Diapositiva 1 - Università degli Studi Mediterranea

Corso di Formazione Interna
Università Mediterranea di Reggio Calabria
“TECNICHE DI ANALISI STRUMENTALE E STATISTICHE”
Docente: Dott. Agostino Sorgonà
Dipartimento di Biotecnologie per il
Monitoraggio Agroalimentare ed Ambientale
(BIO.M.A.A.)
0965801266 (ufficio)
0965801223 (lab)
[email protected]
…. ben ritornati!
GRAZIE!
MERCOLEDI’ 30 GENNAIO ORE 8:30
AULA M – Laboratorio di Agrochimica ed Agrobiologia
Facoltà di Agraria
ACIDI NUCLEICI
Lezione frontale (1 ora)
Esercitazioni da laboratorio (3 ore): Estrazione e
purificazione, analisi spettrofotometrica, reazione
a catena della polimerasi (PCR), elettroforesi su
gel di agarosio.
MERCOLEDI’ 6 FEBBRAIO ORE 9:30
AULA M – Laboratorio di Agrochimica ed Agrobiologia
Facoltà di Agraria
ANALISI D’IMMAGINE
Lezione frontale (1 ora)
Esercitazioni da laboratorio (1 ora): analisi
morfologica ed architettonica dell’apparato radicale
mediante il sistema informatico WinRhizo.
VENERDI’ 8 FEBBRAIO 8:30
AULA M – Laboratorio di Agrochimica ed Agrobiologia
Facoltà di Agraria
LA FOTOSINTESI E LA RESPIRAZIONE
Lezione frontale (1 ora)
Esercitazioni da laboratorio (3 ore): misurazione della
respirazione del suolo mediante il sistema LiCOR.
VENERDI’ 22 FEBBRAIO ORE 9:00
AULA M – Laboratorio di Agrochimica ed Agrobiologia
Facoltà di Agraria
METODOLOGIE STATISTICHE
Lezione frontale (1 ora): Disegno sperimentale,
ANOVA, test post-hoc, Regressione lineare e
correlazione, Regressione non lineare
Esercitazioni da laboratorio (2 ore): utilizzo di
alcuni software di statistica ed approfondimento su
articoli scientifici.
MARTEDI’ 26 FEBBRAIO ORE 8:30
AULA M – Laboratorio di Agrochimica ed Agrobiologia
Facoltà di Agraria
MICROSCOPIA
Lezione frontale: (1 ora)
Esercitazioni da laboratorio (3 ore): dal
microscopio ottico a quello a fluorescenza
VENERDI’ 29 FEBBRAIO ORE 9:00
AULA M – Laboratorio di Agrochimica ed Agrobiologia
Facoltà di Agraria
VERIFICA FINALE CON TEST A RISPOSTA MULTIPLA
(3 ore)
IL LABORATORIO DI BIOLOGIA MOLECOLARE:
TECNICHE DI BASE ED APPLICAZIONI
Che cosa è il DNA o il RNA?
Che cosa è il gene o l’espressione genica?
Quali campi scientifici sono interessati a queste molecole o
strutture funzionali cellulari o processi biologici?
Quali sono le tecniche per la loro quantificazione?
La biologia molecolare
La biologia molecolare studia i meccanismi molecolari
che sottintendono i processi biochimici, fisiologici e
morfologici degli esseri viventi.
Quali sono i meccanismi molecolari?
Le interazioni tra le macromolecole quali le
proteine e gli acidi nucleici (DNA e RNA)
DNA
RNA
PROTEINA
Le tecniche e le nozioni della biologia molecolare
Obiettivi
genetica
biologia
la genetica classica
si occupa di come i
caratteri sono
ereditati nelle
progenie; la biologia
molecolare, invece,
studia l’ereditarietà
dei caratteri a
livello molecolare,
cioè di DNA
l’evoluzionistica filogenetica
Confrontando il patrimonio
genetico di individui differenti
attraverso le tecniche di
biologia molecolare, si possono
determinare le relazioni
ancestrali fra specie note
(filogenetica) oppure il
cambiamento di tale patrimonio
(evoluzionistica).
GLI ACIDI NUCLEICI: IL DNA E IL RNA
Gli acidi nucleici sono dei composti (acidi) presenti
nel nucleo della cellula o comunque lì prodotti
macromolecole polimeriche lineari
Macromolecole: struttura abbastanza grande
DNA
Ogni filamento
può contenere
diversi milioni
di nucleotidi. Ad
esempio, il più
grande cromosoma
umano (il
cromosoma 1)
contiene quasi
250 milioni di
paia di basi
Struttura RNA
Polimeriche: costituite da più unità (monomeri)
chiamate nucleotidi
Nucleotide
Lineari: i nucleotidi si legano secondo una linea e
non formano delle ramificazioni.
La struttura basilare degli acidi nucleici è
il nucleotide.
Nucleotide = base azotata +
zucchero pentoso + gruppo
fosfato
Nucleoside = zucchero + base azotata
Struttura del DNA
Zucchero del DNA è il
deossiribosio;
le basi azotate sono Adenina
(A)
Guanina (G)
Citosina (C)
Timina (T).
scheletro laterale
determinato da legami
fosfodiesterici tra il
gruppo fosfato di un
nucleotide ed il carbonio
in posizione 5’ dello
zucchero del successivo
nucleotide. Il gruppo
fosfato fa da ponte per il
legame del carbonio 3’
dello zucchero di un
nucleotide con quello 5’
del nucleotide successivo
ogni filamento di DNA ha un senso:
estremità 5’ se si inizia con il
legame del carbonio in posizione 5’
viceversa, si definisce estremità 3’
se il filamento inizia con il
carbonio 3’..
