Cellule Staminali e Clonazione
(terapeutica)
Arti Ahluwalia
Percentage of papers dedicated to stem cells in the journal Tissue Engineering,
since its inception in 1995. By the end of this decade, 50% of all papers in
regenerative medicine will probably focus on the use of stem cells.
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Le Proprietà di cellule staminali
• Capacita di auto rinnovarsi (self-renewal)
• Capacità di differenziarsi lungo almeno
una linea
The cell which results from the fertilisation of an egg by a sperm has the capacity
to form an entire organism (a person). This cell is TOTIPOTENT, and in the first
few hours of division can produce other similar totipotent cells (TWINS
TRIPLETS).
After about 4 days, the cell divides into other cells which are not totipotent, but can
become organs. These are known as embryonic stem cells (PLUIRPOTENT).
2
Stem Cells
In teoria possono subire un numero infinito di divsioni (cioè è
immortale*) e possono differenziarsi per diventare altre cellule
specializzate. Il progenitore non è immortale.
Nell’adulto sono state trovate nella pelle, sangue, cornea, denti,
intestini. Anche nel cervello e nel fegato (forse). .
Qundi possono essere
Unipotente
Multipotente
Pluripotente
Totipotente
Embryonic
Properties: self renewal,
differentiate
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La ‘potenza’
•
•
•
•
Cellula unipotente: si definisce unipotente una cellula staminale che dà
origine ad un progenitore il quale, dopo la sua attività proliferativa, genera
un solo tipo cellulare. Il prototipo di questo tipo cellulare è la cellula
staminale dell’epidermide, che genera solo i cheratinociti della nostra pelle.
( In realtà si è visto che c’è almeno una componente di cellule staminali
nella parete del follicolo pilifero, che può dare origine a tutte le componenti
del pelo, ma anche alle cellule dell’epidermide)
Cellula multipotente: il prototipo della cellula staminale multipotente o
pluripotente è la cellula staminale ematopoietica, che dà origine alla la serie
linfatica (linfociti T, B e natural killer), ai globuli rossi, alle piastrine, ai
granulociti (neutrofili, eosinofili, basofili). La cellula staminale ematopoietica
origina quindi tutte le cellule del sangue e anche cellule con capacità
fagocitarie che si trovano ubiquitariamente nei tessuti.
Cellula pluripotente:potenzialmente sono in grado di generare progenitori
per tutti i tipi di cellule. Sono di questo tipo le cellule staminali embrionali
(nella blastocisti) capaci di formare tutti i tessuti dell’organismo.
Cellula totipotente:sono in grado di formare organismi interi.
Si parla di cellule che hanno perso la potenza....
Modi di divsione dalla cellule
staminali
• Succesione clonale: nella niccha ci sono cellule
quiescienti che vengono svegliate solo in caso di
necessità. Quando vengono stimolate (da ferite ecc),
alcuni si divdono producendo un numero elevato di
cellule differenziate. Pero’ la cellula iniziale non viene
rinnovata
Nicchia: il stemness viene perso quando esce dalla nicchia
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Modello deterministico: Quando entra in azione la cellula
produce due figlie di cui una rimane staminale.
Cellula staminale
Cellula staminale
Cellula progenitrice
Cellule differenziate
Modello Stochastico: La divisione della cellula staminale puo
dare luogo a due figlie staminali, o nessua, o una, a secondo
del bisogno
Cellula staminale
Cellula staminale
Cellula staminale
Cellula progenitrice
Cellula staminale
Cellula staminale
Cellule differenziate
2
Cellule differenziate
1
Cellula staminale
0
5
Quello che succedera forse
dipende da fattori esterni
Immortalità e sensecenza
• Sembra comunque che la C. Staminale
non può sopravivere più di 130 anni.
Cose che invecchia, la cellula o il suo
microambiente? Che ruolo hanno le C.
Staminali nella regenerazione e riparo?
C.Staminali da animali vecchi hanno lo
stesso effetto di quelli giovani quando
impiantati in animali giovani.
E in animale giovani cosa succede?
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Il limite di Hayflick
Limite di Hayflick
Zona logaritmica
Animale
eta
H
topo
½
20
Pollo
10
30
Uomo
120
50
Tartaruga
160
120
Eta specie
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telomeri
• La senescenza è dovuta in grande/piccola parte
ai telomeri.
• Parte terminale dei cromosomi, diventa piu
piccola dopo ogni duplicazione
• Da 9-11 kbp, quando diventa 5-6 kbp la
divisione cellulare diventa instabile
• Ci sono enzimi telomerasi che riparano la parte
terminale dopo ogni divisione
• Si trovano nelle cellule germinale, nelle cellule
tumorali, e anche (ma con bassa attività) nelle
cellule staminali ematopoetiche
Vecchie cellule staminalivecchio tessuto, le cs
invecchiano perche sono
sempre attive
Invecchiamento
dovuto al
microambiente
(perche le CS non
invecchiano)
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Si traduce in “quante C,S si sono”?
