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CNR-short term mobility 2008
Relazione scientifica finale
Caratterizzazione dei piccoli RNA accumulati in piante di Vitis vinifera infette da virus
Vitantonio Pantaleo
Istituto di Virologia vegetale-CNR, Via Amendola 165/A 70010 Bari (Italy)
Laboratorio ospite: Agricultural Biotechnology Center (Godollo-Hungary)
Supervisore: Dr. J. Burgyan.
Periodo di attività: 9 maggio 2008 - 31 maggio 2008
Obiettivi
L’obiettivo del progetto è stato quello di creare un database dei piccoli RNA
(siRNA) di Vite (Vitis vinifera) allo scopo di conoscere qualitativamente e
quantitativamente i piccoli RNA presenti nella pianta per quindi valutarne la loro
funzionalità.
Risultati
Germogli e foglie (fino al 3°-4° palco fogliare) di Vitis vinifera della varietà
“Pinot noir”, clone ENTAV115 (Velasco et al., 2007), sono stati prelevati durante la
ripresa vegetativa ed utilizzati per l’estrazione degli RNA totali (totRNA) mediante
fenolo-cloroformio secondo la metodologia descritta da Carra et al., 2007 . Circa 200
g di totRNA sono stati applicati ad una colonna cromatografica al fine di arricchire
la frazione di totRNA a basso peso molecolare (LMW RNA, <200 nt).
Circa 10 mg di LMW RNA sono stati caricati su gel denaturante 15%Acrilammide 1X TBE ed i piccoli RNA di 19-26 nt (siRNAs) sono stati eluiti in 0.3M
NaCl e precipitati in isopropanolo.
Gli siRNAs sono stati ligati ad un oligonucleotide 5’-adattatore di sequenza nota
mediante la reazione con T4 RNA ligasi. I prodotti di ligazione di circa 45-52 nt
(5’ad-siRNAs) sono stati separati su gel denaturante 15%-Acrilammide 1X TBE e
quindi eluiti in 0.3M NaCl e precipitati in isopropanolo.
Gli 5’-ad-siRNAs sono stati quindi ligati con un oligonucleotide 3’-adattatore
3’-fosforillato di sequenza nota mediante reazione con T4 RNA ligasi. I prodotti di
ligazione di circa 69-76 (5’-ad-siRNAs-3’-ad) sono stati separati su gel denaturante
15%-Acrilammide 1X TBE e quindi eluiti in 0.3M NaCl e precipitati in isopropanolo.
Molecole di DNA complementare (cDNA) sono state quindi prodotte mediante
l’ausilio della Reverse transcriptase ad un oligonucleotide complementare alla
sequenza del 3’-adattatore ed utilizzate come stampo per la reazione di PCR. Un
oligonucleotidie complementare all’oligo 3’-adattatore ed un altro omologo al 5’adattatore sono stati utilizzati come primers di PCR.
Una parte del prodotto di PCR di circa 90 pb è stato clonato, previa eluizione da
gel di acrilammide non denaturante, in pUC18 e sequenziato. Le sequenze ottenute
sono state confrontate con il database del genoma di Vitis vinifera al fine di verificare
la bontà del processo di clonaggio ed amplificazione. Infine, il prodotto di
amplificazione è stato inviato per la sequenza High Throughput Sequencing con
metodologia SOLEXA.
Conclusioni
Le ricerche condotte nell’ambito del progetto short term mobility da me curato
presso Agricultural Biotechnology Center con la supervisione del Dr. J. Burgyan,
hanno offerto la possibilità di esplorare e mettere a punto un protocollo di clonaggio e
sequenza di siRNAs di vite. Tale protocollo, ulteriormente perfezionato in corso
d’opera, sarà esteso a diversi campioni di vite di defferente varietà e di differenti
tessuti (foglie, germogli, infiorescenze e frutti) in modo tale da creare un database
completo degli siRNAs di vite endogeni ed esogeni (es. siRNAs virali).
Bibliografia citata
Carra A, Gambino G, Schubert A, 2007. A cetyltrimethylammonium bromidebased method to extract low-molecular-weight RNA from polysaccharide-rich plant
tissues. Analytical Biochemistry 360:318-320.
Velasco R, Zharkikh A, Troggio M, Cartwright DA, Cestaro A, Pruss D, Pindo M,
Fitzgerald LM, Vezzulli S, Reid J, Malacarne G, Iliev D, Coppola G, Wardell B,
Micheletti D, Macalma T, Facci M, Mitchell JT, Perazzolli M, Eldredge G, Gatto P,
Oyzerski R, Moretto M, Gutin N, Stefanini M, Chen Y, Segala C, Davenport C,
Demattè L, Mraz A, Battilana J, Stormo K, Costa F, Tao Q, Si-Ammour A, Harkins
T, Lackey A, Perbost C, Taillon B, Stella A, Solovyev V, Fawcett JA, Sterck L,
Vandepoele K, Grando SM, Toppo S, Moser C, Lanchbury J, Bogden R, Skolnick M,
Sgaramella V, Bhatnagar SK, Fontana P, Gutin A, Van de Peer Y, Salamini F, Viola
R., 2007. A High Qualità Draft Consensus Sequence of the Menome of a
Heterozygous Grapevine Variety. PLoS ONE 19; 2(12): e1326.
Il fruitore
Dott. Vitantonio Pantaleo
Il proponente
Dott.ssa Luisa Rubino