La parte interna presenta la base
azotata legata allo zucchero
Doppio filamento o doppia elica:
associazione tra i due filamenti
mediante legami ad idrogeno tra le due
basi opposte
↓
Appaiamento delle basi dove l’Adenina
(composto purinico) può legare
solamente la Tiamina (composti
pirimidinico), così come la Guanina
lega solamente la Citosina.
Doppia elica che, con l’avvitarsi su sé stessi dei due
filamenti, restano esposti dei solchi definiti maggiore e
minore.
Funzioni biologiche del DNA
L’acido deosirbunucleico (DNA) contiene le informazioni
genetiche necessarie alla biosintesi di RNA e proteine,
molecole indispensabili per lo sviluppo ed il corretto
funzionamento della maggior parte degli organismi viventi.
come l’informazione genetica è contenuta nel DNA?
come questa viene tradotta materialmente in proteine?
Il DNA è solitamente
presente all'interno di
cromosomi lineari
(circolari nei
procarioti) che sono
presenti nel nucleo
cellulare
La somma di tutti i cromosomi di una cellula
costituisce il genoma che è l’insieme dei geni di un
organismo e pertanto viene anche definito patrimonio
genetico
Il genoma umano è costituito da 46 cromosomi e da circa 3 miliardi
di paia di basi.
Organismo
Numero
di cromosomi
Numero di copie
di cromosomi
Tipo
Dimensione (Mbps)
Mycoplasma genitalium
1
1
circolare
0,58
Escherichia coli K12
1
1
circolare
4,6
Agrobacterium tumefaciens
4
1
3 circolari
1 lineare
5,67
Sinorizhobium melioti
3
1
circolare
6,7
Saccharomyces cerevisiae
16
1o2
lineare
12,1
Schizosaccharomyces pombe
3
1o2
lineare
12,5
Caenorhabditis elegans
6
2
lineare
97
Drosophila melanogaster
4
2
lineare
180
Tetrahymena termophila
m: 5
M: 225
m: 2
M: 10-10000
lineare
220 (M)
Fugu rubripes
22
2
lineare
365
Mus musculus
19+X+Y
2
lineare
2500
Homo sapiens
22+(X o Y)
2
lineare
2900
Perché il DNA contiene l’informazione genetica?
E che cos’è l’informazione genetica?
L’informazione genetica è scritta
nella catena del DNA secondo un
codice detto Codice Genetico che
mette in corrispondenza le basi
azotate con gli aminoacidi (unità
strutturali delle proteine).
Ciascuna parola del codice
è costituita da una serie
di tre basi, detta codone
che indica agli organi
effettori (RNA e ribosomi)
di prelevare un
determinato amminoacido e
di legarlo alla catena
polipeptidica della
proteina costituenda
Utilizzando gruppi di tre lettere si possono avere
fino a 64 combinazioni diverse (43), in grado di
codificare per i venti diversi amminoacidi esistenti
La timina ripetuta in una serie di tre (TTT) rappresenta in
particolare l'amminoacido fenilalanina
64 triplette
20 Aminoacidi
Il codice genetico è detto ridondante (o
degenere): alcuni amminoacidi possono infatti
essere codificati da più triplette diverse.
Esistono infine tre triplette che non codificano per
amminoacidi ma per codoni di stop (o nonsense), ovvero
indicano il punto in cui in un gene termina la parte che
codifica per la proteina corrispondente: si tratta di TAA,
TGA e TAG.
Che cos’è un gene?
Il gene è l’unità ereditaria degli organismi viventi
Strutturalmente, i geni sono sequenze di DNA che
codificano per una proteina
1. Gli esoni sono la sequenza di
DNA che poi viene tradotta in
proteina;
2. gli introni sono delle
sequenze che spaziano gli
esoni e che non vengono
tradotte o meglio vengono
eliminate attraverso la
maturazione del RNA;
3. i promotori e i terminatori
sono regioni del gene che
regolano l’espressione genica.
Struttura del RNA
L'acido ribonucleico (RNA o ARN) è un polimero
organico, risultante dalla polimerizzazione di
ribonucleotidi.
Le molecole di RNA differiscono da quelle di DNA perché:
1. contengono lo zucchero ribosio (con un gruppo OH legato
al carbonio 2') anziché il deossiribosio (da qui il nome)
2. una delle basi, la timina, è sostituita dall'Uracile
(U). In questo caso è l'uracile a legarsi all'adenina,
mentre la guanina si lega sempre alla citosina;
3. sono di solito a singolo filamento, anziché a filamento
doppio.
L'RNA messaggero
(noto con
l'abbreviazione di
mRNA o con il
termine più
generico di
trascritto) è un
tipo di RNA che
codifica e porta
informazioni
durante la
trascrizione dal
DNA ai siti della
sintesi proteica,
per essere
sottoposto alla
traduzione
1. un cappuccio 5’ (nucleotide guaninico
metilato in posizione 7) che è importante per il
riconoscimento e l'aggancio appropriato
dell'mRNA al ribosoma;
2. Regioni codificanti che sono composte da codoni
che vengono decodificati e tradotti in proteine
dai ribosomi. Le regioni codificanti cominciano
con un codone di inizio e terminano con tre
possibili codoni di stop;
3. Regioni non codificanti che sono posizionate
prima del codone d'inizio (3' UTR, untranslated
region) e dopo il codone di stop (5' UTR,
untranslated region) e non sono tradotte in
proteine. La loro funzione è quella di
stabilizzare e di localizzare il mRNA e di rendere
più efficiente il processo di traduzione.