Il differenziamento
• La diversità tra una cellula staminale e un progenitore da
un punto di vista molecolare risiede nell’espressione
differenziale di geni. Considerando che il genoma della
cellula staminale e del progenitore sono identici tra loro,
le due cellule si distinguono solo in modo funzionale,
cioè per il loro fenotipo, cioè per la loro espressione
• L’espressione differenziale o meglio la trascrizione
differenziale dei geni è regolata da tre meccanismi:
• 1) La localizzazione o segregazione di determinanti
citoplasmatici
• 2) L’induzione da parte di segnali provenienti da altre
cellule o tra le cellule figlie, o il microambiente, la
nicchia*
• 3) L’apoptosi (morte naturale cellulare)
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Dove si trovano
• negli embrioni nelle prime fasi di sviluppo (blastocisti)
ottenuti mediante fecondazione in vitro per il
trattamento dell’infertilità o specificatamente a scopo di
ricerca (cellule staminali embrionali)
• negli pseudo-embrioni creati inserendo il nucleo di una
cellula somatica adulta (staminale o meno) in una cellula
uovo privata del proprio nucleo (cellule staminali
embrionali clonate) (cioe Dolly)
• nelle cellule derivate da feti (cellule staminali fetali)
• nel sangue dei vasi del cordone ombelicale (cellule
staminali fetali)
• nei tessuti adulti (cellule staminali adulte)
Cellule Staminali dal midollo osseo
• Adult stem cells can be obtained from
bone marrow (main source:pelvic bone).
• Hematopoietic cells : everything in blood,
RBC, etc
• Mesenchymal: bone, cartilage, muscle,
stroma, tendon, connective tissue (dermis,
adipocytes ets)
• The marrow is seperated by allowing cells
to settle
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• What do they look like?
• Bone marrow hematopoietic cells Have
known surface markers (CD34), small and
spherical. High nuclear to cytoplasmic
ratio. 1/100000. Rarely divide.
11
Provenienza e tipi di cellule staminali adulte del midollo osseo.
What is new: IPSC
•
Differentiated cells can be reprogrammed to an embryonic-like state by
transfer of nuclear contents into oocytes or by fusion with embryonic stem
(ES) cells. Little is known about factors that induce this reprogramming.
Here, we demonstrate induction of pluripotent stem cells from mouse
embryonic or adult fibroblasts by introducing four factors, Oct3/4, Sox2, cMyc, and Klf4, under ES cell culture conditions. Unexpectedly, Nanog was
dispensable. These cells, which we designated iPS (induced pluripotent
stem) cells, exhibit the morphology and growth properties of ES cells and
express ES cell marker genes. Subcutaneous transplantation of iPS cells
into nude mice resulted in tumors containing a variety of tissues from all
three germ layers. Following injection into blastocysts, iPS cells contributed
to mouse embryonic development. These data demonstrate that pluripotent
stem cells can be directly generated from fibroblast cultures by the addition
of only a few defined factors.
•
Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult
fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006
12
STEM CELL: debate, neural stem cells and
plasticity.
Only cells of the hemopoietic system
Plasticity: eg hematopoietic SCs
Skin, liver etc
Plasticità e Transdifferenziamento
• Transdifferenziamento: è un processo biologico definito come
l’abilità di c. Staminali di attraversare barrriere definite dalle mappe
embrionali (lineage barriers) e adottare profili di espressione e
fenotipo funzionale diverse.
• Abbastanza dibattuto anche adesso..
• Pero, è compatibile con l’ipotesi che stemness è uno stato anziche
un specifico tipo di cellula.
• Lo stemness infatti puo essere indotta se alle cellule viene fornito
l’ambiente giusto.
• Sembre che sia piu le proprietà della nicchia (eg nicchia nel midollo)
che mantengono stemness e determinano la linea che adottano.
• Zipori, D. (2005) The stem cell state: plasticity is essential, whereas
• self-renewal and hierarchy are optional. Stem Cells 23, 719–726.
• La maggiore parte degli exp sono stati fatti su non mamifferi e topi
nudi. Si va a indurre stati non fisiologici
13
1992
2001
Si chiama “crossing over of lineages”
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Cellule Staminali Embrioniche
Celluel Staminali Pluripontenti sono state isolate da embrioni umane (cliniche IVF).
Sono in grado di produrre cellule differenziate.
Cellule Pluripotenti sono state derivate da feti abortiti
La clonazione Riproduttiva
SCNT- Somatic cell nuclear transfer o come hanno fatto Dolly
(somatic cell nuclear transfer (SCNT) )
An animal egg cell is isolated, and its nucleus is removed. What remains is the
environment necessary to develop an embryo. Then, a somatic cell (just means a
diploid cell which is not an egg or sperm) is placed near the eggs cell, and the 2
cells fuse together. The resulting fused cell has the potential to from an entire
organism, so it is TOTIPOTENT. When placed in a uterus, it can develop into a
complete organism which has the same genes as the somatic cell.
