Terapia genica I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 Parte teorica I (14-14.15): Dal DNA alla terapia genica. Umori sulla terapia genica I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 E.WFW. Alton, London ESGT Meeting 99 Cures all known diseases Ridiculous idea Good treatment Woudn’t give it to my dog What I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 Il DNA come l’aspirina Why I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 Vantaggi teorici: • • • • Lunga durata Trattamento della causa Specificita’ Assenza di effetti collaterali Why not I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 • Danno (inefficienza) da protocollo terapeutico • Dato il rischio quando e’ giustificata la terapia? • Trasduzione della linea germinale (eugenetica) How I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 Primo step: Scegliere, manipolare il DNA da usare come medicina D D N How I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 Secondo Step: Portare il DNA dentro alla cellula e farlo funzionare (a lungo) ND N D ND How I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 Terzo Step: Fare in modo che il processo funzioni in tutte le cellule e per la durata di vita dell’individuo (cervello=100x10e9 neuroni). Terapia genica I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 Parte pratica I (14.15-15.30): Manipolazione del DNA How I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 Primo step: Scegliere, manipolare il DNA da usare come medicina D D N Procedura sperimentale per l’estrazione di DNA umano I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 1. Congelamento/scongelamento per rompere le cellule (aliquote da 4x10e6 cellule in 500ul)li 2. Centrifugata 5’ a 13000 rpm per precipitare i detriti cellulari 3. Recupero supernatante e trasferimento in una nuova eppendorf 4. Aggiunta di 50 ul di NaAcO 3M(formazione di complessi ) Procedura sperimentale per l’estrazione di DNA umano I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 5. Vortex 6. Aggiunta di 1 ml di EtOH 100% (formazione del precipitato di DNA) 7. Vortex 8. Centrifugata 5’ a 13000 rpm per precipitare il pellet di DNA Procedura sperimentale per l’estrazione di DNA umano I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 9. Eliminazione del supernatante 10. Incubazione del campione 3’ a temperatura ambiente per far evaporare l’EtOH 11. Pellet in 1 ml di H2O sterile Procedura sperimentale per l’analisi di DNA umano I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 1. Preparazione aliquote da 15 ul di DNA estratto dalle cellule 2. Aggiunta di 3ul loading buffer 3. Caricamento su gel con controlli 4. Corsa a 100 volts per 15’ Terapia Genica I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 Parte teorica II (9.15-9.45 e 11.3012): Gli esperimenti di terapia genica sull’ uomo. La terapia genica oggi I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 • • • • 636 protocolli clinici > 3496 pazienti > 20 paesi Ampio spettro di target terapeutici (AIDS, fibrosi cistica, emofilia, diabete, cancro…) http://www.esgt.org Protocolli clinici approvati I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 Fasi dei protocolli clinici approvati I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 •Fase I: pochi pazienti per stabilire la safe dose •Fase II: piu’ pazienti seguiti per piu’ tempo •Fase III: grande numero di pazienti seguiti per mesi o anni •Fase IV: fase 'post-marketing' Protocolli clinici in funzione del tempo I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 Caratteristiche dei target terapeutici “ideali” I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 • • • • • Malattie mortali Gene noto Accessibilita’ del tessuto colpito Regolazione del gene non determinante Stato clinico del malato reversibile Malattie trattate con terapia genica I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 Geni usati nei protocolli di terapia genica I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 Sistemi di trasferimento genico usati nei protocolli clinici di terapia genica I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 Protocolli clinici di terapia genica in (nord!) Italia I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 # author illness gene system phase comments IT 001 C. Bordignon San Raffaele Milano C. Bordignon San Raffaele Milano C. Bordignon San Raffaele Milano Natale Cascinelli Istituto Tumori, National Cancer Inst. Milano Natale Cascinelli Istituto Tumori, National Cancer Inst. Milano V. M. Fazio Istituto Medicina Sperimentale CNR Roma Giorgio Parmiani Istituto Tumori, National Cancer Inst. Oncologia Sperimentale Milano A. Aiuti San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (HSR-TIGET) Milan M Maio Centro di Riferimento Oncologico Aviano F. Belli National Cancer Institute Milan Italy ADA ADA gene/ neo gene TK/neo gene Retrovirus in PBL ex vivo Retrovirus in PBL I/II open I/II open TK/neo gene Retrovirus in PBL I/II open IL-4 Retrovirus in melanoma cell line I/II 2/11 patients clinical effect IL-2 Retrovirus in