L'RNA transfer (o
RNA di
trasporto),
abbreviato in
tRNA, è una
piccola catena di
RNA (di 74-93
nucleotidi) che
trasferisce un
amminoacido
specifico ad una
catena
polipeptidica in
crescita al sito
ribosomiale della
sintesi proteica
durante la
traduzione.
La struttura secondaria o a
trifoglio del tRNA:
1. braccio accettore
chiamato anche braccio
amminoacidico che ha la
funzione di attacco
dell’aminoacido;
2. un trinucleotide molto
conservato dalla sequenza
CCA (detta anche coda CCA)
presente alla terminazione
3' del braccio, che è
importante per il
riconoscimento dei tRNA
durante la traduzione;
3. braccio D che è una
regione contenente un loop
4. braccio A o
braccio
dell'anticodone che
è composto da 5 paia
di basi e termina in
un loop contenente
l'anticodone;
5. braccio T,
composto da 5 paia
di basi, contiene
una sequenza molto
conservata TTC
L’anticodone è
costituito da tre
nucleotidi che
corrispondono alle tre
basi del codone letto
dal mRNA. Quindi, ogni
specifico anticodone di
tRNA contiene una
sequenza (tripletta)
che può appaiarsi ad
uno o più codoni per
uno stesso amminoacido.
Ad esempio,
consideriamo il tRNA
della fenilalanina il
cui anticodone è AAG
questo si appaia con il
codone della
fenilalanina che è TTC
L'RNA ribosomiale (o RNA
ribosomale, abbreviato
come rRNA) è il tipo di
RNA più abbondante
presente nella cellula.
Non codifica direttamente
le proteine, ma è il
componente essenziale
(circa i due terzi) dei
ribosomi, macchine
catalitiche che
provvedono
all'assemblaggio delle
proteine, presenti in
tutte le cellule viventi.
Il dogma centrale della biologia
“Il flusso dell'informazione genetica è monodirezionale
e parte dagli acidi nucleici ed arriva alla formazione
delle proteine” (Crick, 1957)
1. l'informazione genetica è conservata nel DNA;
2. l'informazione genetica viene trascritta sotto forma di
RNA (processo di trascrizione);
3. l'informazione genetica viene successivamente tradotta
a proteine, la forma "operativa" dell'informazione
contenuta nel genoma (processo di traduzione).
Il dogma centrale costituisce il meccanismo di base
dell'espressione dei geni
Il processo di trascrizione
Il processo di
trascrizione è quello
mediante il quale le
informazioni
(sequenza delle basi)
contenute nel DNA
vengono trascritte
enzimaticamente
(grazie alle RNA
polimerasi) in una
molecola
complementare di RNA
(mRNA).
RNA polimerasi
mRNA
DNA
La trascrizione procede
in direzione 5' → 3'.
Più precisamente, il
filamento lungo il quale
il DNA viene scansìto,
detto filamento stampo,
è percorso dall'enzima
RNA polimerasi in
direzione 3' → 5'.
Operativamente, viene
costruito un filamento di
mRNA con delle basi
azotate complementari a
quelle del DNA
1a fase
riconoscimento del
promotore da parte
proteina TBP
della proteina TBP
(TATA Binding
Protein) che ha la
funzione di
produrre due forti
piegature al DNA (o
kink) a livello
della sequenza TATA
che inducono in
questo punto un
angolo di circa 90°
DNA
2a fase
pulizia del promotore
(eliminazione dei
fattori che legavano il
promotore)
3a fase
Allungamento (aggiunta
di ribonucleotidi con
codoni complementari al
filamento stampo del
DNA)
4a fase
Infine, la trascrizione
si conclude con il
processo di terminazione
La retrotrascrizione (o trascrizione inversa) è la
capacità da parte di particolari enzimi di sintetizzare
una molecola di DNA a partire da RNA.
L'enzima responsabile di questo processo è la
Trascrittasi inversa, e deve il nome proprio al fatto
che è in grado di compiere il passaggio inverso
rispetto agli altri enzimi responsabili della
trascrizione, che cioè sintetizzano RNA a partire da
DNA
La retrotrascrizione è utilizzata in esperimenti di ingegneria
genetica dove a partire da mRNA purificato si sintetizza del DNA
complementare (cDNA), normalmente privo di introni che può venire
utilizzato per il clonaggio e la manipolazione del gene
corrispondente
Il processo di traduzione
La traduzione o detta anche sintesi proteica è un
meccanismo attraverso il quale il filamento mRNA, dopo
essere stato trascritto, viene "letto" dalle unità di
rRNA e tradotto in proteine
1a fase
L'inizio della sintesi
tRNA
avviene grazie al legame
tra i ribosomi con il
codone di avvio (start)
dell'mRNA, che indica il
punto in cui inizia la
codificazione della
proteina. Questo codone
negli eucarioti è
generalmente AUG (adenina-
mRNA
uracile-guanina) a cui
corrisponde l'amminoacido
metionina. La subunità
ribosomiale che si lega al
mRNA è quella superiore
Ribosoma
2a fase
A questo punto entra in
gioco il tRNA iniziatore
che accoppia le sue basi
con quelle del codone di
avvio e si lega al sito
P del ribosoma (sito
posto nella subunità
inferiore). La sub-unità
maggiore forma quindi un
complesso con quella
minore.