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Prime fasi dell’embriogenesi. La
cellula ibrida va messa nel punto
giusto del ciclo di ovulazione
Questa tecnica era conosciuta da anni. Si usava tecniche molto invasive per
togliere il nulceo dall’uovo e sostiturelo con il nulceo somatico
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Dolly invece è stata il primo mammifero (1997, Wilmut et al). Dolly è morta
prematuramente nel 2003. Dopo questo sono stati clonati i topi, i ratti, le capre, le
mucche e i maiali. Nella clonazione riproduttiva, si tratta di creare un nuovo animale
partendo dal nucleo di un donatore. a) l’efficienza di questo processo è inferiore
all’1%, cioè bisogna produrre più di 100 embrioni per averne uno che nasca quindi
economicamente sarebbe un disastro e b) questi animali hanno spesso malformazioni
e problemi che ne compromettono la salute.
Nella grande maggioranza dei casi gli animali che sopravvivono alla gravidanza,
hanno gravi malformazioni: i feti sono più grandi, hanno dei problemi soprattutto
cardiaci, renali ed osteo-articolari che ne compromettono la longevità.
La clonazione riproduttiva UMANA è vietata in quasi tutti i paesi.
La
clonazione
riproduttiva
UMANA è
vietata in
quasi tutti i
paesi.
?
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Dolly: before the creation of Dolly, researchers had been unable to perform
SCNT in mammals, although the technique was used for cloning insects and
amphibians. What was the break through? How was the egg deprived of the
nucleus and then bequeathed with a different nucleus.
Why do they say Dolly was old?
Telomers were 80% shorter.
Everytime DNA is replicated, its length is shortend by about 50-200
bp.(why?) (mechanism underlying the Hayflick limit)
Germ cells (and cancer cells and some stem cells) have an enzyme called
telomerase which rebuilds telomers.
Clonazione terapeutica
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Clonazione terapeutica: la creazione di
popolazioni di cellule staminali pluripotenti e
multipotenti
•
•
•
•
•
•
•
•
si isolano cellule somatiche dal paziente
si preleva il nucleo da una cellula somatica(si fa a mano sotto microscopio)
il nucleo viene inserito in una cellula uovo enucleata si ha così la formazione di una
cellula pre-embrionale contenente solo il DNA del paziente (sempre a mano)
si interrompe la crescita al livello di blastocisti
si isolano e coltivano le cellule staminali
si utilizzano queste cellule per ricreare tessuti totalmente compatibili con il ricevente
Cellule molto sensibile ad ogni stimolo esterno: durante la fase espansiva vi è il
rischio di differenziazione cellulare, difficoltà nel trasporto delle cellule nel tessuto da
trattare (solo per il sangue risulta semplice) e inoltre quando impiantate, le cellule
staminali entrano in competizione per lo spazio a disposizione con le cellule residenti
nel tessuto; vi è inoltre il rischio che non differenzino nelle cellule desiderate, spesso
infatti tendono a dare origine a fibroblasti. Inoltre c’è un po di DNA nei mitocondri che
non viene trasferita. Nella maggiore parte dei casi il DNA diventa caotico.
Al momentonon è una prospettiva immediata della clinica di nessun paese, ma in
molti paesi si studiano in modo molto intenso queste cellule per capire se funzionano,
se si possono prevenire i tumori, e in quali tessuti possono essere fatte differenziare.
Prime fasi dell’embriogenesi. Intorno al 6-7 giorno si forma la blastocisti
dalla quale nascono i tre foglietti embrionali (mesoderma, ectoderma e
endoderma) dai quali si sviluppano tutti i tessuti che compongono un
organismo adulto.
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In Europe there are many differences in cloning laws.
In the UK: experiments on embryos less than 14 days old are allowed.
SCNT is legal for research.
The rest of Europe has signed an agreement which bans the use of embryos
for research. But France, Germany and the UK have not signed as yet.
Cloning is permitted in France for therapeutic purposes. However recently
the EC decided that research can be carried out as long as no human
embryos are destroyed. This is open to interpretation.
Until 2001, in the US government funds could not be used for research on
human embryos (Now some lines are available). However private
institutions could carry out unrestricted research. Now HES research os
funded by the NIH
As far as the rest of the world is concerned, it is difficult to know what
happens in laboratories….Even in many developed countries there are no
laws (Israel, India). There is a UN proposal banning human cloning (no
one signed it).
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I problemi
•
•
•
•
Etici
Source
Mantenere stemness
Controllare differenziamento
POI C’E TEMPO
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Gli stimoli
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Cose la differenza tra clonazione riproduttiva, terapia con
la HES, e clonazione terapeutica?
Cose una nicchia staminale e quali sono le caratteristiche della nicchia?
Le MSC
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