melanoma cell line I/II open Naked vector intramuscolar I open IT 002 IT 003 IT 004 IT 005 IT 006 IT 007 IT 008 IT 009 IT 0010 Precautional for Immunomodulation of Donor Anti-Tumor Immunity Precautional for Immunomodulation of Donor Anti-Tumor Immunity melanoma melanoma Lymphoma leukemia Metastatic melanoma IL-4 Retrovirus I/II 2/11 patients clinical effect ADA ADA gene Retrovirus in stem cells I open melanoma IL-2, IL-4 I open melanoma IL-2, IL-4 I Closed (results?) Liposomi (8.6 %) I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 + + + _ DNA _ + + _ DNA _ _ + + + + _ _ _ _ _ Liposomi: durata I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 Trasferimento di un gene reporter nel topo con liposomi (intraven.) Andamento in funzione del tempo. Liposomi: tossicita’ I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 Tossicita’ dose dipendente di liposomi-DNA iniettati nella cavita’ nasale di topi di Laboratorio (sezioni polmonari 48h p.i.) Why Virus (70.6%) I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 Virus ricombinante ex vivo: efficacia sull’uomo I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 Virus ricombinante ex vivo: efficacia sull’uomo I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 Ex-vivo Retrovirus-mediated gene therapy: ADA protocolli 1990 NIH, USA (Science 1995, Blaese et al) • Sicuro • Inefficiente • Risultati non definitivi: trattamento parallelo con proteina Virus ricombinante ex vivo: efficacia e tossicita’ sull’uomo I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 G 1998 Successo o catastrofe? 2 pazienti / 11, 1 protocollo / 263 Virus ricombinante in vivo: tossicita’ sull’uomo I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 Adverse event (1 caso/ 256 protocolli clinici) Wilson and coworkers; Science 2000 Winstar Institute U-Penn USA • • • • • OCT deficienza, X-linked Adenovirus E2tsE1-/OCT Iniettato nella vena epatica 3.8x1013 particles 4 giorni dopo l’iniezione il paziente muore WHY? Virus ricombinante in vivo: la risposta immunitaria I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 Inflammation 48h CTL 7d Abs 21 d Risposta immunitaria: dal male il bene? I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 Topi di Laboratorio con tumore trattati con virus (AdIL-2) Virus ricombinante ex vivo su cellule staminali I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 Valutazione del rischio I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 Virus: •RC virus (problema nel paziente e nell’ambiente) •Immunogenicita’ •Creazione di nuovi virus •Mutagenesi inserzionale •Danno da prodotto genico •Irreversibilita’ Non-virus: •Immungenicita’, tossicita’ •Danno da prodotto genico Come si controlla il rischio biologico I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 In Laboratorio • Inattivazione del virus (delezioni, targeting, controllo trascrizionale, cell marking) • Manipolazione sotto cappe Biohazard • P2, P3 • Isolatori per gli animali • Analisi dei preparati da usare per I trattamenti (presenza di materiale batterico, presenza di RCA) Sul paziente • • • • • Selezione del target Isolatori per i pazienti trattati con virus Analisi della risposta immunitaria/infiammatoria Analisi della presenza di virus circolante Follow up clinico su lunghi tempi Organismi di controllo giuridico dei protocolli clinici di terapia genica I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 •Italia: Ministero della salute •Europa:The European Agency for the evaluation of Medicinal products (EMEA) http://www.emea.eu.int/sitemap.htm •USA: FDA Terapia genica I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 Parte pratica II (9.45-11 e 1213.15): Trasferimento genico nella cellula umana mediante virus How I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 Secondo Step: Portare il DNA dentro alla cellula e farlo funzionare (a lungo) ND N D ND Procedura sperimentale per la trasduzione di DNA in cellule umane I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 1. Visualizzazione al microscopio di cellule umane. (12 piastrine 6well con 24 pozzetti contenenti ciascuno 5x10e6 cellule HeLa). (10’) 2. Cenni sulla quantita’ di virus da usare, sul vettore e sul transgene in uso. (5’) 3. Aspirazione del mezzo di coltura dalle cellule da trasdurre. (15’) 4. Aggiunta alle cellule del virus ricombinante (2000 opu per pozzetto in 500ul, tot. 2.4x10e10 opu). ( 15’) Terapia genica I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 Parte pratica III (9.30-10-30 e 12-13): Analisi della cellula umana geneticamente modificata Procedura sperimentale per la visualizzazione della cellula umana geneticamente modificata I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 1. Trasferimento su vetrino delle cellule trasdotte 2. Visualizzazione al microscopio del transgene (GFP) espresso dalle cellule con microscopio a fluorescenza Terapia genica I. Saggio Open Lab, Roma La Sapienza 7-9 ottobre 2004 Si ringraziano Gioia Cherubini Stefania Piersanti Per il prezioso contributo alla parte sperimentale di questa sezione del corso Open Lab