3a fase
Successivamente avviene la
cosiddetta fase di
allungamento. Un nuovo
tRNA entra sul sito A
(posto nella subunità
inferiore) del ribosoma ed
accoppia le sue basi con
quelle dell'mRNA
4a fase
L'enzima peptidil
transferasi crea un legame
peptidico tra gli
amminoacidi vicini.
Quindi, l'amminoacido sul
sito P si stacca dal suo
tRNA.
Il ribosoma si muove lungo
l'mRNA spostando il tRNA dal
sito A al sito P liberando
nel contempo il tRNA vuoto.
Questo processo è noto come
traslocazione.
5a fase
Questo processo continua finché il ribosoma non incontra uno
dei tre possibili codoni di arresto (stop), che sono UAG,
UAA, UGA. Questa è la fase di terminazione. La crescita della
proteina si interrompe ed i fattori di rilascio, proteine che
simulano l'azione del tRNA, si legano al sito A e liberano la
proteina nel citoplasma
Il DNA nell’ingegneria genetica
Organismi geneticamente modificati (OGM): sequenze di DNA
(geni) interessanti possono essere inseriti all'interno del
loro genoma.
In questo caso si parla di DNA ricombinante cioè di segmenti
di DNA realizzati e assemblati artificialmente.
Agricoltura
Batteri
batteri
che
introdotti
nel
suolo
ne
migliorano
le
caratteristiche (es.
batteri
azotofissatori)
o
proteggono
le
piante dal gelo
(batteri ice-minus)
Alimentazione
Medicina
Industria
produzione di
sostanze
medicinali come
l'insulina
biorimedi (es.
batteri
che
degradano
idrocarburi)
Agricoltura
Miceti
Alimentazione
1. produzione di produzione di
enzimi
usati biomedicine
nell'industria
alimentare,
2. miglioramento
dei processi di
fermentazione (es.
produzione della
birra)
Medicina
Industria
Agricoltura
Piante
Alimentazione
Medicina
Industria
1. miglioramento
1. miglioramento delle
delle caratteristiche
pratiche agronomiche:
richieste a livello
es. piante tolleranti allo
industriale delle
stress idrico o salino,
produzione di
materie prime (es.
colture tolleranti a
farmaci/composti in
pioppo con un
specifici erbicidi
pianta (molecular
miglioramenti nelle
tasso di lignite
2. introduzione di
qualità nutrizionali farming): produzione a
inferiore per
caratteri di resistenza
basso costo di
e organolettiche: es.
facilitare il processo
specifica: es. piante
sostanze
riso ad elevato
di fabbricazione
resistenti agli insetti o ai
farmaceutiche e
contenuto in betadella pasta da carta)
virus
chimiche, riduzione
carotene,
2. fitodepurazione
3. produzione di
degli scarti chimici
pomodoro a
(es. piante capaci di
energia: varietà con più
industriali (es.
maturazione
estrarre metalli
elevato potere calorico
vaccino contro
quali oro, rame e
rallentata
e minori richieste di
l'epatite, produzione
uranio, piante in
input chimici utilizzabili
di amilasi).
grado di degradare
anche su aree marginali
il tritolo o di
segnalare la
presenza di
radiazioni)
Agricoltura
Animali
Alimentazione
Medicina
produzioni
animali
con
migliori
caratteristiche
nutrizionali o
organolettiche:
es. latte con
più
alto
contenuto in
caseina, latte
senza lattosio
1. produzione di
biomedicine
2. modelli per la
ricerca
su
malattie umane
(es. l'oncotopo)
3.
animali
donatori
di
organi
per
xenotrapianti
Industria
Il DNA nella medicina forense
La medicina forense si serve del DNA
presente nel sangue, nella pelle,
nella saliva, nei capelli e in altri
tessuti e fluidi biologici per
identificare il responsabile di un
delitto.
Il processo mediante cui è possibile
realizzare ciò è il fingerprinting
genetico: tale tecnica consiste nel
comparare la lunghezza delle sezioni
variabili del DNA ripetitivo che
possono risultare molto diverse tra
i diversi individui.
Il DNA nella bioinformatica
La bioinformatica è una branca della biologia che
comprende la manipolazione, la ricerca dei dati
relativi a sequenze di DNA.
L’obiettivo della bioinformatica è quello di risolvere
problemi biologici con metodi informatici.
Gli algoritmi di ricerca (o appaiamento) di
stringhe sono in grado di individuare la presenza
di una sequenza di lettere all'interno di sequenze
molto più ampie quali quelle presenti nel DNA.
Identificano le sequenze omologhe ed individuano le
specifiche mutazioni che le rendono differenti.
Queste tecniche sono utilizzate per studiare le
relazioni filogenetiche e la funzione delle
proteine.
Il DNA nella storia ed antropologia
Grazie alla proprietà del DNA di subire delle mutazioni che a
loro volta vengono ereditate, esso contiene informazioni
preziose che possono essere utilizzate dai genetisti per
studiare l'evoluzione degli organismi e la loro filogenesi
L’espressione genica
L’espressione genica è quel processo attraverso il
quale l'informazione contenuta in un gene viene
convertita in una macromolecola funzionale,
tipicamente una proteina.
