10 ul
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Campioni ambientali : come si differenziano i campioni positivi
dai negativi.
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Curva di calibrazione effettuata usando RNA sintetico
derivante da Norovirus GII
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REFERENZE BIBLIOGRAFICHE
•
Muscillo, M., A. Carducci, G. La Rosa, L. Cantiani, and C. Marianelli.. Enteric virus
detection in adriatic seawater by cell culture, polymerase chain reaction and
polyacrylamide gel electrophoresis. Wat.Res. 31:1980-1984. (1997)
•
Manzara, S., M. Muscillo, G., La Rosa, C. Marianelli, P. Cattani, and G. Fadda.
Molecular identification and typing of enteroviruses isolated from clinical specimens.
J.Clin.Microbiol. 40:4554-4560 (2002).
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•
La Rosa,G., Fontana,S., Di Grazia,A., Iaconelli,M., Pourshaban,M., and Muscillo,M.
Molecular Identification and Genetic Analysis of Norovirus Genogroups I and II in Water
Environments: Comparative Analysis of Different Reverse Transcription-PCR Assays.
Applied and Environmental Microbiology 73 (13), 4152-4161. (2007).
•
La Rosa,G., Fontana,S., Di Grazia,A., Iaconelli,M., Pourshaban,M., and Muscillo,M.
Quantification of genogroups I and II noroviruses in clinical and environmental samples via
TaqMan Real-Time RT-PCR. In preparazione, (2008)
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CONCLUSIONI
LA STANDARDIZZAZIONE DEI METODI
DI CONCENTRAZIONE E
IDENTIFICAZIONE DEI VIRUS SONO
ESSENZIALI
•
Ci si auspica una revisione delle normative per le acque potabili a
livello comunitario come si sta facendo per le acque di balneazione
nell’ambito del progetto europeo VIROBATHE, “Sixth Framework
Programme- Specific Targeted Research Project. Methods For The
Concentration And Detection Of Adenoviruses And Noroviruses In
European Bathing Waters With Reference To The Revision Of The
Bathing Water Directive 76/160/EEC” ove partecipano 16 gruppi
Europei per un totale di 9 stati.
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