La regolazione dell'espressione genica è fondamentale per la
cellula, perché le permette di controllare le proprie
funzioni interne ed esterne, come la differenziazione
cellulare, la morfogenesi o i vari processi di adattamento
alle necessità dell'organismo.
Come si misura l’espressione genica?
E soprattutto che cosa si misura?
Misura del trascrittoma
Trascrittoma: insieme di tutti i trascritti (mRNA) di
un dato organismo o tipo cellulare
La quantità di
mRNA è un dato di
notevole
interesse nella
misura
dell'espressione
genica.
siRNA, piccole
molecole di RNA
in grado di
portare alla
degradazione del
trascritto
Northern blot: processo attraverso il quale un estratto
di RNA proveniente dal sistema biologico da analizzare
viene dapprima separato in un gel di agarosio, quindi
ibridato con una sonda radioattiva (sequenza di DNA
complementare all'RNA da identificare, marcata con un
isotopo radioattivo quale
32P)
complementare al solo RNA
di interesse.
Il Northern blot è una tecnica utilizzata sempre
più raramente, a causa delle problematiche
correlate all'uso di reagenti radioattivi e della
scarsa sensibilità nella quantizzazione.
Real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) o
la reverse transcriptase-polymerase chain reaction
(RT-PCR): permettono di quantificare la presenza di
un determinato trascritto anche in pochi nanolitri di
estratto cellulare
Costi per gli strumenti ed i
reagenti sono proibitivi
DNA microarray: fornisce un'analisi contemporanea di
migliaia di differenti mRNA attraverso l'utilizzo di
supporti che contengono migliaia di sonde di DNA
complementari ai trascritti della cellula
Misura del proteoma
Il proteoma indica l’insieme di proteine presenti in
un organismo o le proteine prodotte da un genoma
Western blot attraverso il quale, in seguito alla
separazione su un gel di poliacrilammide delle
proteine contenute in un estratto cellulare, è
possibile individuare e quantificare una singola
proteina attraverso l'uso di un anticorpo specifico.
Tale anticorpo, infatti, può essere legato da un
altro anticorpo (detto secondario) a cui è coniugato
un sistema di rivelazione quale un fluorocromo che
permetta la quantificazione.
Per quantizzare una particolare proteina si può
fondere il gene che codifica per tale prodotto
proteico con un gene reporter, come la Green
Fluorescent Protein (marcatore nelle indagini di
identificazione e localizzazione subcellulare delle
proteine), che può essere agevolmente visualizzata
attraverso un microscopio a fluorescenza.
Immagine confocale di cellule di guardia di
Arabidopsis con GFP (verde) e cloroplasti (rossi)
Tecniche di base e applicazioni
GENOMICA
PROTEOMICA
Dna
Rna
Proteina
ESTRAZIONE DEL DNA
1a FASE
Lisi: rialascio di DNA solubile ad alto peso molecolare da parte delle cellule con parete e
membrane dannegiate;
2a FASE
Estrazione: dissociazione dei complessi DNA-PROTEINE (denaturazione e/o proteolisi);
3a FASE
Purificazione: separazione del DNA dalle altre MACROMOLECOLE (proteine,
polissacaridi, ecc.)
Fortemente dipendente dal materiale Biologico di partenza
Batteri
Lieviti
Tessuti animali
Tessuti vegetali
ESTRAZIONE DEL DNA
LISI CELLULARE
Si utilizzano tamponi contenenti SDS o CTAB; Tris –HCL; EDTA; Proteinasi K.
Con aggiunta di agenti denaturanti per le proteine come la guanidina idrocloride.
Durata: dai 30 minuti alle 3 ore (a seconda del tipo di matrice utilizzato) alla temperatura di 6065°C, in costante agitazione.
ESTRAZIONE
Aggiunta di cloroformio o fenolo alla fase acquosa del lisato (quest’azione provoca la
denaturazione delle proteine).
PURIFICAZIONE
Aggiunta di isopropanolo alla fase acquosa ottenuta dopo il passaggio in cloroformio o fenolo.
Questo passaggio provoca la precipitazione del DNA sul fondo della provetta.
LAVAGGIO
Aggiuta di etanolo 75% al pellet (DNA puro).
Aggiunta di acqua sterile (40-60 µl).
PREPARAZIONE DI DNA BATTERICO
ESTRAZIONE
- Centrifugazione della coltura in
sospensione
-Risospensione delle cellule in
tampone contenente Rnase
- Rottura della parete
peptidoglicanica mediante lisi
alcalina o enzimatica (NaOH o
Lisozima) in presenza di guanidio
isotiocianato
- Centrifugazione e recupero del
sopranatante contenente l’estratto
cellulare
PREPARAZIONE DI DNA BATTERICO
PURIFICAZIONE
Cromosoma
batterico
DNA Cromosomico
Plasmidi
DNA Plasmidico
VALUTAZIONE QUANTITATIVA E QUALITATIVA DEL DNA
METODO SPETTROFOTOMETRICO
METODO ELETTROFORETICO
Conoscere la concentrazione del Dna
Verificare il suo grado di purezza
QUANTIZZAZIONE SPETTROFOTOMETRICA DEL DNA
CENNI TEORICI
• Metodo spettroscopico
• Specifica λ per ogni sostanza
• Utilizza la legge di Lambert e Beer
• T= I0/I1
• OD= -log 1/T
• OD= l•ke•C
• In una cuvetta di quarzo porre 1ml di acqua (bianco) e
azzerare lo strumento.
• Preparare una cuvetta di quarzo contenente 698ul di H20 e
qaggiungere 2ul della soluzione di DNA (diluizione 1:350).
• Coprire con parafilm e miscelare capovolgendo
delicatamente la cuvetta.
• Introdurre la cuvetta nello spettrofotometro e leggere
l'assorbanza (A) a 260 nm.
• Tornare sul bianco spostare la lunghezza d'onda a 280nm.
Azzerare lo strumento.
• Passare al campio e leggere l'A280.
• Coi risultati ottenuti, calcolare la concentrazione di DNA
sapendo che in una cuvetta con un cammino di 1 cm, il DNA
a doppio filamento alla concentrazione di 50ug/ml ha un
assorbimento di 1 a 260nm:
Concentrazione DNA /ug/ml)= A260nm x 50/ 1 unita’ di
assorbanza
Calcolare il rapporto delle letture a 260nm e 280nm. Tale
rapporto dovrebbe essere >= 1.7 per una preparazione pura
di DNA. Se il rapporto è < di 1.7 significa che è presente una
contaminazione da parte delle proteine.
POLYMERASE CHAIN REACTION:
CHE COSA E’ LA PCR?
La PCR (Polymerase Chain Reaction)
è un metodo attraverso cui una
sequenza di acido nucleico più essere
amplificata esponenzialmente in vitro.
Lo stesso metodo può essere usato per
modificare la sequenza amplificata o
per aggiungerle nuova informazione di
sequenza. Requisito fondamentale e’
che le estremità della sequenza da
amplificare siano conosciute con
sufficiente precisione
per poter
sintetizzare degli oligoprimers che
fungano da innesco per la reazione di
amplificazione
ELEMENTI NECESSARI ALLA REAZIONE:
1- DUE OLIGONUCLEOTIDI COMPLEMENTARI
A DUE REGIONI SITUATE SU FILAMENTI
OPPOSTI DEL DNA STAMPO AI LATI DELLA
REGIONE CHE SI VUOLE AMPLIFICARE
2- DNA STAMPO CHE CONTENGA LA REGIONE
DA AMPLIFICARE
3- POLIMERASI TERMOSTABILE (NON VIENE
DENATURATA SE PORTATA A 95° C)
4- I 4 DESOSSIRIBONUCLEOSIDI TRIFOSFATI
PROCESSO DI PCR PREVEDE UN CERTO NUMERO
DI CICLI. OGNI CICLO CONSISTE DI 3 PASSAGGI:
1- DENATURAZIONE: TEMP. 94°C. IL DNA STAMPO
VIENE DENATURATO
2-APPAIAMENTO: TEMP. 50-60°C . I PRIMERS SI
APPAIANO CON IL DNA STAMPO
3- SINTESI: TEMP.72°C E’ OTTIMALE PER IL
FUNZIONAMENTO DELLA Taq (Termus aquaticus)
POLIMERASI
5’
3’
-3’
5’
5’
-3’
Denaturazione
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
3’
Annealing
5’
5’
5’
-3’
3’
-3’
Estensione
5’
POLYMERASE CHAIN REACTION:
COMPONENTI DELLA REAZIONE DI PCR
• Dna Genomico, plasmidico, fagico (100-200 ng)
• Primers di innesco (02-05 µM) Ó
• dNTP (150-250 µM)
• Tampone di reazione (50mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.3, 1.5mM
Mg(Oac)2
• Dna polimerasi (Taq, Pfu, 5U/100 µl reazione) Ó
• Additivi (DMSO, glicerolo, Formamide BSA)
POLYMERASE CHAIN REACTION:
Criteri di scelta e ottimizzazione dei singoli componenti
PRIMERS
A) Complementarieta’ con le sequenze che precedono e seguono il
frammento da amplificare
5’
3’
3’
5’
B) Lunghezza del primer: Tale parametro influisce sia sulla temperatura
di annealing sia sulla specificita’. Il valore ottimale e’ compreso tra 18 -24
bps
C) Assenza di autocomplementarieta’
5'-CG ATA GTG G G ATCTA G ATCC C-3'
3'-CCCTAG ATCTAG G G TGATACG-5'
D) Temperatura di melting:
Temperatura alla quale la meta’ di una popolazione di molecole di Dna
si trova ancora nello stato di doppia elica
Esprime una misura della stabilita’ tra Dna templato e primer
La Tm di un ibrido in soluzione dipende dalla concentrazione
salina, dalla composizione in basi e dalla presenza di agenti
denaturanti. Gli effetti di questi parametri sono combinati in
un’unica equazione [Mienkoth e Wahl, 1984]:
Tm = 81,5 +16,6 (log M) + 0,41 (% G+C) - 0,61 (% form) dove M è la molarità dei cationi monovalenti, (% G+C) è la
percentuale di guanine e citosine nel DNA, (% form) è la
percentuale di formammide nella soluzione.
La formula empirica che nell’uso pratico viene adottata e’:
Tm = 2 (A+T) + 4 (G+C)
E) Contenuto in GC e AT: compreso tra 50 e 45 % e le basi devono essere
distribuite in modo uniforme
Importante perche’ determina non solo la Tm ma anche la possibilita’ di
annealing aspecifico e la formazione di bolle interne al primer (hairpin
loops) che ne danneggiano la capacita’ di annealing
ATCGTAGTAGG TACT
C -G
G-C
SOFTWARE E PROGRAMMI PER LA GESTIONE DELLA
SCELTA DEI PRIMERS
•UniStS
•Blast
•Genome
Primer 3
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=unists
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast
/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=genome
http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi
POLYMERASE CHAIN REACTION:
Protocollo di partenza
LAVORANDO IN GHIACCIO:
•Preparare una diluizione del Dna da amplificare alla concentrazione di 100ng/µl
• Preparare un numero di microtubi pari al numero dei campioni da analizzare piu’
un tubo per il controllo di contaminazione
• Dispensare in ogni tubo campione 100ng/1µl di DNA genomico
1
2
3
Controllo
• Preparare la Mix di reazione il cui volume finale dipendera’ dal numero dei
campioni e dal volume di reazione di ogni campione. Nel nostro esempio, il volume di
reazione sara’ di 20 µl /campione, il numero dei campioni e’ quattro, quindi il volume
della mix sara’ di 80.
Primer F………………..
Primer R……………….
Buffer 10 X…………….
dNTPS………………….
Taq……………………..
H2 O…………………….
MIX
1
1
10
1
1
86
100
• Dispensare 20µl di Mix in ciascun tubo ri reazione
• Impostare i parametri di temperatura, durata e numero dei
cicli :
Denaturazione iniziale 95°C per 5’
Denaturazione 95°C per 1’
Annealing
55°C per 1’
Extension
68°C per 1’
Extension finale 68°C per 10 ‘
Hold
4°C
• Caricare i campioni e avviare il ciclizzatore
per 30
CONTROLLO DEL PRODOTTO DI PCR: ELETTROFORESI SU
GEL DI AGAROSO
PRINCIPI GENERALI
• Una molecola provvista di una carica netta ,in opportune condizioni, si
muove quando immessa in un campo elettrico
• Il fenomeno e’ chiamato elettroforesi e puo’ essere sfruttato per separare un
qualsiasi tipo di molecola carica all’interno di una miscela complessa
• La velocita’ di migrazione della molecola immessa nel campo elettrico e’ espressa
dalla formula: v= Ez/f con E = alla differenza di potenziale del campo elettrico, z=
alla carica netta della molecola ed f= al coefficiente di attrito o frizionale
• In particolare il coefficiente frizionale f= 6πηr dove 6πr rappresenta il raggio di
ingombro della molecola ed η il coefficiente di viscosita’ del mezzo. Questo significa
che molecole con dimensione diversa a parita’ di carica elettrica ( intensita’ e
segno) migreranno con velocita’ differenti nella stessa direzione
•La condizione di parita’ di carica elettrica in realta’ non puo’ essere
realizzata in un sistema elettroforetico che operi su molecole della stessa
natura (Dna) ma di dimensioni differenti. Infatti molecole piu’ grandi
avrebbero una carica netta maggiore ma la maggiore velocita’ di migrazione
dovuta a tale densita’ di carica sarebbe contrastata dal maggiore coefficiente
frizionale dovuto alle maggiori dimensioni con annullamento del fenomeno
della migrazione. Lo stesso vale per le molecole piu’ piccole e con minore
coefficiente frizionale, che avrebbero pero’ una carica netta minore.
• Per separare quindi molecole con lo stesso tipo di carica ma con differente
dimensione occorre utilizzare uno specifico supporto costituito da un gel
piuttosto che una soluzione libera. Il gel si comporta come un setaccio molecolare
annullando le differenze di velocita’ dovute alle differenze di densita’ elettrica e
separando le molecole solo in virtu’ della loro dimensione relativa
• Le molecole con dimensioni inferiori ai pori del gel migreranno quindi piu’
velocemente, quelle con dimensioni maggiori piu’ lentamente e quelle con
dimensioni intermedie con velocita’ intermedie e apprezzabilmente differenti. Su
questo principio di selettivita’ poggia la separazione dei frammenti di PCR
mediante elettroforesi su gel di agarosio
• La natura chimica del gel e la sua concentrazione relativa , che possono essere
opportunamente scelte, determineranno sia l’ampiezza dei pori sia la loro
deformabilita’ permettendo quindi di separare con ottima risoluzione molecole
di dimensioni anche molto simili.
• Normalmente un gel di agaroso al 2-2,5% riesce a separare in modo
apprezzabile molecole con dimensioni comprese tra 2500 e 50 bps. Tale tipo di
gel si presta bene all’analisi dei frammenti di PCR. Per risoluzioni maggiori si
possono utilizzare gel differenti (acrilammide) con opportune variazioni nelle
condizioni di preparazione e corsa del campione.
• Tecniche elettroforetiche particolari sono disponibili per la separazione e
l’analisi di frammenti di DNA particolari come la PFGE per la separazione
dei cromosomi artificiali di Lievito o l’elettroforesi capillare per l’analisi dei
frammenti di sequenza e dei marcatori microsatellitari
PREPARAZIONE DEL GEL DI AGAROSIO
• Pesare la quantita’ di polvere di agarosio ncessaria
• Disciogliere la polvere in un opportuno volume di
tampone elettroforetico TAE (0,4 M Tris-acetato 2mM
EDTA pH 8)
• Portare a ebollizione in forno a microonde
• Assemblare lo stampo per la solidificazione del gel (gel
Tray) e posizionare il pettine (comb) necessario alla
formazione dei pozzetti di caricamento
• Dopo avere fatto raffreddare il gel (50-60°C), aggiungere
1 µl di Soluzione madre di Bromuro di Etidio e versare
nello stampo
• Dopo raffreddamento (1 ora) il pettine viene rimosso
delicatamente ed il gel e’ pronto per il caricamento dei
campioni
•Preparare i campioni aggiungendo a 10 µl di PCR 5 µl di
Sample Buffer 2X costitutito da 0.2% Blue di Bromofenolo,
0,1% Xylene Cyanol, 0,2mM EDTA e 50 % glicerolo in
acqua
• Riempire a meta’ la camera di migrazione con tampone
elettroforetico e adagiare il gel nell’apposito supporto.
Completare il riempimento della camera fino a ricoprire di
tampone la superficie del gel
•Caricare i campioni nei pozzetti direttamente sotto la
superficie del tampone; (Il colorante presente nel campione
facilita questa operazione, mentre il glicerolo aumentandone
la densita’ ne impedisce la fuoriuscita)
• Connettere la camera al sistema di alimentazione e avviare
la corsa. (90V, 50mA) Bloccare la migrazione quando il bleu
di bromofenolo (scuro) e quello di cyanolo (chiaro) si sono
nettamente separati
Visualizzare le bande di migrazione colorate con EtBr sotto raggi UV
PRINCIPALI PROBLEMI DELLA PCR
1) PRESENZA DI CONTAMINAZIONE
1) Eseguire un esperimento pilota utilizzando
un solo campione, e 5 Mix differenti
ciascuna contenente tutti i reattivi utilizzati
nel primo esperimento e cambiando un
solo componente ( primers, buffer etc)
2)Pulire accuratamente tutte le superfici di lavoro
con NaOH , usare sempre materiale autoclavato e
puntali con filtro anti contaminazione
2) Presenza di prodotti aspecifici piu’ lunghi del prodotto desiderato
Ridurre il tempo di annealing
Aumentare la temperatura di annealing
Ridurre il tempo di estensione
Ridurre la quantita’ di primers
Ridurre la quantita’ di Dna
Ridurre la quantita’ di Taq
Cambio della coppia di primers
Aspecifico Alto
Specifico
3) Presenza di prodotti aspecifici piu’ corti del prodotto desiderato
Aumentare il tempo di annealing
Aumentare la temperatura di annealing
Aumentare il tempo di estensione
Ridurre la quantita’ di primers
Ridurre la quantita’ di Dna
Ridurre la quantita’ di Taq
Cambio della coppia di primers
Specifico
Aspecifico basso
4) Assenza di amplificato
Ricontrollare tutti i reattivi
Riquantizzare il Dna
Cambiare la miscela di dNTPs molto sensibile ai cicli
di congelamento e scongelamento
Ridurre di 4-6°C la temperatura di annealing
Risintetizzare i Primers
4) Prodotto specifico ma in quantita’ ridotta
Aumentare la quantita’ dei primers
Aumentare la quantita’ della Taq
Aumentare la quantita’ di Dna
Ridurre gradualmente la temperatura di annealing
Utilizzare DMSO o glicerolo
Real time PCR
La PCR in tempo reale è una implementazione della PCR che permette di avere
informazioni quantitative più precise sulle concentrazioni relative di cDNA
amplificati e dei loro mRNA corrispondenti.
Il modo più facile per identificare, al suo primo apparire, un prodotto di PCR è quello
di monitorare di continuo l’andamento della reazione, senza dover interrompere la
reazione per poterla visualizzare su gel. La real time PCR risolve questo problema
utilizzando precursori fluorescenti, come il SYBR Green, che vengono incorporati nel
prodotto in formazione o che si intercalano alla doppia elica, man mano che si forma.
In ogni caso sarà possibile monitorare in tempo reale la formazione del prodotto di
amplificazione seguendone l’assorbimento con un sistema spettrofotometrico, in un
sistema automatizzato che provvede anche alla routine della PCR.
AMOUNT OF DNA
1
2
4
8
16
32
64
128
256
512
1,024
2,048
4,096
8,192
16,384
32,768
65,536
131,072
262,144
524,288
1,048,576
2,097,152
4,194,304
8,388,608
16,777,216
33,554,432
67,108,864
134,217,728
268,435,456
536,870,912
1,073,741,824
1,400,000,000
1,500,000,000
1,550,000,000
1,580,000,000
Curve di accumulo teoriche
Nel corso di un’amplificazione per PCR il numero dei
prodotti aumenta esponenzialmente ad ogni ciclo, per
poi arrivare a plataux dopo circa 30 cicli. Se riportiamo
In un grafico l’accumulo dei prodotti di PCR, in scala
aritmetica, non riusciamo ad evidenziare alcuna amplificazione durante i primi 20-25 cicli, mentre riusciamo
Ad apprezzare bene la parte della curva che da 25 a 30
cicli appare lineare
1600000000
1400000000
AMOUNT OF DNA
CYCLE NUMBER
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
1200000000
1000000000
800000000
600000000
400000000
200000000
0
0
5
10
15
20
25
PCR CYCLE NUMBER
30
35
NIN7 protein localisation, transient expression
Arabidopsis Protoplast
35S::NIN7-GFP
attB1
B
cN
IN
pMDC 83
7
attB2
5S
2X3
Hy
gro
R
GFP6
KanaR
RB
Pictures:
Lionel Gissot
NIN7-GFP is localised in the nucleus but excluded of the nucleole
and agregates in speckle-like structures. It is consistent with the
putative role of NIN7 as a transcription regulator.